Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético
18 de enero de 2019
Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.
Este es un método para aplicar estimulación electromecánica en las células. Tiene múltiples aplicaciones para estudiar sus efectos en una población celular, pre-entrenamiento para el parto in vivo, y la maduración celular. La ventaja es que los estímulos eléctricos y mecánicos se pueden aplicar con el mismo dispositivo de forma individual o simultánea, manteniendo intacto el viral estéril.
Esta técnica es un enfoque indirecto de nuestra terapia. La terapia celular se considera células electromecánicamente estimuladas puede ser una población celular interesante para tratar el intro-miocardio. Este método generalmente pertenece al campo cardiovascular, pero también podría aplicarse al sistema nervioso.
Esta es una técnica fácil que requiere paciencia. La parte más difícil será trabajar con las piezas pequeñas, y mantener la esterilidad en todo. Hay pequeños detalles de manipulación que son difíciles de explicar, por lo que la demostración visual es realmente útil.
Comience transfiriendo 12 construccionesmpitempirosmpis limpias a placas estériles de 10 centímetros. Para asegurar la esterilización completa, exponga las placas a la luz UV durante cinco minutos. Luego transfiera cada construcción a una placa de cultivo celular separada de 35 milímetros, o placas de 6 pozos para la siembra inmediata de células.
Para iniciar la siembra celular, primero lave un matraz T75 confluente de ATDPS cardíacos con cinco mililitros de 1x PBS. Para separar las células, agregue un mililitro de 0.05%trypsin-EDTA. Y incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, agregue cinco mililitros de medio completo para inactivar la trippsina-EDTA. Recoger todas las células separadas en un tubo de 15 mililitros. Lave el vaso celular dos veces con cinco mililitros de PBS para recoger las células restantes, y agréguelas al tubo de 15 mililitros.
Centrifugar a 230 g durante cinco minutos a 22 grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en dos mililitros de medio completo, y contarlas con el hemociclo. Siembra 200 microlitros de ATDPC cardíacos en cada placa con las construcciones PDMS para obtener alrededor del 80% de la superficie de siembra cubierta por las células al día siguiente.
Incubar a 37 grados centígrados y 5%CO2. Agregue suavemente 2 mililitros de medio completo precalentó por placa. Incubar las células con las construcciones a 37 grados centígrados, y 5%CO2 durante la noche.
Antes de iniciar este procedimiento, asigne seis de las 12 construcciones para la estimulación electromecánica y conserve seis para controles no estimulados. Utilice 70%etanol para limpiar la unidad de estimulación. Coloque la unidad de estimulación, los electrodos estériles y las pinzas dentro del gabinete de flujo.
Con el fin de manipular fácilmente los electrodos y construcciones, retire el 90% del medio de cada placa de cultivo celular. Coloque las construcciones PDMS en la posición correcta hacia el imán para asegurar la atracción magnética entre imanes fijos y móviles. Estos dos pasos anteriores en los que se manipulan las construcciones PDMS semillas de la célula y los electrodos, manteniendo la esterilidad durante todo el proceso son los más críticos.
A continuación, conecte el cable de platino a los conectores de electrodos. Oriente la parte ptFE de los electrodos en sus espacios designados en las construcciones PDMS. Añadir 2,5 mililitros de medio completo fresco y precalentó a cada construcción.
Una vez que todas las construcciones de PDMS estén colocadas y conectadas eléctricamente a la plataforma, vuelva a colocar la plataforma en los 37 grados Centígrados y en la incubadora de 5%CO2. A continuación, conecte la fuente eléctrica y mecánica. Para configurar el programa de estimulación, especifique los regímenes de estimulación eléctrica y mecánica a través de las interfaces de usuario del estimulador eléctrico y la aplicación, que controla la estimulación mecánica.
Para ajustar el sincronismo, encienda el estimulador eléctrico y espere a que aparezca el menú principal en la pantalla. A continuación, seleccione la opción dos, edite la secuencia, más Intro. Para editar el menú de secuencia, utilice la pestaña de modo para seleccionar current"haciendo clic en plus" y pulsando Intro"Para el período, seleccione 1000"con más/menos y pulse Intro"Y para la pestaña del modo de disparo, seleccione externo por software y pulse Intro"Para la pestaña de amplitud, seleccione 1" con más/menos y pulse Intro"Entonces, de nuevo en el menú principal, seleccione la opción 4, y luego genere la secuencia, y presione Entrar"En la sección de estimulación mecánica del panel de aplicación de control, primero escriba 1000"en el control de texto más.
A continuación, escriba 500 "en el control de texto de tiempo ON, para establecer la duración del pulso mecánico. Por último, escriba 2000"en el control de texto de la excursión para ofrecer un 10% de alargamiento de construcción. Cambie el medio celular dos veces por semana, primero quitando los medios antiguos y, a continuación, agregando medios cálidos y frescos en los lados de la compatibilidad con PDMS.
En el día siete, al final del experimento, recoja las muestras como se describe en el manuscrito. Los ATDPC cardíacos estimulados electromecánicamente mejoraron su potencial cardiomiogénico. Esto fue indicado por PCR en tiempo real que muestra una mayor expresión de genes cardíacos tempranos y tardíos específicamente el factor de transcripción cardíaca GATA-4, el marcador estructural beta-miosina cadena pesada, y el gen relacionado con el calcio Connexin43.
La tinción de faloideína contra las fibras de actina mostró que la mayoría de las células se alinearon de acuerdo con el patrón vertical. La distribución de Connexin43 fue principalmente en el citoplasma, y en la membrana plasmática, contribuyendo a la comunicación intracelular a través de uniones de brecha. Los factores de transcripción MEF2 y GATA-4 se localizaron en los núcleos de los ATDPC cardíacos.
Pero GATA-4 no se detectó en los ATDC subcutáneos. Los marcadores citoplasmáticos SERCA2, y la alfa-actinina sarcomérica, no mostraron una organización de sarcomere maduro típico de los cardiomiocitos. Y la paliza no se observó en el control y estimuló las poblaciones celulares.
Una monocapa de células sanas al principio de este protocolo y mantener la esterilidad durante todo el procedimiento son cruciales. Después de la recolección de muestras, se pueden realizar las técnicas estándar de expresión de proteínas del genoma. Esta técnica ayuda a entender mejor el efecto de los estímulos eléctricos y/o mecánicos celulares.
Hasta hace poco, era imposible utilizar el mismo dispositivo para ambas estimulaciones, lo que hacía que los resultados fueran más difíciles de comparar.
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Resumen
Este artículo presenta un método para aplicar estimulación electromecánica a células, mejorando su potencial cardiomiogénico. Esta técnica tiene aplicaciones en terapia celular, modelado de enfermedades y cribado de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación cardiovascular
- Terapia celular
- Aplicaciones en neurociencia
Antecedentes
- La estimulación electromecánica puede mejorar la maduración celular.
- Este método permite la aplicación simultánea de estímulos eléctricos y mecánicos.
- La técnica mantiene condiciones estériles para la integridad viral.
- Es relevante tanto para estudios del sistema cardíaco como del sistema nervioso.
Objetivo del estudio
- Mejorar el potencial cardiomiogénico de poblaciones celulares.
- Explorar los efectos de la estimulación electromecánica sobre las células.
- Proporcionar un método de preentrenamiento para la administración in vivo.
Métodos Utilizados
- Aplicación de estímulos eléctricos
- Aplicación de estímulos mecánicos
- Técnicas de estimulación simultánea
- Mantenimiento de condiciones estériles
Resultados principales
- Mayor maduración de las células tratadas.
- Potencial para aplicaciones efectivas de terapia celular.
- Versatilidad en la aplicación en diferentes campos.
- Indicaciones para investigaciones futuras en modelado de enfermedades.
Conclusiones
- La estimulación electromecánica es una estrategia prometedora para la terapia celular.
- Este método podría conducir a avances en la selección de fármacos.
- Se necesitan estudios adicionales para explorar su potencial completo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La estimulación electromecánica aborda una limitación clave en la terapia celular cardíaca: el fenotipo inmaduro de los cardiomiocitos derivados de células madre. Al recapitular las señales eléctricas y mecánicas fisiológicas, este método potencia el potencial cardiomiogénico, mejorando la confiabilidad predictiva en modelos preclínicos. Esto facilita la reducción de riesgos en terapias basadas en células y en plataformas de modelado de enfermedades antes de los estudios habilitantes para el IND.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el compromiso de la línea cardíaca mediante la sobreexpresión de genes tempranos (GATA-4), estructurales (cadena pesada de miosina beta) y reguladores del calcio (Connexina43).
- Valor operativo: Proporciona una plataforma estandarizada de estímulo para comparar los efectos del acondicionamiento eléctrico, mecánico o combinado sobre poblaciones celulares.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera células acondicionadas eléctrica y mecánicamente con fibras de actina alineadas y conexina 43 localizada en la membrana, lo que favorece la preparación para ensayos funcionales.
- Valor operativo: Permite el acondicionamiento consistente de lotes celulares para obtener perfiles reproducibles de respuesta a fármacos en formatos de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Une los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al madurar células hacia un fenotipo similar al adulto, reduciendo la ambigüedad mecanicista en estudios de injerto.
- Valor operativo: Facilita la producción a escala de poblaciones celulares estimuladas para ensayos de respuesta a la dosis y cribado de toxicidad en modelos de enfermedades cardiovasculares.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la generación de células diferenciadas tras la expansión de progenitores y antes de la validación funcional o de las pruebas con compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa la hipótesis de que las señales biofísicas impulsan la diferenciación cardiomiogénica, apoyando la validación de objetivos mediante la expresión de marcadores.
- Cribado: Genera células preacondicionadas mediante estimulación con acoplamiento estructural y eléctrico mejorado, aumentando la sensibilidad del ensayo frente a compuestos cardiotrópicos.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas de PCR y de imágenes (por ejemplo, expresión génica, alineación de actina, distribución de uniones comunicantes) para permitir comparaciones objetivas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Impulsa a las células desde un estado progenitor hacia un fenotipo cardíaco más maduro, favoreciendo la continuidad preclínica en la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de estimulación es reutilizable en distintas líneas celulares y regímenes de estímulo, promoviendo la estandarización entre equipos de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la especificación de la línea cardíaca mediante lecturas multiparamétricas de maduración.
- Valor operativo: La estimulación eléctrica y mecánica simultánea y estéril reduce la variabilidad y la manipulación manual.
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción del desarrollo al reducir la incertidumbre mecanicista en los mecanismos de acción de las terapias celulares.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos celulares según su potencial de maduración en respuesta a la estimulación.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en cultivo celular, técnica estéril y manejo de dispositivos de estimulación.
- Acceso a estimuladores eléctricos y mecánicos con software de control sincronizado.
- Protocolos estandarizados para la siembra de constructos, cambio de medio y configuración de parámetros de estímulo.
- Consideraciones de adaptación para diferentes tipos celulares, materiales de matriz y formas de onda de estimulación.
- Limitación: la maduración se evaluó mediante la expresión de marcadores; métricas funcionales como la contractilidad no se observaron en este estudio.
