Name: Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a producir y purificar vectores de virus adeno-asociado de alta pureza y título usando células HEK. Este protocolo permite obtener expresión génica específica de tejido para aplicaciones de terapia génica.

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M.R. es apoyado por un Fonds voor beca postdoctoral Wetenschappelijk Onderzoek Flandes (FWO) (133722/1204517N) y reconoce el apoyo continuo de la Fundación Cardiovascular de Colombia y el Departamento Administrativo de ciencia, Tecnología e innovación (Grant CT-FP44842-307-2016, código de proyecto 656671250485). M.M. es apoyado por una Beca doctoral FWO (1S48018N). M.G.H. fue apoyado por una beca institucional VIB y apoyo externo de la Fundación de Letrán de Thierry (SOD-VIP), la Fundación para la investigación de Alzheimer (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) y el Consejo Europeo de investigación (CEI) (Starting Grant 281961 - AstroFunc; Prueba de concepto subvención 713755 - AD-VIP). Los autores reconocen Jeason Haughton por su ayuda con la cría de ratón, Stephanie Castaldo por su ayuda realizar las inyecciones de vena de la cola y Caroline Eykens para proporcionar las imágenes de células HEK293T transfected. M.G.H. reconoce Michael Dunlop, Peter Hickman y Dean Harrison.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La producción de vectores AAV recombinantes descritos aquí utiliza materiales y equipos comunes a la mayoría de los laboratorios de biología molecular e instalaciones de cultivo de células. Permite al usuario obtener vectores AAV grado puro, preclínica que se pueden utilizar para varios tipos de células y tejidos de destino a través de una gama de aplicaciones in vitro e in vivo . Una de las mayores ventajas de este protocolo, comparado con otros (es decir, basado en el CsCl purificación), es el más corto tiempo de trabajo necesario. Vectores AAV listo para su uso son obtenibles en un plazo máximo de 6 días hábiles después de la inicial de la transfección de células HEK293T.
Varios factores pueden influir negativamente el rendimiento final o la calidad de los vectores AAV. Eficiencia de transfección deficiente es una de las principales razones de bajo rendimiento viral33. Una recomendación importante es la utilización de células HEK293T que no han sido pasados más de 20 veces y no tienen una confluencia celular superior al 90% en el momento de transfección21. Además, el método de transfección seleccionado tiene un impacto importante en los resultados. Este protocolo se basa en el uso del PEI. El PEI es un polímero catiónico con la capacidad de entregar ADN exógeno en el núcleo de la célula a través de la generación de complejos de ácido nucleico, conocido como polyplexes, que son tomados por la célula y son objeto de trata a través de endosomas34y polímero. Basado en el PEI la transfección es fácil y rápido de realizar, en contraste con otros métodos utilizados, como la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio35. También, basado en el PEI la transfección es mucho más barata comparado con otros métodos recién introducidas, como el uso de lípidos catiónicos y transfección mediada por el imán de36.
La estrategia de purificación desempeña un papel clave en el protocolo. En comparación con otros métodos, basado en el iodixanol purificaciones tienden a contienen un mayor porcentaje de partículas virales vacías (20%)20. Esto se compensa, en un grado, por el hecho de que base de iodixanol purificación resulta habitualmente en preparaciones de vector AAV con una proporción de partículas a la infectividad de menos de 100. Esto representa una mejora significativa en comparación con los procedimientos convencionales basados en CsCl, que substancial pérdida de infectividad de la partícula es reportado37. Otro método alternativo común para purificar los vectores AAV es purificación basados en cromatografía. Sin embargo, este método tiene el gran inconveniente que una columna específica se requiere para cada cápside de vector utilizado: por ejemplo, mientras que AAV2 es clásico aislados utilizando columnas de heparina, esta metodología no funciona con AAV4 y AAV5, que no poseen heparina sitios en su cápsida38. Teniendo en cuenta que la purificación cromatografía también es costosa, purificación de iodixanol es generalmente más conveniente para los laboratorios que deseen producir lotes de alta calidad de vectores AAV en una pequeña escala33,39, 40. sin embargo, para maximizar el rendimiento final y la pureza del vector, es necesario mucho cuidado al hacer los gradientes de iodixanol. Las diferentes fracciones de iodixanol deben transferirse al ultracentrifugación tubo con una pipeta Pasteur estéril cuya punta toca la pared del tubo: iodixanol debe ser expulsado de la pipeta lentamente y continuamente. Como las partículas de vector se acumulan en la capa de iodixanol 40%, cuidado debe ser tomado para asegurar que las interfaces de gradiente no mezclen20. Finalmente, la fracción que contiene el vector debe ser recuperada por la inserción de una aguja Roma de acero inoxidable con un calibre no mayor que 20 G. Para maximizar la recuperación del vector, la fracción claro deberá ser recuperada en su totalidad. Durante este paso, el tiempo es crítico. Para evitar comprometer la pureza de la preparación, es fundamental para detener la colección antes de otras fases (contaminantes) del degradado que se recogen.
Las diferencias en el título del vector obtenido pueden atribuirse también a la capacidad intrínseca del vector para producir partículas de envasados. Una comparación entre diferentes serotipos AAV mostró que algunos vectores AAV son más difíciles de producir en un título más alto que otros (por ejemplo, AAV2)41. Precipitación del vector, durante la etapa de desalación, puede ser una posible razón de un título menor y fácilmente prevenir evitando concentración33. Por otra parte, también es posible que la eficiencia de purificación basados en gradiente de iodixanol difiere ligeramente entre serotipos y, por lo tanto, se pueden observar discrepancias en el título obtenido con diferentes serotipos41.
Finalmente, debe señalarse que a pesar de qPCR es un método muy preciso de cuantificación de ADN se observa cierta variabilidad inherente en la técnica. Exactitud en la valoración depende principalmente de la pipeteo preciso y Vortex adecuada de las soluciones. Para garantizar el título más preciso de la lectura, se puede repetir la qPCR independientemente, y un promedio de los valores obtenidos. La elección de primers presentadas en este protocolo se basa en la secuencia del promotor CBA en el plásmido pTransgene utilizado en nuestro laboratorio. El promotor de la CBA es un fuerte promotor sintético que es ampliamente utilizado en el campo del vector a la expresión de la unidad a través de múltiples tipos de células. Incorpora varios elementos, incluyendo el elemento potenciador temprano del citomegalovirus (CMV); el promotor, primer exón y el primer intrón del gene del CBA; y el aceptador del empalme del gene del β-globin de conejo. Sin embargo, se pueden diseñar cartillas para prácticamente cualquier elemento ubicado en el casete de expresión (incluyendo el promotor transgénico y elementos reguladores). La comparación del título a través de lotes de también es posible, proporcionar cartillas se utilizan contra las regiones comunes a los vectores en cuestión.
En conclusión, este protocolo puede utilizarse para producir vectores AAV con una variedad de cápsida, configuraciones de genoma, promotor tipos y cargas de transgenes. Esto permitirá a los usuarios para adaptarse fácilmente a las características finales de sus vectores para satisfacer mejor las necesidades experimentales. En el ejemplo presentado en los resultados representativos, el uso de PHP. Cápside de B, que cruza eficientemente el BBB, dio expresión génica altamente eficiente en el SNC, la siguiente cola vena inyección32. La administración sistémica de vectores penetrantes del CNS tiene ventajas considerables en términos de posibles efectos secundarios2,17,32. Una posible alternativa a la inyección periférica, evitando las salvedades de técnicas invasivas, es la entrega intratecal, que consiste en entrega del vector AAV en el líquido cefalorraquídeo. Esta ruta de entrega ha demostrado para ser eficaz, mostrando expresión generalizada del transgen en el SNC, menos efectos off-target en órganos periféricos y bajos niveles de respuesta inmune42. Sin embargo, las inyecciones intratecales son mucho más difícil, ya que requieren mayores conocimientos técnicos que la inyección de la vena de la cola.
Desarrollo posterior de la cápside a perfeccionar esta tecnología será conducido por las oportunidades para el uso del vector AAV en usos de la terapia génica. Estos enfoques ofrecen atractivas posibilidades para tratar trastornos de CNS actualmente incurables, como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer18.

En los últimos 30 años, tipo de aireación ha sido diseñados para crear vectores AAV recombinantes, que han demostrado para ser excepcionalmente útiles para la transferencia de genes en el CNS de1,2,3,4, 5,6 y gene terapia se acerca a la enfermedad (incluyendo terapias aprobadas por la FDA y EMA)4,7. Su idoneidad para el uso en el SNC deriva en gran parte de su capacidad de infectar las células no se dividen, poste-mitotic, suelen encontrarse en el CNS8. Sin embargo, los vectores de AAV tienen también la ventaja de permitir una expresión a largo plazo de cualquier transgen terapéutico dado4,9 , mientras que una respuesta inmune más suave en comparación con otros vectores virales7, 8,10,11,12.
Los elementos principales de cualquier vector AAV son el genoma y la cápside. Aireación de tipo salvaje es monocatenario (ss) virus de la DNA con un genoma de aproximadamente de 5 kilobases (kb)13. Para la producción de vectores AAV recombinantes, los genes rep y cap (necesarios para la replicación del genoma y el ensamblaje de la cápside viral) son eliminados del genoma de la AAV de tipo salvaje y proporcionados en el transporte, dejando espacio para un cassette de expresión que contiene el transgén14,15. Las secuencias repetición terminal invertidas (RTI) del genoma viral original son los únicos elementos retenidos en un vector AAV, ya que son esenciales para la replicación y embalaje3,10,14. Vectores AAV pueden diseñarse para mejorar la expresión del transgen; una mutación en uno de los ITRs conduce a la formación de un lazo de horquilla que efectivamente permite la generación de un complementario DNA filamento3,7,15. La principal ventaja de esta configuración, como un genoma de uno mismo-complementarios (sc), es que ignora la necesidad de síntesis del segundo filamento típico en el ciclo de vida convencional de aireación, aumenta considerablemente la velocidad y los niveles de expresión del transgen 1. sin embargo, el uso de un genoma de scAAV reduce la capacidad de carga del vector 2,4 kb aproximadamente. Esto incluye el transgen secuencias, así como cualquier secuencias reguladoras tales como promotores o sitios de unión de microARN, para limitar la expresión de tipos específicos de la célula16.
La cápside AAV determina la interacción de la célula de vector-host y confiere un grado de tropismo de tejido o tipo celular para un serotipo de la AAV, que también puede ser explotada para limitar la expresión del transgén a lugares específicos. Varios serotipos AAV se encuentran en la naturaleza, mientras que otros han sido producidos en laboratorios a través de enfoques recombinantes (es decir, PHP. B). Además, algunos cápsida también confiere otras características útiles, tales como la capacidad para cruzar el BBB, resultando en la entrega de los transgenes en el SNC después de la administración sistémica. Esto se ha demostrado para AAV9, así como el recientemente descrito PHP. B cápsida17. Como consecuencia, estos serotipos están demostrando para ser particularmente relevante para los nuevos enfoques de la terapia del gene para neurodegenerativas trastornos1,17,18.
El objetivo de este protocolo es describir un método rentable para la producción en pequeña escala de los vectores AAV con alto título y pureza. Aunque los resultados presentados aquí usan el PHP. Cápside de B y un cassette de expresión scAAV, el protocolo es conveniente para la producción de varios serotipos del vector AAV y configuraciones de genoma, lo que permite máxima flexibilidad experimental. Sin embargo, el rendimiento de vector y la pureza final pueden variar según el serotipo solicitado.
El protocolo sí mismo es una variante del método clásico tri-transfección para la producción de vectores virales e incorpora el uso de un gradiente de iodixanol para vector de limpiar, que, en comparación con el clásico uso de gradientes de cesio cloruro (CsCl), ha sido divulgado para producir vectores AAV de mayor pureza en una manera más eficiente19,20,21.
Los pasos de la transfección, la purificación y la concentración se pretenden realizarse según buenas prácticas de laboratorio (BPL) en un laboratorio de cultivo de tejidos para trabajo de vector viral. Cada tarea debe realizarse en cumplimiento de la legislación nacional y local relativas a la producción de vectores virales y utilizar. Trabajo debe realizarse bajo una campana de flujo laminar y en condiciones estériles. Dentro de las instalaciones de vector, se recomienda usar un delantal de laboratorio, además de la bata de laboratorio regular cultivo de tejidos. Por otra parte, un doble par de guantes y botas de plástico, se debe usar en todo momento.
Antes de comenzar la producción de vectores, asegurar todo el equipo necesario y los plásmidos son disponibles. 1) pCapsid plásmido contiene el gen rep que codifica cuatro proteínas no estructurales necesarias para la replicación, es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40 y el gen de tapa que codifica tres proteínas estructurales de la cápside, a saber, VP1, VP2 y VP3. 2) pHelper plásmido contiene los genes E4, E2Ay VA de adenovirus, que facilitan la producción de AAV en células HEK293T. 3) pTransgene plásmido contiene el casete de expresión de transgenes, flanqueado por dos RTI. Estos plásmidos pueden ser sintetizados de novo en el laboratorio utilizando secuencias disponibles en línea22. Para plásmidos hacen de novo, especialmente aquellos que contienen transgenes novela, secuenciación es necesaria, para asegurarse de que el transgen y RTI es correctos. Alternativamente, premade plásmidos pueden adquirirse directamente a través de repositorios de plásmido en línea. Cuando sea necesario, plásmidos pueden ser amplificados y purificaron usando kits estándar, según las instrucciones23 el fabricante.
Título del vector y la pureza pueden afectar negativamente la capacidad de transducción de los vectores. Protocolos adicionales se suministran para evaluar la calidad del vector producido. Los vectores finales será útiles para estudios de la función de la célula del CNS en aplicaciones tanto in vitro e in vivo .

<table><tbody><tr><td><Producción >plásmido fuerte</</td>pP><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strongDiseño transgénico</td><td>Diseño de novo u obtenido de un repositorio de plásmidos</td><td>N/A</td><td>Consulte el paso 1 del protocolo principal para obtener más detalles</td></tr><tr><td>Diseño de pCapsid</td><td>De novo u obtenido de un repositorio de plásmidos</td><td>N/A</td><td>Consulte el paso 1 del protocolo principal para obtener más detalles</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV Helper-Free System</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular y transfección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM), alto contenido de glucosa, sin glutamina</td><td>Life technologies</td><td>11960-044</td><td>Complemente DMEM con FBS (1% o 10% v/v) y GlutaMAX 200 mM (1% v/v) y luego filtre la esterilización del medio utilizando un 0.22 &micro; m filter</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplemento</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro de vacío con tapa de botella Corning</td><td>Sigma-Aldrich CLS430769</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) sin calcio ni magnesio</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>células HEK293T</td><td>Colección Americana de Cultivo de Tejidos CRL3216</td><td></td><td>Una vez recibidas, descongele las células y el cultivo como se describe en el protocolo. Después de un número mínimo de pasajes, congele una subfracción para el futuro en alícuotas. Utilice siempre las celdas por debajo del pasaje número 20. Una vez que las células cultivadas se hayan pasado más de 20 veces, reinicie un cultivo a partir de las alícuotas almacenadas</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>Placas de cultivo de 15 cm de diámetro</td></tr><tr><td>Rascadores celulares</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>El PEI en forma de polvo se disuelve en 1 &micro; g/&micro; L en agua desionizada (ddagua) a pH=2 (usar HCl). Preparar en un vaso de precipitados y remover durante 2-3 h. Cuando se disuelve, vuelva a llevar el pH a 7 con NaOH. Filtre, esterilice y almacene la solución madre resuspendida en alícuotas de 1 ml a -20 °C. Las alícuotas de PEI pueden 
 se puede congelar/descongelar varias veces.</td></tr><tr><td>Solución Virkon</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>Desinfecte cualquier material que haya estado en contacto con partículas vectoriales ensambladas con</td></tr><tr><td>delantales de manga larga</td> Virkon solution Mutexi <td>Fisher Scientific</td><td></td><td>11735423 Use un delantal sobre una bata de laboratorio normal</td></tr><tr><td>Cubrezapatos desechables de máxima protección Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific 15401952</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>AAV Purificación y desalinización</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep es una solución al 60% (p/v) de yodixanol en agua (estéril). CAUTELA. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Phenol rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>PRECAUCIÓN. Usar debajo de una campana de flujo laminar</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Z627992 Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>OptiSeal Tubos de polipropileno</td><td>Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (250 U/&micro; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Suministrado como solución lista para usar Filtro de</td></tr><tr><td>jeringa Acrodisc Jeringa</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix (5 mL)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de jeringa roma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>Aguja de jeringa de acero inoxidable 316, pipeteo romo de 90 grados; calibre de punta 16, L 4 in. Referida en el texto como una aguja de extremo romo</td></tr><tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>Agua estéril libre de endotoxinas. Denominado "agua ultrapura"</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo ultra-15 de Amicon</td><td>Millipore UFC910024</td><td></td><td>Estos filtros concentran el producto final mediante la recogida de las partículas vectoriales en pasos de centrifugación consecutivos</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>Surfactante no iónico. Diluir en PBS estéril para usar al 0,01 % (v/v)</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estériles de Fisherbrand con tapones de rosca (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>Utilice tubos con faldón para facilitar su manejo</td></tr><tr><td><strongstrong>AAV Titulación </td>Enzima de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>restricción: StuI (10 U/&micro; L)</td> <td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (1 U/&micro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>Reconstituir en agua ultrapura y utilizar en una concentración final de 10 mg/mL. La solución se puede almacenar a -20 °C; C</td></tr><tr><td>Tiras de tubo EasyStrip Plus (con tapas adjuntas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo Eppendorf 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche</td><td></td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Placas Multipocillo, 96 pocillos</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>Placa de polipropileno blanco (con código de barras de identificación único)</td></tr><tr><td>Placa de PCR Microseal 'A' y película de sellado de placa de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>AAV Control de pureza </fuerte></td>Persulfato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Reconstituir en agua ultrapura al 10% (v/v). CAUTELA. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>PRECAUCIÓN. Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Tris Base ULTROL Grado</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>PRECAUCIÓN: Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>Solución madre acuosa de acrilamida y bisacrilamida al 30% en una proporción de 37,5:1. PRECAUCIÓN: Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus marcador prestained</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>ATENCIÓN: Úselo debajo de una campana de flujo laminar. Use guantes</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Synaptic Systems</td><td>132002</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Anti-conejo Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>dilución 1:1,000</td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Número de catálogo </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Vector production lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa Rotina 380 *</td>Ultracentrífuga <td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 *</td>Rotor de titanio de ángulo fijo <td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Type 50.2 Ti *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris digital escala *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua tibia *</td><td></td><td></td><td>Ajustado a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Cubitera *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>Mantenga el material utilizado en el laboratorio de producción de vectores separado del utilizado en las áreas de laboratorio estándar</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156.400</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>Capacidad de 5 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>Capacidad de 10 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>Capacidad de 25 mL Incubadora</td></tr> de <tr><td>CO2 CB150 *</td><td>Binder</td><td>9040-0038</td><td>Set a 37 &00 grados; C, 5 % de CO2 y 95 % de humedad Armario</td></tr><tr><td>de seguridad Nuaire NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>Limpie todas las superficies con etanol al 70% y Virkon antes y después de su uso</td></tr><tr><td>Convencional </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador T100 *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>Para usar con geles hechos a mano o prefabricados</td></tr><tr><td>ProteoSilver kit de tinción de plata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>Detección de proteínas de alta sensibilidad con bajo fondo</td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R * </td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>Centrífuga de alta velocidad para necesidades de capacidad media (hasta 250 mL)</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Pipetas graduadas Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Puntas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 y micro; L</td></tr><tr><td>Puntas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &micro; L</td></tr><tr><td>Puntas de filtro *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>Cubitera con tapa *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>Mini bomba de vacío de membrana, VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* Los materiales marcados con un asterisco son equipos costosos y, por lo general, son elementos de infraestructura central compartidos entre varios laboratorios. Estos artículos también pueden ser reemplazados por equivalentes si están disponibles. Tenga en cuenta que cuando se utiliza una ultracentrífuga diferente, se debe tener cuidado de seleccionar el rotor y los tubos de centrífuga correctos.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

producción, purificación y control de calidad de vectores de base de virus adeno-asociado

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Herramientas de entrega genética basadas en virus adeno-asociados (AAVs) son una opción popular para la entrega de los transgenes a sistema nervioso central (SNC), incluyendo aplicaciones de terapia génica. Vectores AAV son capaces de infectar células divisorias y no dividir y dar expresión de transgenes a largo plazo, no replicar. Importantemente, algunos serotipos, como el PHP nuevamente descrito. B, puede cruzar la sangre-barrera hematoencefálica (BBB) en modelos animales, después de la entrega sistémica. Vectores AAV se pueden producir eficientemente en el laboratorio. Sin embargo, protocolos robustos y reproducibles se requieren para obtener los vectores AAV con suficientes niveles de pureza y los valores de titulación lo suficientemente altos como para aplicaciones en vivo . Este protocolo describe una estrategia eficiente y reproducible para la producción de vectores AAV, basada en una estrategia de purificación gradiente iodixanol. El método de purificación de iodixanol es adecuado para la obtención de lotes de los vectores AAV alto-título de alta pureza, en comparación con otros métodos de purificación. Además, el protocolo es generalmente más rápido que otros métodos descritos en la actualidad. Además, una cuantitativa de polimerasa de la cadena de reacción (qPCR)-estrategia por turnos se describe para que una determinación rápida y precisa de la titulación de vectores, así como un método de tinción de plata determinar la pureza del lote de vector. Finalmente, resultados representativos de la entrega del gene para el CNS, después de la administración sistémica de AAV-PHP. B, se presentan. Estos resultados deberían ser posibles en todos los laboratorios utilizando los protocolos descritos en este artículo.

AAV9 era considerado, hasta hace poco, que el serotipo más eficaz de vector AAV en cruzar el BBB y transducción de las células del SNC, después de la administración periférica. Se logró un avance significativo en el diseño de la cápside cuando Deverman reportaron el uso de un método de selección de cápside llamado Cre evolución basada en la recombinación de orientada a AAV (crear)17. Usando este método, se identificó una nueva cápside, llamada PHP. B, que informó como capaces de transducir la mayoría de los astrocitos y las neuronas en múltiples regiones de CNS, tras inyección sistémica17. En este punto, cabe señala que aunque PHP. B proporciona resultados positivos en ratones C57/Bl6 (que fue la cepa utilizada en los experimentos de aislamiento inicial), los informes preliminares sugieren que su eficacia puede variar de una manera dependiente de la cepa. Otros experimentos, sin duda, arrojará más luz sobre este tema31.
Sin embargo, a pesar de estos problemas, PHP. B ofrece interesantes posibilidades para la manipulación de la genética no invasiva en el SNC de ratones, incluyendo experimentos de terapia génica de prueba de concepto en modelos de la enfermedad. Como tal, decidimos evaluar la eficacia de la expresión del transgen mediante PHP. B versus AAV9, que ha sido el vector 'patrón oro' para la transducción de la CNS después de la administración periférica desde 20092. Para realizar una comparación directa de ambos serotipos, en condiciones óptimas para la expresión del transgen, usamos una sc genoma configuración32. Ambos vectores llevaron el transgen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor omnipresente pollo β-actina (CBA). Mujer ratones C57/Bl6 en día postnatal 42 (aproximadamente 20 g de peso) recibieron una dosis de 1 x 1012 vg por ratón de cualquier scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP. Administración de vector fue realizado mediante inyección en la vena la cola. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética de la KU Leuven.
Postinjection de tres semanas, los ratones experimentaron transcardial perfusión con PBS helado, seguido por paraformaldehído al 4% (w/v) helado (PFA). Sus cerebros fueron cosechados y experimentaron más postfixation por una incubación durante la noche en el mismo fijador, antes de transferir al 0.01% (p/v) Na-azida/PBS para el almacenamiento hasta su análisis posterior. Después, los cerebros se seccionaron con un microtomo vibratorio y immunohistochemistry fue realizado en secciones gruesas de 50 μm.
Para evaluar los niveles de expresión del transgen, las secciones fueron teñidas con anticuerpos primarios contra GFP (conejo anti-GFP), con detección mediante anticuerpos secundarios conjugados a un colorante fluorescente (anti-conejo Alexa Fluor 488) (Figura 4A, B ). Las mediciones de intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias [au]) confirmaron un aumento significativo en la expresión de GFP cuando un sc genoma y el PHP. Cápside de B fueron utilizados en relación con AAV9. Se observaron aumentos en la GFP en el cerebro (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; p = 0.0032), cerebelo (± 196 2601 vs 1737 au ± 135; p = 0.0032) y el tronco encefálico (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p = 0.0038) (figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> Figura 4: entrega sistémica de scAAV2/PHP. B-CBA-GFP conduce a una alta expresión de GFP en el SNC. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP o scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 vg/ratón) fue administrado a ratones C57/Bl6 de 6 semanas de edad vía la inyección de la vena de la cola. GFP fue detectada usando immunohistochemistry en postinjection de 3 semanas de secciones coronales de cerebro. (A) el cerebro y (B) se muestran el cerebelo y el tronco encefálico. Barras de escala = 1 mm. (C) se realizó la cuantificación de la intensidad de fluorescencia relativa para determinar los niveles de señal GFP conseguido cada vector (10 secciones por ratón; tres ratones por grupo del vector). Se realizó una prueba ANOVA unidireccional, seguido de un Student dos colas t-prueba; los datos se expresan como media ± desviación estándar; p &lt; 0.01; au. unidades arbitrarias. pCapsid, utilizado para la producción del vector AAV, contiene el gen rep de serotipo 2 y el gen cap de serotipo PHP. B o AAV9, por consiguiente. Esta figura ha sido modificada desde Rincon et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Siguiendo este protocolo, el usuario podrá producir vectores AAV de alta pureza y rendimiento adecuados para aplicaciones in vitro o in vivo. Este protocolo se puede utilizar para producir y purificar una gama de serotipos AAV con diferencias en las configuraciones. La combinación de estos dos elementos puede ser útil para obtener el tipo de célula y la expresión específica del tejido.La producción de algunos serotipos puede dar a un menor rendimiento. Se trata de una producción en la que hay serotipos cercanos y se debe evaluar de forma individual. Demostrando estos procedimientos estará Shelly Fripont, un técnico de nuestro laboratorio.Después de cultivar las células HEK, mezcle 360 microgramos de plásmido auxiliar, 180 microgramos de plásmido que codifican el cácapsido vectorial y 180 microgramos de plásmido que contienen el transgén en 18 mililitros de cloruro de sodio milimolar de 150 milivolares para preparar la mezcla de ADN. Distribuya esta mezcla en tres tubos cónicos de 50 mililitros. En un nuevo tubo cónico, mezcle 840 microgramos de PEI y seis mililitros de cloruro de sodio de 150 milimolar para preparar la mezcla de PEI para seis platos de cultivo celular.Luego, agregue seis mililitros de la mezcla PEI, gota a gota, a uno de los tubos cónicos que contienen la mezcla de ADN. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, retire seis platos de cultivo celular de la incubadora.En una capucha de flujo laminar, aspira completamente el medio de cada plato. Enjuague los platos con cinco mililitros de DPBS precalentó para eliminar los restos del medio. Incline suavemente cada plato para asegurarse de que DPBS se distribuye uniformemente por toda la superficie.A continuación, aspira suavemente el DPBS. Agregue 12 mililitros de DMEM uno a cada plato lentamente, con una pipeta colocada en el borde del plato. Mezclar la mezcla de PEI y ADN pipeteándola hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces.Añadir dos mililitros de esta mezcla a cada uno de los seis platos de cultivo celular de una manera gota a gota, asegurándose de distribuir cuidadosamente sobre toda la superficie. Repita este proceso utilizando seis platos de cultivo celular a la vez hasta llegar a 18 platos de cultivo celular. Agitar suavemente los platos de cultivo celular para distribuir la mezcla de ADN PEI.Incubar las células trans infectadas a 37 grados centígrados con un 95 por ciento de humedad y un cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de esto, añadir 12 mililitros adicionales de DMEM 10 a cada uno de los 18 platos sin quitar el medio preexistente. Continuar incubando las células trans infectadas en las mismas condiciones.A las 72 horas después de la transfección, utilice un rascador celular para separar cuidadosamente las células de cada plato de cultivo. Recoger el medio y las células de dos platos de cultivo en un tubo cónico de 15 mililitros, mantenido en hielo. Centrifugar los tubos a 420 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos con la aceleración y desaceleración de la centrífuga ajustada al máximo.Deseche cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo vertiéndolo suavemente en un recipiente de eliminación de residuos. Luego, coloque los tubos que contienen los pellets celulares sobre el hielo. Suspendemos cada pellet en dos mililitros de tampón de lelisis y mezclamos pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces.Tire del AAV de tres tubos, juntos. Para comenzar, congele las células re-suspendidas colocándolas en un cubo que contenga hielo seco mezclado con etanol. Luego descongela las células colocándolas inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados.Repita este ciclo de congelación y descongelación tres veces para anule las células y libere las partículas AAV. Después del tercer paso de descongelación, centrifugar a 1167 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes para limpiar los tubos cónicos de 50 mililitros.Añadir nucleasa a cada tubo a una concentración final de 50 unidades por mililitro de sobrenadante. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos, mientras se arremolinan los tubos cada 10 minutos para asegurarse de que la nucleasa se mezcle a fondo con el sobrenadante. Centrifugar a 13490 veces G y a cuatro grados Celsius durante 20 minutos para aclarar el sobrenadante.Después de esto, retire el émbolo de una jeringa de 10 mililitros, conecte un filtro de 0,45 micrómetros a la jeringa y colóquelo encima de un tubo cónico limpio de 50 mililitros. Llene cuidadosamente la jeringa con el sobrenadante clarificado. Utilice el émbolo para forzar el izado a través del filtro.A continuación, prepare cada una de las fracciones de yodoxanol en cuatro tubos cónicos separados de 50 mililitros, como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Pipeteo ocho mililitros de 15 por ciento de yodoxanol en cada uno de los tres tubos de ultracentrífuga. Pipetear 5,5 mililitros de 25 por ciento de yodoxanol en un tubo cónico limpio de 50 mililitros.Usando una pipeta Pasteur no graduada, capa cuidadosamente 5.5 mililitros de 25 por ciento de solución de yodoxanol por debajo de la solución de iodixanol al 15 por ciento. Agregue las soluciones del 40 por ciento y el 60 por ciento como se describe en el protocolo de texto. Las fracciones de iodixanol no deben mezclarse en capas.Usando una pipeta Pasteur, capa el lisato crudo en la parte superior del gradiente de iodixanol del 15 por ciento, gota a gota, para evitar perturbar la interfaz entre el lisato crudo y la solución de iodixanol. Llene cada tubo de ultracentrifugación con tampón de lysis hasta que el menisco alcance la base del cuello del tubo, para asegurarse de que el tubo no se derrumbe bajo las fuerzas muy altas generadas durante la ultracentrifugación. Cierre los tubos con las tapas adecuadas.Con una báscula digital, asegúrate de que los tres tubos de ultracentrifugación tengan el mismo peso. Ajustar el peso según sea necesario, añadiendo más tampón de lelisis en la parte superior del alisla bruta. Utilice un rotor de titanio de ángulo fijo para centrifugar los tubos a 301580 veces G y a 12 grados Celsius durante una hora y 40 minutos utilizando la máxima aceleración y desaceleración.A continuación, coloque una aguja en una jeringa de cinco mililitros. Retire el espaciador de los tubos del rotor y recupere los tubos después de la centrifugación. Aspirar sólo la fracción de yodoxanol del 40 por ciento que contiene las partículas vectoriales.O procesa la muestra o guárdala a cuatro grados centígrados. Aquí, se demuestra un protocolo que se puede utilizar para producir vectores AAV con una variedad de capsidos, configuraciones de genoma, tipos de promotores y cargas transgén. En este ejemplo, producimos y purificamos dos vectores AAV diferentes que expresan la proteína fluorescente verde a partir de un genoma autoconsuado.Los dos vectores se distinguen por diferentes capsids:PHPB y AAV9. Fueron entregados, a través de la inyección de la vena de la cola, en adultos C57 negros seis ratones. Para evaluar los niveles de expresión transgénica tres semanas después de la inyección, las secciones se tiñen con anticuerpos primarios contra la GFP con la detección mediante anticuerpos secundarios conjugados con un tinte fluorescente.Las mediciones de intensidad de fluorescencia muestran un aumento significativo en la expresión GFP cuando se utiliza el vector PHPB en relación con AAV9. Se observaron aumentos de la GFP en el cerebro, el cerebelo y en el tronco cerebral. La recopilación precisa del vector que contiene la fracción es crucial para este protocolo.En caso de que esto no se haga correctamente, el rendimiento del vector, así como la pureza del vector se ven afectados negativamente. Al ser capaz de producir vectores AAV, pequeños laboratorios estarán en condiciones de aprovechar numerosas posibilidades experimentales para entregar genes en el sistema nervioso central. Este protocolo requiere el uso de una ultracentrífuga y es importante recibir un entrenamiento adecuado antes de manejar esto para evitar accidentes.Además, los vectores AAV a menudo se clasifican como peligros biológicos y, por lo tanto, debe consultar las regulaciones locales antes de manipularlos y gestionarlos.

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Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Se presenta un protocolo para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad que carecen de todas las secuencias codificantes virales. La clonación de los transgenes contenidos en el genoma del vector se basa en endonucleasas homing. La amplificación del virus en células productoras cultivadas como células adherentes y en suspensión se basa en un virus auxiliar que proporciona genes virales en trans.

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .

Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

En este protocolo se describe la producción, purificación y valoración de lentiviral vectores. Se presenta un ejemplo de entrega gen vector lentiviral mediada por neuronas cultivadas en la enseñanza primaria y astrocitos. Nuestros métodos pueden aplicarse también a otros tipos de...

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Aprenda a producir y purificar vectores de virus adeno-asociado de alta pureza y título usando células HEK. Este protocolo permite obtener expresión génica específica de tejido para aplicaciones de terapia génica.

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

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