Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana
15 de febrero de 2019
El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.
Este método ha respondido a una cuestión clave de la biología del desarrollo vegetal. Es decir, ¿cuál es la importancia de la distribución espacial de los estomas? Nuestro sistema de inducción para estomas agrupados utilizando solución de sacarosa es bastante fácil y directamente aplicable a las líneas transgénicas o mutantes de Arabidopsis thaliana.
Para empezar, añade 1,1 gramos de sales medianas De Murashige-Skoog y 15 gramos de sacarosa a un vaso de precipitados. Agregue 490 mililitros de agua destilada al vaso de precipitados y mezcle con la barra de agitación. Utilice hidróxido de potasio para ajustar el pH a 5.8.
A continuación, diluir la solución con 500 mililitros de agua destilada y transferir la solución diluida a una botella mediana. Después de esto, autoclave la solución. Preparar la solución de esterilización de acuerdo con el protocolo de texto.
Luego, trabajando en condiciones asépticas, coloque alrededor de 50 semillas transgénicas de A.thaliana que lleven un marcador fluorescente en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue un mililitro de 70% de etanol al tubo y mezcle invirtiendo el tubo cinco veces. Después de permitir que las semillas se hundan en la parte inferior del tubo, retire suavemente el etanol con una micropipeta.
Añadir un mililitro de solución de esterilización a las semillas e invertir el tubo cinco veces para mezclar. Retire suavemente la solución de esterilización de las semillas con una micropipeta. A continuación, agregue un mililitro de agua estéril.
Añadir 1,5 mililitros de la solución Murashige-Skoog a cada pozo de una placa de 24 pozos. Luego agregue dos semillas esterilizadas a cada pozo. Usando dos capas de parafilm, pegue la tapa en la placa.
A continuación, transfiera la placa a una cámara de crecimiento para incubar durante 14 días. En primer lugar, transfiera 30 microlitros de la solución Murashige-Skoog desde la placa de 24 pozos al centro de un portaobjetos de vidrio. Usando tijeras de disección, retire el cotiledón de una plántula de 14 días de edad.
Flote el cotiledone con el lado de observación mirando hacia arriba en la gota de la solución Murashige-Skoog. Preparar el cotiledonen de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el Diario de experimentos visualizados. Ajuste el espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal.
Por último, utilice la iluminación de campo brillante para seleccionar celdas de protección agrupadas para la observación. En este protocolo, la agrupación en clústeres estomatales fue inducida en plántulas de A.thaliana. Las células de protección agrupadas cultivadas en la sacarosa que contienen medios que tienen cloroplastos más grandes que las células de protección cultivadas en condiciones libres de sacarosa.
El agrandamiento de los cloroplastos se confirmó con un marcador de estroma de cloroplasto y autofluorescentes de clorofila, lo que sugiere que el tratamiento de sacarosa dio lugar a la acumulación de grano de almidón en los cloroplastos. Además, la observación confocal de la bañera-6 de la GFP reveló que los microtúbulos corticales estaban orientados radialmente en las células tratadas con sacarosa, al igual que en las células de protección libres de sacarosa. En realidad descubrimos este método por accidente.
Después del hallazgo, examinamos la respuesta ambiental de los estomas agrupados. Creemos que nuestro sistema podría ayudar a examinar la importancia de la distribución de estomas.
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Descripción general
Este protocolo demuestra cómo inducir estomas agrupados en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana utilizando un medio que contiene azúcar. También describe la observación de estructuras intracelulares como cloroplastos y microtúbulos en células oclusivas mediante microscopía láser confocal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del Desarrollo Vegetal
- Función Estomática
- Técnicas de Microscopía
Antecedentes
- Los estomas desempeñan un papel crucial en el intercambio de gases y la regulación del agua en las plantas.
- La distribución espacial de los estomas afecta la fisiología y el desarrollo de la planta.
- Arabidopsis thaliana es un organismo modelo para el estudio de la biología vegetal.
- La microscopía confocal con láser permite la observación detallada de estructuras celulares.
Objetivo del estudio
- Inducir estomas agrupados en plántulas de Arabidopsis thaliana.
- Investigar las estructuras intracelulares en las células guardas.
- Proporcionar un método aplicable a líneas transgénicas o mutantes.
Métodos Utilizados
- Preparación de un medio con azúcar utilizando sales de Murashige-Skoog y sacarosa.
- Ajuste del pH a 5,8 usando hidróxido de potasio.
- Tratamiento por inmersión de plántulas en el medio preparado.
- Observación de células estomáticas mediante microscopía láser confocal.
Resultados principales
- Inducción exitosa de estomas agrupados en los cotiledones.
- Visualización de cloroplastos y microtúbulos en las células oclusivas.
- Se demostró la aplicabilidad a diversas líneas de Arabidopsis.
- Proporcionó información sobre la distribución espacial de los estomas.
Conclusiones
- El método es efectivo para estudiar el desarrollo estomático.
- Mejora la comprensión de la función estomática en las plantas.
- La investigación futura puede basarse en este protocolo para obtener mayores conocimientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la distribución espacial de los estomas permite informar modelos predictivos de eficiencia en el uso del agua por las plantas y de su capacidad fotosintética, aspectos relevantes para la optimización del rendimiento de cultivos y la resistencia al estrés en la biotecnología agrícola. Este sistema de inducción permite un análisis mecanicista de la biología de las células guardianas sin necesidad de modificaciones genéticas, lo que apoya la validación de dianas en las vías de señalización vegetal. El método proporciona una plataforma escalable y reproducible para evaluar los efectos de compuestos sobre el patrón y la función estomática en procesos de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de patrón espacial en el desarrollo estomático para validar objetivos en las vías de señalización vegetal.
- Valor operativo: Proporciona un sistema no genético, inducible químicamente, aplicable a líneas transgénicas o mutantes para reducir riesgos en objetivos específicos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera resultados fenotípicos cuantificables (estomas agrupados, aumento del tamaño de cloroplastos) para la selección de alto contenido de compuestos bioactivos.
- Valor operativo: Utiliza un medio MS con sacarosa estandarizado y lecturas confocales para garantizar la reproducibilidad del ensayo entre diferentes laboratorios.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la agrupación estomática con biomarcadores intracelulares (tamaño del cloroplasto, orientación de los microtúbulos) para reducir el riesgo mecanicista en estudios de respuesta al estrés en plantas.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento de genes/dianas hasta la validación fenotípica en sistemas relevantes para enfermedades.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la selección fenotípica y la validación del blanco preceden a la identificación del compuesto inicial, particularmente en las líneas de desarrollo de agroquímicos y características vegetales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre la importancia del espaciamiento estomático mediante la inducción de agrupamiento sin alteración genética.
- Selección: Permite sistemas listos para ensayos con fenotipos cuantificables de células oclusivas para la selección de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas mediante microscopía confocal (tamaño de cloroplastos, orientación de microtúbulos) para comparar los efectos de tratamientos.
- Investigación Traducional: Conecta observaciones intracelulares con la función estomática para la elaboración de modelos predictivos en la respuesta al estrés.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de inducción reutilizable aplicable a distintas líneas de Arabidopsis mutantes y transgénicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la reducción del riesgo fenotípico de los mecanismos de patrón estomático.
- Valor operativo: La estandarización mediante medio MS con sacarosa definido y ajuste de pH garantiza la reproducibilidad.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones tempranas de avance o interrupción sobre compuestos que afectan el desarrollo estomático, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en la validación fenotípica en sistemas con estomas agrupados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de tejidos vegetales, técnica estéril y microscopía confocal.
- Depende del acceso a autoclave, cámaras de crecimiento y microscopios de barrido láser.
- Necesita la estandarización de la esterilización de semillas y la preparación del medio con sacarosa entre diferentes equipos.
- La adaptación a otras especies o tipos de tejidos puede requerir la optimización de la concentración de sacarosa y la duración de la exposición.
- Se limita a fenotipos observables en cotiledones; la escalabilidad a ensayos en plantas completas podría necesitar validación adicional.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
