Name: Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprende a detectar proteasas mediante zimografía de péptidos fluorescentes con diseño modular adaptable. Esta técnica mejora la detección de proteasas en biomateriales para aplicaciones de liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

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Fondos provistos por el estado Universidad Facultad de ingeniería de la Ohio, Departamento de ingeniería biomédica y el centro integral del cáncer - Hospital de cáncer Arthur G. James y Richard J. Solove Research Institute.

1. preparación de la capa de Gel de resolución
<ol><li>Preparar una 10% de poliacrilamida resolver solución gel según la tabla 1. Añadir el Tetramethylethylenediamine (TEMED) y persulfato de amonio (APS) inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.</li>
	<li>Llene un casete de gel mini vacío 1,5 mm a mitad de camino (5 mL) con la solución 10% de gel de resolución.</li>
	<li>Añadir una capa delgada de isopropanol (~ 500 μl) a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min).</li>
</ol>2. preparación de la molécula de vinculador de Azido-PEG3-maleimida
<ol><li>Mientras que la primera capa de gel de resolución es polimerización, recuperar el azido-PEG3-maleimida kit de almacenamiento-20 ° C y deje que los componentes alcancen la temperatura ambiente. Hay dos componentes en cada kit. Frasco 1 contiene un éster de maleimida-NHS, un grisáceo a gris sólido. Frasco 2 contiene azido-PEG3-amina, un aceite ligeramente amarillo. Nota: Los autores sugieren con el kit de azido-PEG3-maleimida 25 mg como sólo puede ser almacenado por periodos cortos de tiempo (1-2 horas) a-20 ° C después de ser preparado antes de que empiece a degradarse. 25 mg es suficiente para producir 10 geles de péptido. Usar geles dentro de 3 semanas de preparación.</li>
	<li>Disolver los componentes de la ampolla 2 el fabricante recomendada volumen de dimetilsulfóxido (DMSO) y vortex por 30 s para los líquidos se han mezclado bien.</li>
	<li>Transferir el contenido de 1 frasco en un matraz de fondo redondo de 100 mL limpio y seco que contiene una barra de agitación. Nota: Enjuague el frasco con acetona y secar completamente antes de usarlos para evitar que la humedad interfiere con la reacción.</li>
	<li>Inmediatamente Inserte un tapón de septum de goma con un diafragma que se puede pinchar con una jeringa en la boca del matraz. Trabajar rápidamente para evitar que la humedad penetre en el matraz.</li>
	<li>Insertar dos 18 agujas de jeringa en el diafragma y conectar uno a un tanque de gas inerte (e.g. gas de argón). Que el gas inerte para llenar el matraz por 3 minutos mezcla los componentes de los frascos 1 y 2 bajo gas inerte para evitar que los productos de reacción indeseable. PRECAUCIÓN: La segunda aguja de la jeringa es proporcionar una ventilación, lo que permite que el aire atmosférico contenido en el matraz a salir del frasco como llena con gas inerte. ¡No se olvide de incluir una aguja de ventilación!</li>
	<li>Apague el gas inerte y separar de la aguja. Utilizando una jeringa, inyectar el contenido completo del Vial 2 al matraz.</li>
	<li>Saque las agujas y jeringas y los componentes de la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente mientras que revuelve.</li>
	<li>Quite el tapón de septum goma y transferir el contenido a un tubo de centrífuga limpio 5 mL. La solución de azido-PEG3-maleimida debe utilizarse dentro de 1 hora a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. preparación del péptido capa del Gel de resolución
<ol><li>Una vez que la primera capa de gel de resolución ha polimerizado, retirar la capa de isopropanol. Enjuague la parte superior del gel por Pipetear 1 mL de agua desionizada en la parte superior del gel y luego Vierta el agua.</li>
	<li>Recuperar el péptido fluorescente funcionalizados tiol de almacenamiento de-80 ° C y deje que se descongele a temperatura ambiente. Nota: El péptido funcionalizados tiol puede ser preparado como se describió anteriormente11,12. Péptidos disponibles en el mercado también se pueden utilizar pero requieren la adición de un residuo de cisteína terminales para permitir la maleimida-tiol, haga clic en la reacción. Disolver el péptido a una concentración stock de 10 mM y almacenar a-80 ° C en pequeñas alícuotas (30 uL) para limitar los ciclos repetidos de congelación y descongelación.</li>
	<li>Preparar un 10% solución solución gel que contiene la molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador y el péptido fluorescente según tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.</li>
	<li>Llene la mitad de la porción restante del cartucho (3 mL) de gel con el péptido resolver la solución en gel. Nota: Un enfoque multi-capa de gel resolución reduce la cantidad de péptido y enlazador necesario para cada gel. El tamaño de la capa de gel de resolución péptido puede ajustarse para acomodar una gama más amplia de pesos moleculares según sea necesario.</li>
	<li>Pipetear una fina capa de isopropanol (~ 500 μl) en la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel nivel y evitar burbujas. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (40 min). Nota: El péptido fluorescente es sensible a la luz. Mantenga el gel cubierto con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo durante el desarrollo, electroforesis, lavado y preparación del gel.</li>
	<li>Retirar la capa de isopropanol y enjuague la parte superior del péptido solución de gel con agua desionizada como en el paso 3.1.</li>
	<li>Si utilizar los geles inmediatamente, vaya al paso 4, de lo contrario, sumergir los geles preparados en 100 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C en una caja de plástico para evitar que el gel se seque. Envuelva la caja en papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo. Los geles pueden almacenarse en PBS durante 3 semanas antes de uso.</li>
</ol>4. preparación del Gel de apilamiento
<ol><li>Preparar una solución de gel de apilamiento 5% según la tabla 1. Agregar el TEMED y el APS inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización.</li>
	<li>Llene la porción restante del vacíela de la cassette de gel (2 mL) con la solución de gel de apilamiento.</li>
	<li>Insertar rápidamente un peine del gel de 1,5 mm en la capa de gel de apilamiento, asegurándose de que no hay burbujas permanecen atrapadas debajo de los pozos. Utilizar la solución de poliacrilamida sobra para seguir el progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida en el tubo se ha solidificado completamente, la reacción es completa (~ 10 min).</li>
	<li>Suavemente Retire el peine y la cinta de la parte posterior de los cassettes de gel.</li>
</ol>5. preparación de muestras biológicas para electroforesis
<ol><li>Preparar los medios condicionados de la célula, lysates de la célula, homogenados de tejido y estándares MMP como se describe en otros lugares bajo condiciones no reductoras2. No calentar las muestras.</li>
	<li>Por ejemplo, preparar los medios condicionados de la célula como sigue:<ol>
<li>Células en una placa de 6 pozos en 10% suero bovino fetal (FBS) medios de cultivo en placa 40.000 células/cm2 . Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO2 a 37 ° C) durante 24 horas y que puedan llegar a 70-80% de confluencia. Nota: Si las células han alcanzado la confluencia deseada después de 24 horas, permite que crezcan en medios de cultivo 10% FBS por 24 horas.</li>
		<li>Lavan las células dos veces con PBS y añadir 2 mL de medio de cultivo libre de suero. Incubar las células en una cámara humidificada (5% CO2 a 37 ° C) por 24 horas.</li>
		<li>Con una pipeta serológica, recoger los medios condicionados de cada pozo. Los medios de comunicación a 1200 rpm durante 3 minutos eliminar cualquier residuo de células de la centrífuga. Tomar el sobrenadante y se concentran con un 15 mL, unidad de corte de filtro centrífugo de peso molecular de 10 kDa. Centrifugue las unidades de filtro a 4.000 x g durante 15 min en un rotor que hace pivotar del cubo o 5.000 x g durante 15 min en un rotor de ángulo fijo. Nota: Este paso es opcional pero puede mejorar la intensidad de las bandas proteolíticas en los geles de zymography péptido.</li>
		<li>Transfiera el concentrado filtrado a un tubo de centrífuga 1.5ml fresco. Alícuota y almacenar las muestras a-80 ° C durante un máximo de tres ciclos de congelación y descongelación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar el contenido de la proteína usando un análisis de cuantificación de proteína estándar (por ejemplo, BCA, ensayo de Bradford, etc.).</li>
</ol>6. electroforesis de biológico muestras en péptido Zymography geles
<ol><li>Disolver las muestras en solución tampón de muestras convencionales zymography (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, glicerol al 25%, 4% SDS, 0.01% azul de bromofenol). Para las muestras de células y tejidos, se recomienda 30 μg de proteínas totales por pozo y 50-100 ng de proteína para los estándares MMP.</li>
	<li>Añadir 400 mL de 1 x Tris glicina SDS ejecuta Buffer en el aparato del gel. Carga hasta 35 μl de muestra por pozo. Ejecutar las muestras de 120 V a 4 ° C por 1.5 horas o hasta que los estándares de peso molecular indican que las proteasas de interés disponibles dentro el péptido resolver capa de gel (que tiene un color naranja visible). Nota: La mayoría de MMPs y sus variantes caen dentro del rango de 35-100 kDa. Cuando los estándares de peso molecular indican que los pesos son en el péptido resolver capa del gel, se puede detener la electroforesis. El mismo principio puede aplicarse a otras clases de proteasas con pesos moleculares conocidos. Si hay un interés en la detección de varias proteasas sobre una gama más amplia de pesos moleculares, reducir el tamaño de la capa de gel de resolución y aumentar el tamaño de la capa de gel de resolución de péptido.</li>
	<li>Tras la electroforesis, los geles Retire el cartucho de plástico y lavar geles tres veces por 10 min a temperatura ambiente en agitación suave en renaturing buffer que contiene 2,5% Tritón X-100, 1 μm vivencias2y 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
	<li>Transferencia de geles para desarrollar solución amortiguadora que contiene 1% Tritón X-100, 1 μm vivencias2 y 5 mM CaCl2 en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, para reemplazar a 15 minutos con el desarrollo de la nueva solución tampón e incubar geles a 37 ° C en agitación suave durante 24 horas , asegurándose de que los geles son completamente sumergidos en la solución.</li>
</ol>7. proyección de imagen del péptido Zymography geles
<ol><li>Después de 24 horas, geles de imagen usando un fluorescente gel escáner/imager usando los filtros de excitación y de emisión adecuados. Por ejemplo, los geles de péptido se muestra en los resultados representativos son conjugados con fluoresceína y se reflejada utilizando un filtro de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 521 nm. Usar los filtros adecuados para el fluoróforo maximiza la detección de actividad proteolítica. Nota: Imágenes también pueden ser tomadas con un formador de gel equipado con un transiluminador UV, a menudo utilizado para la proyección de imagen de geles de ADN teñidas con bromuro de etidio. Imagen de los geles con el transiluminador UV (365 nm) ajuste y un filtro de emisión de 590 nm.</li>
	<li>Realizar evaluación densitométrica de las intensidades de la banda con ImageJ como se describe en otra parte13.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
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<li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).</li>
<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Zymographic las técnicas actuales se basan en la incorporación de sustratos nativos en geles de poliacrilamida para la detección de la proteólisis. Mientras que estas técnicas han ganado uso extenso, todavía están limitados en el número de proteasas que pueden detectar. Aquí, un protocolo fue descrito en que péptidos fluorescentes, proteasa degradable se incorporan a la solución de gel de poliacrilamida. Covalente acoplamiento usando una molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador permite la separación y la detección de ...

Zymography gel es una técnica biológica utilizada para medir la actividad proteolítica en las muestras biológicas, tales como fluidos corporales o células medios de cultivo1,2,3. Las muestras son separadas por sus pesos moleculares con electroforesis a través de un gel de poliacrilamida con un sustrato degradable. Los sustratos degradables comunes incluyen gelatina, caseína, colágeno y elastina, que se han utilizado para medir la actividad de metaloproteinasas de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 y -11, además de una variedad de catepsinas1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. después de la electroforesis, las enzimas son renatured y permitido degradar la proteína en el gel. En zymography tradicional gel, el gel se tiñe con un tinte de proteína, como el azul de Coomassie, y actividad de la proteasa se detecta como una pérdida de señal, bandas (degradación de la proteína) es decir, blanco sobre un fondo azul oscuro.
Aquí, describimos un protocolo para un método alternativo de zymography gel, en el que el sustrato degradable es un cortocircuito, péptido fluorógenos incorporada covalentemente en el gel de poliacrilamida (figura 1). La sustitución de péptidos sintéticos como el sustrato degradable permite la detección de una gama más amplia de las proteasas en comparación con el gel tradicional zymography con proteínas nativas9. Enlace covalente del péptido fluorógenos previene péptido difusión y migración durante la electroforesis en gel con anteriores métodos9,10. Además, el uso de un sustrato fluorógenos permite la detección directa de la actividad de las proteasas sin coloración adicional y pasos de tinción. El objetivo general de este método es la detección de actividad de la proteasa en muestras biológicas mediante la incorporación covalente de péptidos fluorógenos en geles de zymogram.

<table><tbody><tr><td>Casetes de gel vacíos de 1,5 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>Peines de casete de gel vacíos de 1,5 mm, 10 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS Solución</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x tampón de muestra de zimografía</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (p/v) de acrilamida/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td> Click <td>Chemistry Herramientas</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Fuente de alimentación básica</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Estándar de doble color</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Agujas hipodérmicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de goma de tabique</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril de punta deslizante (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Generador de imágenes moleculares</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de zinc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

detección de actividad de la proteasa por zymography péptido fluorescente

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

El propósito de este método es medir la actividad proteolítica de muestras biológicas complejas. Las muestras están separadas por peso molecular mediante electroforesis a través de un gel de resolución con un sustrato degradable. Este método difiere zymography gel tradicional un péptido fluorógenos apagado se incorpora covalentemente en el gel de resolución en lugar de proteínas completas, como gelatina o caseína. Uso de los péptidos fluorógenos permite la detección directa de actividad proteolítica sin pasos adicionales de tinción. Las enzimas dentro de las muestras biológicas hienden el péptido fluorógenos apagado, dando por resultado un aumento en fluorescencia. La señal fluorescente en los geles es entonces reflejada con un escáner estándar gel fluorescente y cuantifica mediante densitometría. El uso de péptidos como el substrato degradable expande considerablemente las proteasas posible detectables con técnicas de zymographic.

Empleando el método descrito aquí, se incorporaron dos péptidos proteasa degradable fluorescentes en geles de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW en todo el texto y figuras) y GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW en todo el texto y figuras). ↓ indica el sitio de la hendidura. QGIW es un colágeno-derivé secuencia diseñada para detectar colagenasas celular14. LACW es una secuencia que se ha optimizado par...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Las técnicas cográficas actuales detectan un número limitado de proteasas. La zymografía péptido fluorescente utiliza péptidos fluorescentes como sustrato degradable que permite medir una mayor gama de proteasas. La principal ventaja de este método es su diseño modular.La secuencia del péptido fluorescente determina qué proteasas se detectan y el péptido fluorescente se puede intercambiar fácilmente con un péptido de una secuencia diferente, una capacidad para detectar otras proteasas. Esta técnica puede ayudar a informar el diseño del uso de péptidos como enlaces cruzados degradables en biomateriales de ingeniería como los utilizados para la administración de fármacos o aplicaciones de ingeniería de tejidos. La incorporación de este péptido en esta técnica puede identificar proteasas secretadas en tejido que son responsables de la degradación de los biomateriales.La demostración de esta técnica es importante para visualizar el enfoque multicapa que es único en comparación con otras técnicas de zymography. Demostrando esta técnica será, Ameya Deshmukh, una estudiante graduada de mi laboratorio. Para empezar, prepare una solución de gel de resolución de poliacrilamida al 10% como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.Inmediatamente antes de verter el gel, agregue el TEMED y apS. A continuación, llene y vacíe el cassette mini gel de 1,5 milímetros a mitad de camino con la solución de gel de resolución. Añade una fina capa de isopropanol a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel de nivel y prevenir las burbujas.Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Cuando la poliacrilamida del tubo se ha solidificado por completo, la reacción se ha completado. Mientras que la primera capa de gel de resolución es polimerizante, recupere el kit Azido-PEG3-Maleimide del almacenamiento a 20 grados Celsius y permita que los componentes alcancen la temperatura ambiente.A continuación, disolver los componentes del vial dos en el volumen recomendado por el fabricante de DMSO. Y vórtice durante 30 segundos para asegurar que los líquidos estén bien mezclados. Transfiera el contenido del vial uno a un matraz inferior redondo de 100 milímetros limpio y seco que contenga una barra de agitación.Inserte inmediatamente un tapón del tabique de goma con un diafragma que se pueda perforar con una jeringa en la boca del matraz. A continuación, inserte dos agujas de jeringa de calibre 18 en el diafragma. Conecte una de las agujas de la jeringa a un tanque de gas inerte y deje que el gas llene el matraz inferior redondo durante tres minutos.A continuación, apague el gas inerte y desébralo de la aguja. Con una jeringa, inyecte el contenido completo del vial dos en el matraz. Retire las dos agujas y la jeringa.Deje que los componentes se mezclen durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras se agita. Después de esto, retire el tapón del tabique de goma y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga limpio de cinco mililitros. Una vez que la primera capa de gel de resolución ha polimerizado verter fuera de la capa de isopropanol.Pipetee un mililitro de agua desimasoñada en la parte superior del gel y luego vierta el agua para enjuagar el gel. Recupere el péptido fluorescente funcionalizado tiol del almacenamiento a 80 grados centígrados. Dejar que se descongele a temperatura ambiente.Preparar una solución de gel de resolución del 10%que contenga la molécula de vinculador Azido-PEG3-Maleimida y el péptido fluorescente como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Inmediatamente antes de verter el gel añadir el TMED y APS. A continuación, llene la mitad de la porción restante del cassette de gel con la solución de gel de resolución de péptidos.Añade una fina capa de isopropanol a la parte superior del gel de poliacrilamida para producir un gel de nivel y prevenir las burbujas. Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Una vez completada la reacción, vierta la capa de isopropanol.Pipetee un mililitro de agua desimasoñada en la parte superior del gel y luego vierta el agua para enjuagar el gel. Si no se utilizan los geles inmediatamente, guárdelos sumergiéndolos en una caja de plástico llena de 100 mililitros de 1x PBS a cuatro grados centígrados. Envuelva la caja en papel de aluminio para evitar el fotoblancada.En primer lugar, prepare una solución de gel de apilamiento del 5%como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Inmediatamente antes de verter el gel añadir el TMED y APS. Llene la porción vacía restante del cassette de gel con la solución de gel de apilamiento.Inserte rápidamente un peine de gel de 1,5 milímetros en la capa de gel de apilamiento asegurándose de que no haya burbujas atrapadas debajo de los pozos. Utilice la solución de poliacrilamida sobrante para realizar un seguimiento del progreso de la reacción de polimerización. Una vez completada la reacción, retire suavemente el peine y la cinta de la parte posterior del cassette de gel.Para empezar, disuelva las muestras en el tampón de muestra de zymography convencional. Añadir 400 mililitros os 1X tris glycene SDS tampón de funcionamiento al aparato de gel. Cargue hasta 35 microlitros de muestra por pozo.Ejecute las muestras a 120 voltios a cuatro grados Celsius durante una hora y media o hasta que los estándares de peso molecular indiquen que las proteasas de interés están dentro de la capa de gel que resolu péptidos. Después de esto, retire los geles del cassette de plástico. Lave los geles tres veces en el tampón de re-naturing a temperatura ambiente bajo agitación suave.Con cada lavado, durando 10 minutos. Transfiera los geles a una solución tampón en desarrollo durante 15 minutos. A continuación, reemplace la solución con un tampón de desarrollo fresco e incubar a 37 grados centígrados bajo agitación suave durante 24 horas.Después de esto, utilice un escáner de gel fluorescente con los filtros de excitación y emisión adecuados para tomar imágenes de los geles. En este estudio a los péptidos degradables de la proteasa fluorescente se incorporan en geles de poliacrilamida. QGIW es una secuencia derivada de colágeno diseñada para detectar colágeno celular, mientras que LACW es una secuencia que ha sido optimizada para la detección de MMP-14 y MMP-11.La imagen fluorescente revela numerosas bandas dentro de los geles de péptidos LACW, mientras que sólo se observa una sola banda en los geles QGIW. En comparación con la zymografía de gelatina, los geles LACW son capaces de detectar más bandas proteolíticas, lo que demuestra la capacidad de la zymografía de péptidos para detectar una gama más amplia de proteasas presentes dentro de muestras biológicas que los métodos tradicionales utilizando sustratos nativos. A continuación, las células de la cmimografía péptido se incuban en el tampón de desarrollo que contiene GM6001, un inhibidor de MMP de amplio espectro, o E64, un inhibidor general de la catepsina.El tratamiento de los geles de péptido LACW con GM6001, disminuye la intensidad de las bandas. Mientras que el tratamiento con E64 no tiene ningún efecto discernible. El tratamiento de los geles de péptidos QGIQ con GM6001 da como resultado una ablación completa de las bandas previamente vistas.Mientras que E64 no tiene ningún efecto. La zymografía de gelatina se lleva a cabo utilizando MMP-9 purificado y activado para comparar la sensibilidad de la zymografía de péptidos con el estándar de oro actual. Los geles LACW son capaces de detectar las concentraciones más pequeñas de MMP-9.Las proteasas requieren condiciones específicas para re-naturaleza y se activan. Prepare cuidadosamente las soluciones de tampón para asegurarse de que la composición y el PH son correctos. Este método se puede complementar con técnicas existentes para verificar la identidad y realizar un análisis posterior de las proteasas medidas.Esto incluye hinchazón occidental, PCR en tiempo real y espectrometría de masas. Tenga cuidado al manipular la poliacrilamida. La solución no polimerizada se considera una potente neurotoxina y siempre se debe usar un equipo de protección personal adecuado al manipularla.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El kit de detección fluorescente de la proteasa se ha diseñado para la medición de la actividad de la proteasa con fluorometría. También es adecuado para la detección de trazas de contaminación de la proteasa. El método se basa en la hydroysis proteolítica de una fórmula propia de un sustrato marcado con FITC caseína.

El uso del kit de la proteasa detección fluorescente para determinar la actividad de la proteasa

Este protocolo describe un ensayo basado en actividades para la detección de metaloproteinasas de la matriz en sobrenadantes de cultivo o los fluidos corporales.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

En este video, realizamos zimografía, una técnica electroforética, para analizar la actividad proteolítica dentro de muestras biológicas.

Zimografía de péptidos fluorescentes: una técnica modificada para detectar la actividad de la proteasa utilizando sustratos fluorogénicos en geles de zimograma

Este video muestra la técnica de electroforesis en gel de zimografía para evaluar la actividad de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) presentes en el sobrenadante de cultivo celular. Las MMP activas degradan el sustrato específico de MMP incrustado en un gel de poliacrilamida, que aparece como bandas transparentes sobre un fondo teñido oscuro después de la tinción.

Electroforesis en gel de zimografía: una técnica electroforética para detectar metaloproteinasas de matriz mediante la evaluación de la actividad enzimática

Este video muestra un ensayo para detectar la actividad proteolítica de las proteasas utilizando péptidos fluorogénicos. La proteasa reconoce su sitio de escisión en el péptido, escindiéndolo y separando el extinguidor del fluoróforo, lo que permite su emisión de fluorescencia. La señal de fluorescencia se detecta y analiza para comprobar la eficiencia de escisión de diferentes variantes de péptidos.

Un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos para detectar la actividad proteolítica de las proteasas

Describimos un ensayo colorimétrico cuantitativo simple que mide específicamente la actividad proteolítica de Granzima B (GzmB) humana, de ratón o de rata. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para determinar la actividad proteasa de otras proteasas de serina en gránulos mediante la hidrólisis de otros sustratos peptídicos sintéticos con una secuencia de reconocimiento adecuada.

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la orientación y topología de las proteínas integrales de membrana en células vivas. Este sencillo protocolo se basa en la sensibilidad selectiva de las quimeras a la proteasa entre la proteína de interés y la GFP.

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Aquí, presentamos el procedimiento detallado de una plataforma de ensayo de proteasa recientemente desarrollado utilizando N-terminal hexahistidine/maltosa-proteína y sustratos recombinantes fusionado a la proteína fluorescentes Unidos a la superficie de níquel nitrilotriacético perlas de agarosa magnética ácido. Un posterior análisis en gel de las muestras de ensayo separados por electroforesis dodecyl del gel del sulfato-poliacrilamida del sodio también se presenta.

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Presentamos un ensayo de clivaje fluorógenos péptido que permite una rápida detección de la actividad proteolítica de las proteasas en péptidos que representan el sitio de clivaje de péptidos de fusión viral. Este método puede utilizarse también en cualquier otro motivo del aminoácido dentro de una secuencia de la proteína para probar la actividad de proteasa.

Un ensayo de escote de péptido fluorógenos para detectar actividad proteolítica: aplicaciones para coronavirus punto de activación de la proteína

Las proteinasas son vitales para la patogénesis bacteriana, lo que permite la invasión y la evasión inmune. La extracción en un solo paso de proteínas citoplasmáticas y de membrana de bacterias en su forma activa es desgarradora. Este artículo en video demuestra la extracción de proteínas celulares completas de Leptospira para el análisis de zimografía para detectar y caracterizar gelatinasas.

Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

Aprende a detectar proteasas mediante zimografía de péptidos fluorescentes con diseño modular adaptable. Esta técnica mejora la detección de proteasas en biomateriales para aplicaciones de liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

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