Name: Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Aprende a inducir estomas agrupados en plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento con solución de sacarosa. Este método permite visualizar cloroplastos y microtúbulos en células guarda mediante microscopía confocal.

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Agradecemos a Prof. Seiichiro Hasezawa su amable apoyo de nuestro trabajo. Este trabajo fue financiado por donaciones de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHgrant números 19380 K 17 y 18 H 05492, desde la Fundación de Sumitomo para una subvención para proyectos de investigación de ciencia básica otorgar número 160146 y la Fundación de Canon a T.H. Este sistema experimental fue desarrollado bajo un apoyo financiero desde el número de las páginas JSP KAKENHgrant 26891006 a K. A. Agradecemos a Robbie Lewis, MSc, de Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) para la edición de un proyecto del manuscrito.

1. preparación de medio solución de 3% que contengan sacarosa 1/2 Murashige-Skoog
<ol><li>Añadir 1,1 g de sales medio Murashige-Skoog y 15 g de sacarosa en un vaso.</li>
	<li>Añadir 490 mL de agua destilada y mezclar bien con una barra de agitación.</li>
	<li>Ajustar el pH a 5,8 con KOH.</li>
	<li>Diluir a 500 mL con agua destilada y transferir la solución en una botella mediana.</li>
	<li>Esterilizar la solución por autoclave (121 ° C, 20 min). Si no se utiliza inmediatamente, esta solución puede conservarse a 4 ° C después de la esterilización.</li>
</ol>2. inducción de estomas agrupados por que contengan sacarosa solución medio tratamiento de inmersión
<ol><li>Esterilizar las semillas.<ol>
<li>Preparar la solución de esterilización mediante la adición de 500 μl de 5% de cloro activo solución de NaClO y 1 μl de 10% Tritón X-100 a 500 μl de agua estéril.</li>
		<li>Colocar aprox. 50 transgénicos semillas de a. thaliana llevando un marcador fluorescente GFP CT11 como GFP-TUB612 en un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución de etanol 70% y mezclar bien invirtiendo cinco veces. Dejar durante 1 minuto.</li>
		<li>Las semillas se hundirán hasta el fondo del tubo. En una mesa de trabajo limpia, suavemente Quite el etanol al 70% usando una micropipeta y añadir 1 mL de solución de esterilización. Mezclar bien por inversión del tubo cinco veces y dejar durante 5 minutos.</li>
		<li>Lave las semillas. Sigue trabajando bajo condiciones asépticas en un banco limpio, suavemente retirar la solución con una micropipeta y añadir 1 mL de agua estéril. Repita este paso cinco veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de esterilizado que contenga sacarosa 1/2 Murashige-Skoog medio solución de 3% en cada pocillo de una placa de 24 pocillos en una mesa de trabajo limpia.</li>
	<li>Añadir dos semillas esterilizadas en cada pozo. Cinta de la tapa sobre la placa de 24 pocillos usando dos capas de parafilm.</li>
	<li>Transferencia de la placa de 24 pocillos a un conjunto de cámara de crecimiento a 23,5 ° C con un ciclo de luz-oscuridad de 12-h/12-h con 100 μmol m−2 s−1 blanca luz e incubar durante 14 días.</li>
</ol>3. microscopio Observación de estomas agrupados
<ol><li>Lugar 30 μl de solución 3% sacarosa que contiene 1/2 Murashige-Skoog medio de un pozo de la placa de 24 pozos en el centro de un portaobjetos de vidrio (tamaño: 76 x 26 mm, grueso: 1.0-1.2 mm).</li>
	<li>Quitar un cotiledón de una plántula de 14 días de edad con unas tijeras de disección. Flotar el cotiledón con la observación hacia arriba en la gota de la solución.</li>
	<li>Prepare la muestra de cotiledón según nuestra anterior método13. Esencialmente, coloque 30 μl de la solución en el centro de una cubierta de vidrio (tamaño: 18 × 18 m m, grueso: 0.12-0.17 mm). Voltee el vidrio de la cubierta y colóquela suavemente sobre el cotiledón. Limpie el exceso de tampón usando un paño libre de pelusas.</li>
	<li>Configure a un espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal y seleccione agrupadas protector de las células para la observación con iluminación de campo claro.</li>
	<li>Adquirir imágenes confocales de fluorescencia con estructuras intracelulares según instrucciones del fabricante del microscopio.</li>
</ol>

<ol><li>Raschke, K., Fellows, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+movement+in+Zea+mays%3A+shuttle+of+potassium+and+chloride+between+guard+cells+and+subsidiary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells.</a> Planta. 101 (4), 296-316 (1971).</li>
<li>Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+environmental+responses+of+PATROL1+in+Arabidopsis+subsidiary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.</a> Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).</li>
<li>Bergmann, D. C., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of stomatal development.</a> Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).</li>
<li>Sakai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+compound+bubblin+induces+stomatal+mispatterning+in+Arabidopsis+by+disrupting+the+intrinsic+polarity+of+stomatal+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells.</a> Development. 144 (3), 499-506 (2017).</li>
<li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+of+plant+stomatal+one-cell-spacing+rule+by+sugar+solution+immersion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion.</a> PLOS One. 8 (9), 72456(2013).</li>
<li>Chen, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+callose+synthase+gene+GSL8+is+required+for+cytokinesis+and+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning.</a> Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).</li>
<li>Guseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+cell-to-cell+connectivity+and+stomatal+patterning+by+loss-of-function+mutation+in+Arabidopsis+chorus+%28glucan+synthase-like+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8).</a> Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).</li>
<li>Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubules+and+fusicoccin+response+in+clustered+stomatal+guard+cells+induced+by+sucrose+solution+immersion%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion.</a> Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).</li>
<li>Akita, K., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+solution+induces+clustered+lips%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Sugar solution induces clustered lips.</a> Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).</li>
<li>Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+formation+of+chloroplast+protrusions+and+stromules+in+mesophyll+cells+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana.</a> Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).</li>
<li>Abe, T., Hashimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+microtubule+dynamics+by+expression+of+modified+%CE%B1-tubulin+protein+causes+right-handed+helical+growth+in+transgenic+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants.</a> The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).</li>
<li>Higaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+plant+cell+surface+dynamics+with+variable-angle+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos presentado los protocolos para la inducción de estomas agrupados en a. thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Como se muestra aquí, este método es muy simple y no requiere ninguna habilidad especializada pero puede inducir eficientemente estomas agrupados. Más del 45% de las células de guarda son agrupado con 3% que contiene sacarosa solución medianas (valores promedio de más de 20 observaciones independientes)6. Por otra parte...

El estoma de la planta es un órgano esencial para el intercambio de gases para la fotosíntesis y la transpiración, y movimiento estomático se logra por cambios significativos en las células del protector a través de la absorción de iones y la liberación de agua. Bajo el microscopio, se observa un patrón de distribución espaciada de estomas en la superficie de hojas y tallos. Esta distribución espaciada de estomas se considera a movimiento estomático, que está regulado por el intercambio de iones y agua entre las células de guardia y los vecinos de las células epidérmicas1,2. Inducción experimental para estomas de clusters son útiles para investigar la importancia de la distribución espaciada de estomas.
Se ha reportado que el agrupamiento espacial de los estomas puede ser inducida por modificación genética de los genes clave para protector de celular diferenciación3,4 o tratamiento con un compuesto químico5. También nos informan que el tratamiento de inmersión con una solución de medios complementadas con azúcares como sacarosa, glucosa, y fructosa causada agrupamiento estomático en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana 6. Reducción callosa en las paredes celulares de nuevo separar meristemoides y las células epidérmicas se observó en la epidermis de cotiledón tratado con sacarosa, lo que sugiere que el tratamiento de inmersión en solución de sacarosa afecta negativamente la pared celular, que impide la fuga y acción ectópico de productos gen clave para la diferenciación de protector de la célula (e.g. factores de transcripción) hacia el lado epidérmico células6. Un mecanismo similar fue sugerido de estudios gsl8/chor mutantes7,8. Nuestro sistema experimental para la inducción reproducible de estomas agrupados utilizando solución de medio que contiene la sacarosa es bastante fácil y barato. También puede ser utilizado para investigar las estructuras intracelulares como orgánulos y el citoesqueleto en las células de guardia agrupados cuando se aplica a líneas transgénicas expresando marcadores fluorescentes que etiqueta las estructuras intracelulares9, 10.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Sumitomo Baquelita</td><td>MS-0824R</td><td></td></tr><tr><td>Láser de 488 nm</td><td>Furukawa Denko</td><td>HPU-50101-PFS2</td><td></td></tr><tr><td>Láser de 488 nm</td><td>Olympus</td><td>Sapphire488-20/O</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso largo de 510 nm</td><td>Olympus BA510IF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>524 - 546 nm Filtro de paso</td> corto <td>Semrock</td><td>FF01-535/22-25</td><td></td></tr><tr><td>Paso corto de 530 nm </td><td>filtro Olympus</td><td>BA530RIF</td><td></td></tr><tr><td>láser de 561 nm</td><td>CVI Melles Griot</td><td>85-YCA-025-040</td><td></td></tr><tr><td>604 - 644 nm filtro de paso de banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de escaneo láser confocal</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de escaneo láser confocal</td><td>Olympus</td><td>FV300</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD refrigerada</td><td>Fotometría</td><td>CoolSNAP HQ2</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaMorph versión 7.8.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de imágenes</td><td>Olympus</td><td>FLUOVIEW v5.0</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Olympus</td><td>Aceite de inmersión Tipo-F</td><td>ne = 1.518 (23 grados)</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Murashige y Skoog Mezcla de sales vegetales</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>392-00591</td><td>Murashige T y Skoog F (1962) Un medio revisado para crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de tejidos de tabaco. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.</td></tr><tr><td>Lente del objetivo&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 100x / 1.35 NA Aceite Iris 1.35</td><td>NA = 1.35</td></tr><tr><td>Lente objetivo&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>UPlanAPO 40x / 0.85 NA</td><td>NA = 0.85</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>196-00015</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de arabidopsis thaliana

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Movimiento estomático media intercambio del gas de la planta, que es esencial para la fotosíntesis y la transpiración. Apertura estomática y el cierre se logran por un aumento significativo y disminución en el volumen de la célula de guardia, respectivamente. Porque transporte transporte de iones y de agua se produce entre las células del protector y las células epidérmicas vecinas más grandes durante el movimiento estomático, la distribución espaciada de los estomas de la planta se considera una distribución óptima para el movimiento estomático. Sistemas experimentales para perturbar el patrón espaciado de estomas son útiles para examinar la importancia del patrón de espaciamiento. Se han identificado varios genes principales asociados con la distribución estomática espaciada y estomas agrupados pueden ser inducidas experimentalmente mediante la alteración de estos genes. Por otra parte, estomas agrupados pueden ser también inducidas por tratamientos exógenos sin modificación genética. En este artículo, describimos un sistema de inducción simple para estomas agrupados en Arabidopsis thaliana plántulas por tratamiento de inmersión con una solución media que contengan sacarosa. Nuestro método es fácil y directamente aplicables en líneas transgénicas o mutantes. Cloroplastos más grandes se presentan como un sello biológico celular de células de guardia agrupados inducida por sacarosa. Además, una imagen microscopio confocal representativa de los microtúbulos corticales se muestra como un ejemplo de observación intracelular de células agrupadas de guardia. Se mantiene la orientación radial de los microtúbulos corticales en agrupado células de guardia como en las células de guardia espaciadas en condiciones de control.

Aquí, se presenta el protocolo para un simple método de inducir agrupamiento estomático que contengan sacarosa solución media en a. thaliana plántulas. Las células de guardia agrupadas en solución media que contienen sacarosa (figura 1B) tienen más cloroplastos que el protector de las células cultivadas en condiciones de control libre de sacarosa (figura 1A). La ampliación de los cloropl...

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo inducir estomas agrupadas en cotiledones de plántulas de Arabidopsis thaliana mediante tratamiento de inmersión con una solución media que contienen azúcar y observar estructuras intracelulares como cloroplastos y los microtúbulos en las células de guardia agrupados con confocal laser microscopia.

Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

Este método ha respondido a una cuestión clave de la biología del desarrollo vegetal. Es decir, ¿cuál es la importancia de la distribución espacial de los estomas? Nuestro sistema de inducción para estomas agrupados utilizando solución de sacarosa es bastante fácil y directamente aplicable a las líneas transgénicas o mutantes de Arabidopsis thaliana.Para empezar, añade 1,1 gramos de sales medianas De Murashige-Skoog y 15 gramos de sacarosa a un vaso de precipitados. Agregue 490 mililitros de agua destilada al vaso de precipitados y mezcle con la barra de agitación. Utilice hidróxido de potasio para ajustar el pH a 5.8.A continuación, diluir la solución con 500 mililitros de agua destilada y transferir la solución diluida a una botella mediana. Después de esto, autoclave la solución. Preparar la solución de esterilización de acuerdo con el protocolo de texto.Luego, trabajando en condiciones asépticas, coloque alrededor de 50 semillas transgénicas de A.thaliana que lleven un marcador fluorescente en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue un mililitro de 70% de etanol al tubo y mezcle invirtiendo el tubo cinco veces. Después de permitir que las semillas se hundan en la parte inferior del tubo, retire suavemente el etanol con una micropipeta.Añadir un mililitro de solución de esterilización a las semillas e invertir el tubo cinco veces para mezclar. Retire suavemente la solución de esterilización de las semillas con una micropipeta. A continuación, agregue un mililitro de agua estéril.Añadir 1,5 mililitros de la solución Murashige-Skoog a cada pozo de una placa de 24 pozos. Luego agregue dos semillas esterilizadas a cada pozo. Usando dos capas de parafilm, pegue la tapa en la placa.A continuación, transfiera la placa a una cámara de crecimiento para incubar durante 14 días. En primer lugar, transfiera 30 microlitros de la solución Murashige-Skoog desde la placa de 24 pozos al centro de un portaobjetos de vidrio. Usando tijeras de disección, retire el cotiledón de una plántula de 14 días de edad.Flote el cotiledone con el lado de observación mirando hacia arriba en la gota de la solución Murashige-Skoog. Preparar el cotiledonen de acuerdo con los métodos descritos anteriormente en el Diario de experimentos visualizados. Ajuste el espécimen en el escenario de un microscopio láser confocal.Por último, utilice la iluminación de campo brillante para seleccionar celdas de protección agrupadas para la observación. En este protocolo, la agrupación en clústeres estomatales fue inducida en plántulas de A.thaliana. Las células de protección agrupadas cultivadas en la sacarosa que contienen medios que tienen cloroplastos más grandes que las células de protección cultivadas en condiciones libres de sacarosa.El agrandamiento de los cloroplastos se confirmó con un marcador de estroma de cloroplasto y autofluorescentes de clorofila, lo que sugiere que el tratamiento de sacarosa dio lugar a la acumulación de grano de almidón en los cloroplastos. Además, la observación confocal de la bañera-6 de la GFP reveló que los microtúbulos corticales estaban orientados radialmente en las células tratadas con sacarosa, al igual que en las células de protección libres de sacarosa. En realidad descubrimos este método por accidente.Después del hallazgo, examinamos la respuesta ambiental de los estomas agrupados. Creemos que nuestro sistema podría ayudar a examinar la importancia de la distribución de estomas.

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Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal

Un sistema de inducción para estomas agrupadas por tratamiento de inmersión en solución de azúcar en plántulas de Arabidopsis thaliana

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