Name: Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende el método de pulso-persecución radiactivo con 35S-metionina para analizar el plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas. Esta técnica cuantitativa permite estudiar la biosíntesis proteica con precisión.

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Los autores gracias a todos los miembros del laboratorio Braakman, pasado y presentan, para sus discusiones fructíferas y ayudan en el desarrollo de los métodos presentados en este artículo. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en séptimo programa marco (FP7/2007-2013) N ° de la Unión 235649 y la organización de países bajos de investigación científica (NWO) bajo el eco-programa N ° 711.012.008.

Todos los procedimientos y reactivos radiactivos se manejaron con arreglo a las normas y reglas locales de radiación de la Universidad de Utrecht.
1. pulso Chase
<ol><li>
Pulso Chase para células adherentes Nota: Los volúmenes dados aquí se basan en platos de cultivo celular 60 mm. Para 35 mm o 100 mm platos, multiplicar los volúmenes por 1/2 o 2, respectivamente. Este protocolo utiliza un tiempo de pulso de tiempos de 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min 10 min y chase. Estos pueden variar dependiendo de las proteínas específicas estudiadas (discutidas abajo).<ol>
<li>Las células adherentes (por ejemplo, HEK 293, HeLa, CHO) de la semilla en seis platos de cultura de célula de 60 mm para que sean subconfluent (80% - 90%) en el día de la persecución del pulso. Utilice al menos uno de los platos por momento y condición.</li>
		<li>Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante; o virus transduce8 las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.</li>
		<li>Lavar los platos con 2 mL de tampón de lavado (Hank equilibrada solución de sal [HBSS]), agregar 2 mL de medio de hambre (normal medio de cultivo carece de metionina y cisteína y suero bovino fetal [SBF], como medio esencial mínimo [MEM] sin metionina y cisteína pero con 10 mM HEPES, pH 7,4) y colocar los platos en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO2 durante 15 minutos.</li>
		<li>Transferir los platos a las barras en un baño de agua precalentado 37 ° C para que estén en contacto con agua, pero no flotar. Iniciar un temporizador.</li>
		<li>A los 40 s, aspirar el medio de la inanición, elaborar 600 μl de solución de pulso (hambre media + 55 plato μCi/35 mm etiqueta, véase la nota anterior paso 1.1.1) con la pipeta y agregarla suavemente al centro del plato en exactamente 1 minuto repetir este paso en intervalos de 1 minuto para t platos restantes. Comience con la mayor muestra de chase para ahorrar tiempo durante el experimento. Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación.</li>
		<li>En exactamente 11 minutos para todos los platos siguientes, excepto la muestra de la persecución de 0 min, agregar 2 mL de medio de chase directamente al plato, aspirarlo y otra vez, añadir 2 mL de medio de chase. Repetir a intervalos de 1 minuto para platos restantes. Transferir todos los platos a una incubadora de 37 ° C.</li>
		<li>Exactamente 16 min, agregar 2 mL de medio de chase (medio de cultivo normal + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cisteína y metionina de 5 mM) directamente en el plato de muestra de 0 min encima medio pulso deje de etiquetado; Luego, aspirar inmediatamente, transferir el plato a una placa de aluminio refrigerado por y añadir 2 mL de tampón de helada parada (HBSS + 20 mM N- etilmaleimida [NEM]). Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min. Para esta muestra, proceder directamente a paso 1.1.9.</li>
		<li>Transferir cada plato de chase a baño María 2 min antes de cada tiempo de persecución (p. ej., 24 min para una persecución de 15 min) y, en el momento de la persecución exacta (por ejemplo, 26 min para una persecución de 15 min), aspirar los medios de comunicación de chase (o transferir a un tubo de microcentrífuga si pr otein secreción) y el plato se transfieren a una placa de aluminio refrigerado. Añadir 2 mL de helado Tope amortizante.</li>
		<li>Incubar todos los platos en el hielo en el Tope amortizante de ≥5 min; Luego, aspirar la solución y lavar con 2 mL de solución de parada fría. Aspire el lavado y lyse platos con 600 μl de tampón de lisis (tampón fosfato salino [PBS] + nondenaturing detergente [véase Tabla de materiales] inhibidores de la proteasa + 20 mM NEM). Use un raspador celular para asegurar que los platos son lisis cuantitativo.</li>
		<li>Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g y 4 ° C para que sedimenten los núcleos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Persecución de pulso para la suspensión de las células Nota: Para garantizar un etiquetado eficaz, deben ser pulsadas células a una concentración de 3 x 106 a 5 x 106 células/mL y volúmenes de persecución deben ser 4 x el volumen de pulso. En el siguiente ejemplo, hemos pulsado 5 x 106 células en un volumen de 1 mL por 10 min, para producir cinco perseguir tiempo puntos (0, 15, 30, 60 y 120 min) de 1 mL, que contiene 1 x 106 células por momento. Todas las soluciones son las mismas que en la sección 1.1.<ol>
<li>Las células de suspensión (p. ej., 3T3, Jurkat) según un protocolo previamente publicados9 la cultura por lo que hay un número suficiente de células en el momento del experimento, por lo menos 1 x 106 células por tiempo punto o condición.</li>
		<li>Si es necesario, transfectar las células con reactivos de transfección comercialmente disponibles según las instrucciones del fabricante, o virus transduce8 las células 1 día antes del pulso-persiga experimentan con la estructura adecuada para la expresión.</li>
		<li>5 x 106 células por condición en un tubo de 50 mL por 5 min a x 250 g a temperatura ambiente de la pelotilla, lavar 1 x con 5 mL de medio de hambre, otra vez de los pellets y resuspender en 1 mL de medio de hambre.</li>
		<li>Transferir las células a un baño de agua de 37 ° C e incubarlos de 10-25 minutos agitar los tubos cada 10-15 minutos para evitar que las células de colocar en la parte inferior.</li>
		<li>Iniciar el temporizador. En exactamente 1 minuto, añada 275 μCi (55 μCi/1 x 106 células) de etiqueta sin diluir directamente en el tubo que contiene las células y agitar para mezclar. Nota: Cuando se maneja material radioactivo, es esencial seguir las precauciones apropiadas y normas y regulaciones locales para prevenir la exposición accidental y contaminación.</li>
		<li>En exactamente 11 minutos, parada de etiquetado añadiendo 4 mL de medio de chase. Mezcle la muestra e inmediatamente transferir 1 mL a un tubo de 15 mL en hielo, que contiene 9 mL de solución de parada fría. Nota: Esta es la muestra de la persecución de 0 min.</li>
		<li>Repita estos pasos para cada punto de tiempo sucesivos. Una vez recopilados todos los puntos de tiempo, sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C. Aspire el medio (o transferir a un nuevo tubo de 15 mL si después de la secreción de la proteína). Lavar las células con 5 mL de solución de parada y sedimenten las células durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Aspire la solución de parada, totalmente lyse las células con 300 μL de tampón de lisis helada e incubar por 20 min en hielo para garantizar una lisis completa. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar durante 10 min a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para que sedimenten los núcleos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inmunoprecipitación
<ol><li>Combina el anticuerpo (véase la discusión) y 50 μl de inmunoprecipitación granos (p. ej., proteína A-sefarosa) (10% suspensión [v/v] en tampón de lisis + 0.25% albúmina de suero bovino [BSA]) en una microcentrífuga tubo e incubar a 4 ° C por 30 min en una coctelera Boston.</li>
	<li>Los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente de la pelotilla y aspirar el sobrenadante. Añadir 200 μL de lisado a la mezcla de grano de anticuerpo e incubar a 4 ° C en un agitador de 1 h o cabeza sobre cabeza si requiere la inmunoprecipitación > 1 h.</li>
	<li>De pellets los granos durante 1 min a 12.000 x g a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y agregar 1 mL de tampón de lavado de inmunoprecipitación. Colocar la muestra en un agitador a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Los granos de la pelotilla como se describe en el paso 2.3 y repetir el lavado 1 x. A continuación, aspirar el sobrenadante y resuspender las cuentas en 20 μl de tampón TE pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vórtice de la muestra.</li>
	<li>Añadir 20 μl de 2 x de buffer de muestra sin el agente de reducción, vortex, calentar por 5 min a 95 ° C y agitar nuevamente. Nota: Si sólo preparar muestras reductoras, 2 μl de 500 mM DTT se debe agregar en este punto. A continuación, proceda al paso 2.7.</li>
	<li>Como se describe en el paso 2.3 de pellets los granos. Transferencia de 19 μl del sobrenadante nonreduced a un tubo de microcentrífuga fresco que contiene 1 μl de 500 mM DTT, centrifugar la muestra y vortex antes de calentar por 5 min a 95 ° C nuevamente.</li>
	<li>Desactivación de la muestra durante 1 min a 12.000 x g; se trata de la muestra reducida. Enfriar a temperatura ambiente y añadir 1,1 μl de 1 M NEM a la reducción y la muestra nonreduced. Vórtice y giro de las muestras.</li>
</ol>3. SDS-PAGE
<ol><li>En primer lugar, determinar el apropiado SDS-PAGE resolución gel porcentaje de la proteína de interés. Por ejemplo, HIV-1 gp120, cuando deglycosylated, a ~ 60 kDa y se analiza en un gel de 7,5%.</li>
	<li>Preparar la mezcla de gel de resolución sin TEMED según las instrucciones del fabricante (x % acrilamida, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] SDS 0.1% [p/v] y 0.05% persulfato de amonio [APS] [w/v]) y desgasificación bajo vacío para > 15 minutos. Mientras que la desgasificación de la mezcla de gel, bien limpiar las placas de vidrio gel con etanol al 70% y los tejidos libres de pelusas y colocarlos en un aparato de fundición.</li>
	<li>Añadir TEMED a la mezcla de gel de resolución (en una concentración final de 0.005% [v/v]), homogeneizar y pipeta entre placas de vidrio, dejando de ~1.5 cm para el gel de apilamiento. Cuidadosamente el gel con desionizada H2O o isopropanol del recubrimiento y dejar polimerizar.</li>
	<li>Una vez que el gel de resolución ha polimerizado, preparar la mezcla de gel de apilamiento (4% de acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], SDS 0.1% [p/v] y 0.025% APS [p/v]).</li>
	<li>Lave la parte superior del gel de resolución con desionizada H2O y, a continuación, quitar toda el agua. Nota: Utilice papel de filtro para eliminar las últimas gotas.</li>
	<li>Añadir TEMED a la mezcla de gel de apilamiento (0,005% [v/v]), mezclar bien y el gel de resolución con el gel de apilamiento del recubrimiento e inserte un peine de 15 pozos. Una vez que ha polimerizado el gel de apilamiento, traslado a una cámara de ejecución y llenar las cámaras superiores e inferiores con el almacenador intermediario de funcionamiento (25 mM Tris-HCl, glicina 192 mM [pH 8.3] y 0.1% SDS [p/v]).</li>
	<li>Cargar 10 μl de muestra por carril en un minigel de 15 carriles. Evitar cargar las muestras en el primer y el último carril en el gel y el tampón de muestra nonreducing en todos los carriles vacíos para evitar que la sonrisa de bandas de carga. Corren los geles constante 25 mA/gel hasta el frente de tinte es en la parte inferior del gel.</li>
	<li>Retire el gel de las placas de vidrio, teñir los geles con solución de tinción de proteínas (10% de ácido acético y metanol 30% H2O + brillante 0.25% azul R250 [w/v]) durante 5 minutos con agitación y luego, desmanchar por 30 min con extracción (coloración de la solución solución sin R250 azul brillante).</li>
	<li>Organizar los geles boca abajo sobre un plástico abrigo y, luego, coloque papel de cromatografía de 0.4m m encima de ellos. Ponga el gel sandwich cromatografía en papel-lado abajo en un gel secador. Siguiendo las instrucciones del fabricante, secar los geles por 2 h a 80 ° C.</li>
	<li>Transferir los geles secos en una casete y recubrimiento con pantalla de cine o fósforo de autorradiografía. Si usan la película de autorradiografía, este paso debe realizarse en un cuarto oscuro.</li>
</ol>

<ol><li>Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-+and+Post-Translational+Protein+Folding+in+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER.</a> Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).</li>
<li>Pisoni, G. B., Molinari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+Questions+%28with+their+Answers%29+on+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation.</a> Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).</li>
<li>Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycan-based+ER+Molecular+Chaperone+and+Protein+Quality+Control+System%3A+The+Calnexin+Binding+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle.</a> Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+topology+around+the+cleavage+site+regulate+post-translational+cleavage+of+the+HIV-1+gp160+signal+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide.</a> Elife. 6, 26067(2017).</li>
<li>Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+influenza+hemagglutinin+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).</li>
<li>Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+nonvectorial+folding+in+a+newly+synthesized+multidomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein.</a> Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).</li>
<li>Land, A., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum.</a> Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Helper+T+Cells+as+a+Genetic+Approach+to+Study+Mechanisms+Controlling+their+Differentiation+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54698(2016).</li>
<li>Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evolves+into+a+nonsyncytium-inducing+virus+upon+prolonged+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro.</a> Virology. 263 (1), 55-69 (1999).</li>
<li>Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+and+calnexin+binding+during+glycoprotein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).</li>
<li>Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycans+direct+the+cotranslational+folding+pathway+of+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin.</a> Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).</li>
<li>Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Hsp47%2C+Grp78%2C+and+Grp94+with+procollagen+supports+the+successive+or+coupled+action+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).</li>
<li>Hoelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+folding+defect+and+rescue+of+DeltaF508+CFTR+emerge+during+translation+of+the+mutant+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain.</a> PLoS One. 5 (11), 15458(2010).</li>
<li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li>
<li>Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+Regulation+of+Glycoprotein+Quality+Control+in+the+Endoplasmic+Reticulum+Is+Controlled+by+the+E2+Ub-Conjugating+Enzyme+UBC6e%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e.</a> Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).</li>
<li>Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+influenza+hemagglutinin+trimers+and+its+role+in+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport.</a> Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pulso-persiga métodos han sido esenciales para el desarrollo de la comprensión de los científicos del plegamiento en las células intactas de la proteína. Mientras que hemos intentado ofrecer un método que es tan general como sea posible, este enfoque tiene el potencial de las variaciones casi ilimitadas estudiar varios procesos que ocurren durante el plegamiento, el transporte y la vida de las proteínas dentro de la célula.
Cuando se realiza una persecución de pulso utilizando células adherent...

El plegamiento de incluso relativamente simple de las proteínas consiste en muchas diversas enzimas plegables chaperones moleculares y modificaciones covalentes1. Una reconstitución completa de estos procesos en vitro es prácticamente imposible, dado el gran número de diferentes componentes involucrados. Es altamente deseable, por lo tanto, estudiar la proteína plegable en vivo, en células vivas. Técnicas radiactivas Pulso-persiga probar una herramienta poderosa para el estudio de la síntesis, plegable, transporte y degradación de proteínas en su ambiente natural.
El metabólico etiquetado de proteínas durante un pulso corto con 35S-labeled metionina/cisteína, seguido de una persecución en la ausencia de una etiqueta radiactiva, permite el seguimiento específico de una población de proteínas recién sintetizadas en el más amplio medio celular. Luego, las proteínas blanco pueden ser aislada mediante inmunoprecipitación y analizan por SDS-PAGE u otras técnicas. Para muchas proteínas, su viaje a través de la célula se caracteriza por modificaciones visibles en gel de SDS-PAGE. Por ejemplo, el transporte de proteínas glicosiladas desde el retículo endoplásmico (ER) del complejo de Golgi es acompañado a menudo por modificaciones de glycans N-ligados o la adición de O-linked glycans2,3. Estas modificaciones provocan grandes aumentos en la masa molecular aparente, que puede verse por los cambios de movilidad en SDS-PAGE. Maduración también puede ser marcada por las divisiones proteolíticas, tales como péptido señal escote o la eliminación de pro-péptidos, dando por resultado cambios en la masa molecular aparente que puede seguirse fácilmente en gel de SDS-PAGE4. Radiactividad tiene considerables ventajas sobre técnicas comparables como persecuciones de cicloheximida, donde se impide la síntesis de nuevas proteínas, como tratamientos más largos son tóxicos para las células y no excluyen a la mayoría de las proteínas mayores, estado de la Análisis, como algunas proteínas tienen vidas medias de días. La comparación de proteínas en ambos nonreducing y reducción de condiciones permite el análisis de la formación del enlace de disulfuro, un paso importante en el plegamiento de las proteínas secretoras muchos de4,5,6, 7.
Aquí describimos un método general para el análisis del plegamiento de la proteína y el transporte en las células intactas, utilizando un enfoque de Pulso-persiga radiactivos. Mientras que nos hemos dirigido para proporcionar el método detallado como sea posible, el protocolo tiene un potencial casi ilimitado para la adaptabilidad y permitirá la optimización para el estudio de proteínas específicas de cada lector.
Se proporcionan dos protocolos alternativos Pulso-persiga, para células adherentes (paso 1.1 del protocolo presentado aquí) y las células de suspensión (paso 1.2 del protocolo presentado aquí). Las condiciones proporcionan aquí son suficientes para visualizar una proteína expresada con niveles de media a alta expresión. Si el lector está trabajando con proteínas mal expresadas o varias condiciones posttreatment, tales como múltiples immunoprecipitations, es necesario aumentar el tamaño del plato o número de células adecuado.
Para la persecución de pulso de suspensión, las muestras de chase tomadas en cada momento se toman de un solo tubo de células. Los pasos de lavado después de que el pulso se omiten; en cambio, más incorporación de 35S es prevenida por dilución con un alto exceso de cisteína y metionina sin etiqueta.
Los protocolos presentados usan radiactivos 35S etiquetado cisteina y metionina para seguir procesos de plegamiento de proteínas celulares. Todas las operaciones con reactivos radiactivos deben realizarse utilizando medidas de protección adecuadas para reducir al mínimo cualquier exposición del operador y el medio ambiente a la radiación radiactiva y realizarse en un laboratorio designado. Pulso-persiga etiquetado técnica es relativamente ineficaz en tiempos de pulso corto (< 15 min), menos del 1% de la cantidad a partir de la radiactividad se incorpora en las proteínas recién sintetizadas. Después el enriquecimiento de la proteína mediante inmunoprecipitación de blanco, la muestra para SDS-PAGE contiene menos de 0.05% de la cantidad inicial de radiactividad.
Aunque los 35S metionina y cisteína etiquetado mezcla se estabiliza, se producirá cierta descomposición, produciendo compuestos radiactivos. Para proteger el investigador y el aparato, se deben tomar algunas precauciones. El investigador siempre debe obedecer a las normas de seguridad de radiación local y puede llevar carbón y una máscara, además de una bata de laboratorio y guantes (doble) de enfermería. Los frascos de stock con 35S metionina y cisteína siempre deben abrirse en una campana de humos, o bajo un punto de aspiración local. Puntos de contaminación de laboratorio conocidas son centrífugas, pipetas, baños, incubadoras y agitadores. La contaminación de estas áreas se reduce mediante el uso de puntas de pipeta con filtro de carbón, tubos de microcentrífuga de sello positivo (véase Tabla de materiales), esponjas de carbón de acuario de agua baños, carbón filtro papeles pegados en los platos de Pulso-persiga, protector de carbón en el sistema de aspiración y la colocación de platos que contienen carbón granos en incubadoras y recipientes de almacenamiento.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga safeseal de 1,5 mL Sarstedt</td><td></td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>A6283</td> ácido <td>acético glacial</td></tr><tr><td>BAS Pantalla de fósforo de almacenamiento 20x25 cm</td><td>GE Life Sciences</td><td>28956475</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Películas Carestream Biomax MR</td><td>Kodak Z350370-50EA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medios de cultivo celular</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Medios de cultivo celular normales para líneas celulares específicas utilizados</td></tr><tr><td>Medios de cultivo celular, sin metionina/cisteína</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td>Misma formulación de medios que los medios de cultivo normales, por ejemplo, DMEM/MEM/RPMI, sin metionina ni cisteína</td></tr><tr><td>Papel de filtro de carbón vegetal</td><td>Whatman</td><td>1872047</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta filtradas con carbón vegetal</td><td>Molecular bioproducts</td><td>5069B</td><td></td></tr><tr><td>Protector de vacío para carbón</td><td>vegetal Whatman</td><td>67221001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Sigma</td><td>112,553</td><td>para electroforesis</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td>Grado de biología molecular, Hacer 500 mM de stock, almacenar en -20&nbsp;</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>EasyTag Express35S Mezcla de etiquetado de proteínas</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772014MC</td><td>Otros tamaños de etiquetas están disponibles según el uso.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E1644</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Equipo de secado en gel</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Papel</td></tr> de <tr><td>cromatografía de grado 3</td> de biología molecular <td>GE Life Sciences</td><td>3003-917</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td></td><td></td>Toallitas para tareas delicadas Gibco 24020117 <td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M3671</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>MX0490&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metionina</td><td>Sigma</td><td>M5308</td><td>Grado de biología molecular, haga 250 mM de caldo, almacene a -20</td></tr><tr><td>Minigel equipo de fundición/funcionamiento</td><td>Varios</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>N-etilmaleimida Sigma</td><td></td><td>E3876</td><td>Grado de biología molecular, haga 1M de stock en etanol 100%, almacene a -20</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Proteína-A Perlas de flujo rápido de sefarosa</td><td>GE cuidado de la salud</td><td>17-5280-04</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Trizma base (Tris)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Typhoon IP Generador de imágenes biomoleculares</td><td>Amersham 29187194</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bastidor de tubos de ensayo sin cables de 20 mm para baño de agua</td><td>Nalgene</td><td>5970-0320PK</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo chase

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radiactivos de Pulso-persiga el etiquetado es una poderosa herramienta para el estudio de la maduración conformacional, el transporte y su localización celular funcional, la degradación de las proteínas de la blanco en células vivas. Mediante el uso de tiempos radiolabeling cortos (pulso) (< 30 min) y firmemente controlada por tiempos de persecución, es posible que sólo una pequeña fracción de la piscina de la proteína total de la etiqueta y seguir su plegamiento. Cuando se combina con nonreducing, reduciendo electroforesis del gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y la inmunoprecipitación con anticuerpos (específicos de conformación), procesos de plegamiento puede examinarse con gran detalle. Este sistema se ha utilizado para analizar el plegado de proteínas con una gran variación de propiedades como proteínas solubles, proteínas transmembranales únicas y de multipaso, pesadamente proteínas N - y O-glicosiladas y proteínas con y sin extenso disulfuro de la vinculación. Pulso-persiga los métodos son la base de estudios cinéticos en una gama de características adicionales, incluyendo co - modificaciones del posttranslational, Oligomerización y polimerización, esencialmente, lo que permite el análisis de una proteína desde el nacimiento hasta la muerte. Pulso-persiga los estudios en el plegamiento de la proteína son complementarios con otros métodos bioquímicos y biofísicos para el estudio de proteínas en vitro proporcionando información fisiológica y mayor resolución temporal. Los métodos como se describe en este artículo se adaptan fácilmente para estudiar el plegamiento de casi cualquier proteína que puede expresarse en sistemas mamíferos o insectos-cell.

El plegamiento y la secreción de la gp120 del VIH-1 de una persecución de pulso adherente se muestra en la figura 2. El gel nonreducing (Nº de células en la figura) muestra el plegamiento oxidativo de gp120. Inmediatamente después del pulso de etiquetado de gp120 de 5 min (min 0 chase) aparece como una banda difusa en el gel, y conforme avanza la persecución, la banda migra por el gel a través de la aún más difundida plegamiento intermedios (IT) hasta que se ...

Aquí se describe un protocolo para un método de Pulso-persiga general que permite el análisis de la cinético de plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas.

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

La persecución por pulsos radiactivos utilizando 35 metionina y cisteína con etiqueta S sigue siendo los únicos métodos bioquímicos para investigar la biosíntesis de proteínas con el tiempo en células vivas. La biosíntesis de proteínas abarca tanto la traducción, el plegado y el montaje, como el tráfico y la degradación. La combinación de la persecución por pulsos radiactivos con el análisis de las modificaciones de las proteínas co-y post-traducción, como la formación de unión de disulfuro y la acetilación proporciona un ensayo sensible y cuantitativo para investigar la fe de la proteína con el tiempo.Para este procedimiento se requiere un buen enfoque y manejo experimental. Una buena preparación es crucial, como los tampones, su espacio de trabajo radiactivo y un horario claro. Este video proporciona una visión clara sobre el hombro del protocolo de persecución de pulsos radiactivos.Demostrando el procedimiento estará Hui Ying Yeoh, un candidato pHd de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, las celdas de referencia de inicialización y de referencia cultural se describen en el protocolo de texto. Antes de la persecución por pulsos, inspeccione sus células a través del microscopio.A continuación, lave los platos con dos mililitros de tampón de lavado. Y dos mililitros de inanición medio a las células y colocar los platos en una incubadora humidificada a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Asegúrate de que la configuración de tu persecución de pulsos esté en orden.Transfiera los platos a los estantes en el baño de agua, precalegado a 37 grados centígrados. Asegúrese de que los platos estén en contacto con el agua, pero no flote. Entonces, inicia un temporizador.A los 40 segundos, aspira el medio de inanición. Con una micro pipeta, extraiga 600 microlitros de solución de pulso. En exactamente un minuto, agregue suavemente la solución de pulso al centro del plato.Repita este proceso de eliminación del medio de inanición y adición de la solución de pulso para los platos restantes a intervalos de un minuto. A exactamente 11 minutos y para todos los platos siguientes, de acuerdo con el esquema de persecución de pulsos, a excepción de la muestra de persecución de minuto cero, añadir dos mililitros de medio de persecución directamente al plato. Aspirar el medio de persecución y reemplazarlo con dos mililitros de nuevo medio de persecución.Repita este proceso para todos los platos restantes a intervalos de un minuto. Cuando el temporizador lea exactamente 16 minutos, agregue dos militers de medio de persecución directamente a la antena de persecución de cero minutos, en la parte superior del medio de pulso, para dejar de etiquetar. Inmediatamente aspirar el medio.Transfiera el plato a una placa de aluminio enfriada y agregue dos militers de tampón de parada fría. Transfiera todos los demás platos a una incubadora a 37 grados centígrados. Transfiera cada plato de persecución de vuelta de la incubadora al baño de agua dos minutos antes del final de cada tiempo de persecución.En el momento exacto de persecución para cada plato, aspirar el medio de persecución y transferir el plato a una placa de aluminio enfriado. Agregue dos mililitros de tampón de parada fría. Deje todos los platos sobre hielo y detenga el tampón hasta que haya tiempo para enteblar las células.A continuación, aspirar la solución de parada y lavar todos los platos. Tres al mismo tiempo con dos mililitros de solución de parada de frío helado. Aspirar completamente la solución de parada y añadir 600 microlitros de tampón de lelisis a dos platos a la vez.Usando un rascador de células, raspe bien la superficie del plato, pero suavemente para mezclar el licate. Transfiera el licato de cada plato a un tubo de micro centrífuga fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 15.000 a 20.000 G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar los núcleos.Para la persecución por pulsos en las células de suspensión recoger cinco millones de células por punto de tiempo en un tubo de 50 mililitros. Realice el procedimiento de inanición como se describe en el texto. Después del procedimiento de inanición en el baño de agua durante 15 minutos, encienda el temporizador.En exactamente un minuto, agregue 275 microcuries de etiqueta sin diluir directamente al tubo que contiene las células y gire para mezclar. En exactamente 11 minutos, agregue cuatro mililitros de medios de persecución para detener el etiquetado. Y transfiera inmediatamente un mililitro a un tubo de 15 mililitros en hielo que contenga nueve mililitros de solución de parada fría para dejar de etiquetar.Repita este proceso de transferir un mililitro de persecución a un tubo sobre hielo que contenga nueve mililitros de solución de parada para cada punto de tiempo de persecución sucesiva. Después de la inmunoprecipitación, aspirar el último lavado por completo. Vuelva a suspender las perlas en 20 microlitros de tampón TE y vórtice.Agregue 20 microlitros de dos Tampón de muestra X sin el agente reductor. Vórtice las muestras y luego calientelas a 95 grados Centígrados durante cinco minutos. Vórtice las muestras de nuevo.Centrifugar a 12.000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto. Transfiera 19 microlitros del sobrenadante no reducido a un tubo de microcentrífuga fresco que contenga un microlitro de 500 DDT militrolar. Si es necesario, centrifuga la muestra rápidamente para que todos los líquidos estén en la parte inferior.Y calienta a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Deje que la muestra reducida se enfríe y luego vórtice. Centrifugar las muestras reducidas y no reducidas a 12.000 veces G a temperatura ambiente durante un minuto, y luego añadir 1,1 microlitros de un NEM molar a todas las muestras.En este estudio, se utiliza un enfoque de persecución de pulsos radiactivos para analizar el plegado de proteínas y el transporte en células intactas. Aquí se muestra el plegado y la secreción del VIH un GP120 de una persecución por pulsos adherente. El gel no reductor muestra el plegado oxidativo de GP120.Inmediatamente después del etiquetado del pulso, aparece como una banda difusa más alta en el gel. A medida que la persecución avanza, la banda migra hacia abajo el gel a través de intermedios plegables aún más difusos hasta que se acumula en la banda apretada que representa plegada de forma nativa en GP120. Esto ocurre a medida que la formación de enlaces de disulfuro aumenta la compacidad de la proteína, haciendo que migre más rápido que la proteína totalmente reducida.En el gel reductor, los enlaces de disulfuro y todas las moléculas se han reducido y no afectan a la mobiilty. Como tal, las diferencias en la movilidad son sólo el resultado de cambios en la masa molecular. El cambio con el tiempo de la forma cambiada del péptido de señal reducida a la forma reducida de péptido de señal cortado representa la escisión del péptido de señal post-traduccional de GP120.La movilidad aumenta debido a la pérdida del péptido de señal que aumenta durante la persecución a medida que más proteínas alcanzan el pliegue nativo y pierden su péptido de señal. Tanto en el gel no reductor y reductor, la señal comienza a disminuir a partir de aproximadamente una hora debido a la secreción de GP120. Esto se puede supervisar mediante el análisis de los medios.Este método es aplicable a cualquier línea celular, incluidos los modelos de células organoides. Pero el éxito depende en gran medida del nivel de expresión de la proteína de interés. Antes de comenzar este procedimiento, marque sus platos y mantenga este orden durante todo el experimento.Asegúrese de que todo está preparado antes de agregar un medio de hambre. Este es el comienzo del experimento. Y tu tiempo de laboratorio es tu amigo, pero puede ser tu mayor enemigo cuando no estés preparado.La persecución de Bill se puede combinar con proteólisis limitada para investigar el patrimonio completo de proteínas con el tiempo. También diferentes métodos de congeladores elegidos permitirán el análisis de enjuague o rigormorización o diferencias de carga. Para proteger al investigador y al aparato, deben obedecerse todas las normas locales de seguridad de la radiación.Y las medidas de protección deben tomarse de acuerdo con el protocolo. Tenga en cuenta que su acrilamida, utilizada para su página STH es neurotóxica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

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Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

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Intercambio específico de residuos de prolina por análogos de prolina en proteínas fluorescentes: cómo la "cirugía molecular" de la columna vertebral afecta el plegamiento y la estabilidad

Aprende el método de pulso-persecución radiactivo con 35S-metionina para analizar el plegamiento, transporte y degradación de proteínas en células vivas. Esta técnica cuantitativa permite estudiar la biosíntesis proteica con precisión.

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