Name: Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a evaluar la función citolítica de células asesinas naturales placentarias de rata mediante un ensayo colorimétrico en placa. Este método simple y económico permite comparar la citotoxicidad sin equipos especializados.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de pulmón y sangre del corazón de los institutos nacionales de salud bajo la subvención R00HL130456, el Instituto Nacional de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo el premio P20GM104357, y por el Mississippi INBRE, financiado por un premio de desarrollo institucional (IDeA) de los institutos nacionales de ciencias médicas generales de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P20GM103476. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales en el centro médico de la Universidad de Mississippi. El cuidado y el manejo de los animales estaban de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud para el tratamiento ético de los animales.
1. aislamiento de células linfocitas de placentas
<ol><li>Retire una placenta del útero de la rata (día de gestación 19) y colóquelo en 10 mL de PBS8frío-hielo.</li>
	<li>Colocar una placenta en un filtro de 100 μm y sentarse en una placa de Petri que contenga 13,5 mL de RPMI y 1,5 mL de FBS (el volumen total es de 15 mL). Utilice el lado plano de un émbolo de la jeringa para empujar la placenta a través del filtro a la placa de Petri.</li>
	<li>Prepare tubos cónicos de 3 15 mL para cada tejido. Añadir 3 mL de medio degradado de densidad (ver tabla de materiales) a cada tubo, luego superponer cuidadosamente 5 ml de placenta homogeneizada en cada tubo.</li>
	<li>Centrifugar durante 25 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT) sin freno. Recoge la fina capa blanca de la Buffy con una Piera de transferencia. Nota: Después de la centrifugación, se ven 3 capas, el RPMI rojo en la parte superior, la capa blanca de la Buffy en el centro y la capa media de gradiente de densidad clara en la parte inferior. Utilice una Piera de transferencia para extraer la capa blanca de la Buffy del tubo. Combine la capa Buffy de todos los tubos de la misma placenta en 1 tubo.</li>
	<li>Añada 10 mL de RPMI a las capas de Buffy combinadas. Centrifugar durante 10 min, 300 x g, a 4 ° c y descartar sobrenadante.</li>
</ol>2. aislamiento de las células asesinas naturales
<ol><li>Resuspendio el pellet de células en 50 μL de PBS helada</li>
	<li>Agregue anticuerpos CD3 con etiqueta de biotina a las células peletizadas según el protocolo del fabricante y mezcle bien con una Piera. Colocar el tubo en un rotador de tubos e incubar 20 min a 4 ° c.</li>
	<li>Añadir 1 mL de RPMI, centrifugar durante 10 min a 400 x g y 4 ° c, y desechar sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend pellet en 1 mL de RPMI y combine con 150 μL de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Colocar el tubo de microcentrífuga en un rotador de tubos y rotar mientras se incube durante 30 min a 4 ° c. Nota: Extraiga el búfer de liberación en este momento y permita que llegue a RT en el gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Coloque los tubos en el imán durante 1 min. recoja el sobrenadante y Ahorre la población de células CD3 en un tubo de 15 mL sobre hielo. Nota: Esta es la población CD3 de células.</li>
	<li>Extraer el tubo del imán y añadir 1 mL de RPMI. Mezcle las células y las perlas 5 veces con una picada.</li>
	<li>Repita el paso 2,5.</li>
	<li>Centrifugar el CD3- población de células durante 10 min a 400 x g y 4 ° c y desechar sobrenadante. Resuspend el pellet de células en 50 μL de PBS helado</li>
	<li>Agregue el anticuerpo CD161a con etiqueta de biotina a las células CD3de acuerdo con el protocolo del fabricante y mezcle bien. Colocar el tubo en un tubo rotador e incubar durante 20 min a 4 ° c.</li>
	<li>Añadir 1 mL de RPMI, centrifugar durante 10 min a 400 x g y 4 ° c, y desechar sobrenadante. Resuspend pellet en 1 mL de RPMI y combine con 150 μL de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Coloque el tubo de microcentrífuga en un rotador de tubo y gire mientras se incube durante 30 min a 4 ° c.</li>
	<li>Coloque los tubos en un imán durante 1 min. recoja el sobrenadante y deseche las células CD3-/Cd161a.</li>
	<li>Extraer el tubo del imán y añadir 1 mL de RPMI. Mezcle las células y las perlas 5 veces con una picada.</li>
	<li>Repita el paso 2,12.</li>
	<li>Retire los tubos de microcentrífuga del imán y añada 1 mL de tampón de liberación RT. Coloque el tubo en el tubo rotador y gire mientras se incube durante 15 min en RT.</li>
	<li>Coloque los tubos en el imán durante 1 min. recoja el sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 15 mL sobre hielo. Nota: Esta es la población de células NK.</li>
	<li>Extraer el tubo del imán y añadir 1 mL de RT RPMI. Mezcle las células y las perlas 5 veces con la picada.</li>
	<li>Repita el paso 2,16, colocando sobrenadante en el mismo tubo. Mezcle bien y tome una muestra de 20 μL para contar las células Nota: Mantenga el tubo sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar CD3-/Cd161a+ células durante 10 min, 400 x g a 4 ° c, luego retire el sobrenadante. Resuspend las células en RPMI (10% FBS, 1% Pen/Strep, 2 ng/mL IL-2) y la semilla a una concentración de 3 x 105 células/pozo en una placa de 6-well en 2,5 ml de los medios de activación de célula NK. Incubar las células para 48 h a 37 ° c, 5% CO2 en una incubadora humidificada.</li>
</ol>3. ensayo de citotoxicidad: recuperar células NK o YAC1 de cultivo o pasar células
Nota: Todos los pasos deben ser conducidos bajo el capó. Todos los tubos celulares deben mantenerse en hielo en todo momento.
<ol><li>Utilice una Pipet serológica de vidrio para recolectar YAC1 células y medios del matraz, colóquelo en un tubo de 50 mL sobre hielo y mezcle bien. Tomar 20 μL para contar las células.</li>
	<li>Gire las células YAC1 durante 10 min a 300 x g y 4 ° c. Cuente las celdas mientras estas giran.</li>
	<li>Agregue tripsin/EDTA a cada pozo en una placa de 6 pozo de celda NK. Toque la placa y colóquelo en la incubadora.</li>
	<li>Después de que las células hayan incubado con tripsina/EDTA durante ~ 5 min a 37 ° c, raspe la placa/matraz con un raspador de placa estéril. Añada 1 mL de NK cell media a cada pozo.</li>
	<li>Recoja las células y los medios con Pipet serológico y recoja en un tubo centrífugo de 15 mL. Tomar 20 μL para contar las células.</li>
	<li>Gire las células NK durante 10 min, 400 x g a 4 ° c. Cuente la muestra de células del paso 3,5 durante esta centrifugación. Nota: Vea las placas de cultivo bajo un microscopio antes de desecharlas para asegurarse de que no haya más células adheridas al fondo de los pozos. Dado que el experimento utiliza celdas NK y celdas YAC1, asegúrese de contar cada una por separado.</li>
	<li>Recuento de células y resuspendio a las concentraciones determinadas en ensayos de optimización para comprobar el número adecuado de objetivo: relación efector. Esto se logrará volviendo a suspender el pellet en sus medios correspondientes para realizar las siguientes concentraciones celulares: YAC1 a 4 x 105 células/ml y células NK a 2 x 107 células/ml.</li>
</ol>4. ensayo de citotoxicidad: Protocolo de ensayo
<ol><li>Utilice una placa inferior redonda, tratada con cultivo 96-pozo para configurar la placa como se sugiere en la tabla 1. Esta tabla muestra los controles experimentales y 3 conjuntos de columnas experimentales NK. Esto se puede ampliar a un total de 10 columnas experimentales NK en una placa de 96-well.</li>
	<li>Centrifugar la placa de ensayo a 250 x g durante 4 min para estar seguro de que el efector y las células objetivo están en contacto. Incubar la placa de 96-Well durante 5 horas en una incubadora de cámara humidificada a 37 ° c, 5% CO2 para lograr un amplio contacto entre las células diana y efector y la lisis celular Diana por las células efectoras. Nota: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>45 min antes de los sobrenadentes de cosecha, agregue 10 μL de solución de lisis de 10x a los pozos de liberación máxima de la célula diana (Wells 1E, 1F, 1G y 1H) y coloque la placa de nuevo en la cámara humidificada.</li>
	<li>Una vez finalizado el tiempo de incubación, Centrifugue la placa a 250 x g durante 4 min usando un pipeteador multicanal, transfiera 50 μl desde todos los pozos a una placa de ensayo de 96-pozo plano de fondo fresco. Nota: No toque la parte inferior de los pozos para que las células no se transfieran a la placa de ensayo fresca. No utilice una placa tratada cultivada como placa de ensayo fresca.</li>
	<li>
Hacer reactivo de ensayo.
	<ol>
<li>Después de que el buffer de ensayo haya alcanzado la temperatura ambiente, añada 12 mL de tampón de ensayo a una botella de sustrato Mix. Invierta y agite suavemente hasta que se disuelva completamente. 1 frasco es suficiente para placas de 2 96-well. Nota: El buffer del ensayo debe protegerse de la luz mientras se descongele. Mezclar inmediatamente antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 50 μL de reactivo de ensayo a todos los pozos de la placa de ensayo desde el paso 4,6. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Nota: El reactivo de ensayo recién hecho debe almacenarse en un congelador. El reactivo es bueno durante aproximadamente 8 semanas.</li>
	<li>Añadir 50 μL de solución de parada a cada pozo. Leer la placa dentro de 1 hora después de añadir la solución STOP y registrar la absorbancia a 490 nm. Los datos representativos se muestran en la tabla 2.</li>
</ol>5. cálculo de resultados
<ol><li>Calcule el valor medio de absorbancia de los pozos de fondo medio de cultivo y reste de todos los valores de absorbancia para los pozos de liberación de LDH de célula de efecto experimental, liberación espontánea de células diana y célula de efector.</li>
	<li>Calcule los valores medios de absorbancia para los pozos de control de corrección de volumen y reste de los valores de absorbancia adquiridos para los pozos de control de liberación máxima LDH de célula objetivo.</li>
	<li>Utilice los valores corregidos de los pasos 5,1 y 5,2 en la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de citotoxicidad para cada efector: bien objetivo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

Ningún conflicto de intereses, financiero o de otro tipo, son declarados por los autores.

Hay una serie de notas clave importantes a tener en cuenta para obtener resultados óptimos. La esterilidad de las células utilizadas es muy importante. Después de la recolección de la placenta, es importante que la preparación y el aislamiento de las células NK se realicen en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Además, debido a que todas las células liberan LDH sobre el daño celular, se debe tener cuidado para obtener una alta viabilidad de las células NK después del aislamiento y durante el proceso de ...

La preeclampsia es un trastorno hipertensivo del embarazo caracterizado por la restricción del crecimiento fetal, el daño al órgano final y la activación inmunitaria crónica. La activación inmunitaria crónica en mujeres con preeclampsia conduce a un aumento de la circulación y citoquinas inflamatorias placentarias, un desequilibrio en las poblaciones de células T CD4+ , y un aumento de la población de las células de Killer natural activado (NK)1. Los estudios recientemente publicados por nuestro laboratorio demuestran un papel para las células NK en la causa de parte de la fisiopatología asociada con la preeclampsia en el modelo de la rata de la presión de perfusión uterina reducida (RUPP) de la preeclampsia. Utilizando citometría de flujo para medir la expresión superficial de los marcadores de activación en las células NK, se observó un aumento de la población de células NK activadas en la circulación y en de las ratas Rupp en comparación con las ratas embarazadas normales (NP)2.
Para confirmar las observaciones de citometría de flujo, se realizaron estudios funcionales para evaluar la actividad citotóxica de células NK aisladas de las en de ratas NP y Rupp. Hay varios métodos disponibles para la evaluación de la función citotóxica de las células T de citotóxicos CD8+ y las células NK. El estándar de oro para el análisis citotóxico funcional es el ensayo de liberación de cromo3. Otros protocolos desarrollados utilizados incluyen citometría de flujo4, citometría de imagen5, calceína Release6, y más recientemente bioluminiscencia7. Este video proporcionará un protocolo detallado sobre el uso del ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) bien establecido para medir la función citotóxica de las células NK utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad LDH disponible comercialmente.

<table><tbody><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Fisher 5408129</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L Filtro</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>Malla de Nylon</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 mL</td><td>Fisher</td><td>0553859A Jeringa</td><td></td></tr> de <tr><td>3 mL</td><td>Fisher</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 50 mL</td><td>Fisher</td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>estéril, Raspador de células</td></tr><tr><td>AOPI de</td> fondo redondo <td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>celómetro Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de recuento desechables</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Citómetro de imagen de visión</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 Kit de ensayo de citotoxicidad no radiactiva</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Imán</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de citometría de flujo</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>Gradiente de densidad Medio; 4 x 250</td></tr><tr><td>mL PBS</td><td>Fisher SH3025801</td><td></td><td>10 x 500 mL</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>Sin Almohadilla</td></tr><tr><td>Ratón purificado anti-Rata CD161a</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 555006 <td></td></tr><tr><td>Ratón purificado anti-Rata CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>Rata recombinante IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 Matraz mediano</td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning 430639</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>celda YAC-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

Es bien sabido que las células del asesino natural decidua (NK) juegan un papel crítico en el establecimiento y el mantenimiento del embarazo normal. Estudios recientes han demostrado una población alterada de células NK circulantes y deciduales en mujeres que sufren complicaciones adversas en el embarazo como aborto recurrente y preeclampsia. Estudios de nuestro grupo han demostrado que la hipertensión en el embarazo está asociada con un aumento de la población de células NK activadas en la placenta basada en la expresión de marcadores de activación de superficie. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar la función citotóxica de las células NK aisladas de las en en un modelo animal parecido a la preeclampsia de isquemia placentaria inducida quirúrgicamente. Los siguientes pasos se describen detalladamente: generación de suspensión de célula única, aislamiento de células NK, estimulación ex vivo, efector: cocultivo celular objetivo y ensayo de citotoxicidad.

Las células NK placentarias obtenidas de ratas NP y RUPP fueron incubadas durante 5 h con células Diana en sus respectivos medios en una proporción de 50:1 (NK: target). La absorbancia se registró en 490 nm y los datos brutos se muestran en la tabla 2. Se calculó la absorbancia media del fondo del medio de cultivo y los pozos de control de corrección de volumen. Estos promedios se restaron de los pozos apropiados indicados en el protocolo del fabricante y se representan en el cuadro 3. L...

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar y evaluar la función citotóxica de las células asesinas naturales de las en por un ensayo de placa colorimétrica. Se eligió el modelo reducido de la rata de perfusión uterina de isquemia placentaria para demostrar el aislamiento mediado por anticuerpos y la evaluación de la función citotóxica de las células asesinas naturales.

Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

Este método ayuda a comparar la actividad citotóxica de diferentes tipos de células utilizando un método simple y económico que no requiere equipo especializado. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere el uso de materiales peligrosos, es barato, y no requiere el uso de equipos especializados. Este método se puede aplicar para medir la actividad citotóxica de otros tipos de células como EL CD8 más las células citolíticas o incluso para evaluar la muerte espontánea de las células sin incubar, sin células efectos citolíticas.Los individuos nuevos en esta técnica probablemente tendrán problemas con la optimización de la relación de célula de objetivo a efector. Mi consejo es hacer una búsqueda exhaustiva de la literatura para determinar las proporciones que se probarían al optimizar el protocolo. Aunque este método no requiere habilidades especializadas, aparte de pipetear con precisión, el aislamiento de las células mononucleares y la configuración de la placa de ensayo son pasos que pueden ser más fáciles de entender e imitar si se observan visualmente.Demostrando el procedimiento estará Chelsea Jekelley, una técnico de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, añada 13,5 mililitros de RPMI en 1,5 mililitros de FBS a un plato de Petri que contenga un filtro de 100 micrómetros. Coloque una placenta en el filtro y utilice el lado plano de un émbolo de jeringa para empujarlo a través del filtro y en la placa Petri.A continuación, establezca tres tubos cónicos de 15 mililitros para cada tejido. Añadir tres mililitros de medio de gradiente de densidad a cada tubo, y superponer lentamente cinco mililitros de placenta homogeneizada en cada tubo. Centrifugar a 300 veces G y a temperatura ambiente durante 25 minutos sin rotura.A continuación, utilice una pipeta de transferencia para recoger la capa de color blanco fino. Añade 10 mililitros de RPMI a las capas de buffy combinadas. Centrifugar a 300 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.En primer lugar, vuelva a suspender el pellet celular en 50 microlitros de PBS helado. Añadir anticuerpo CD3 con etiqueta de biotina de acuerdo con el protocolo del fabricante y mezclar bien con una pipeta. Coloque el tubo en un rotador de tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.A continuación, agregue un mililitro de RPMI. Centrifugar a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de RPMI.Combine la suspensión celular con 150 microlitros de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Transfiera el tubo a un rotador de tubo y gire mientras incuba a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, recupere el tampón de liberación y déjelo alcanzar la temperatura ambiente en un gabinete de seguridad biológica.Una vez completada la incubación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante y guardar la población de células negativas CD3 en un tubo de 15 mililitros en hielo. Retire el tubo del imán, agregue un mililitro de RPMI y use una pipeta para mezclar las células y las cuentas cinco veces.A continuación, vuelva a colocar el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante y guardar la población negativa CD3 en un tubo de 15 mililitros en hielo. Centrifugar la población negativa CD3 de células a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 50 microlitros de PBS helado. Después de esto, agregue el anticuerpo CD161A con la etiqueta de biotina a las células negativas CD3, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezcle bien. Coloque el tubo en un rotador de tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.A continuación, agregue un mililitro de RPMI y centrífuga a 400 veces G y a cuatro grados Centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de RPMI y combínelo con cuentas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque el tubo en el rotador del tubo y gire mientras se incuba a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.A continuación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoja el sobrenadante y deseche las células negativas CD3 negativas CD31A. Retire el tubo del imán, agregue un mililitro de RPMI y mezcle bien.Coloque el tubo en el imán durante un minuto, asegurándose de recoger el sobrenadante y desechar las células negativas CD3 negativas CD161A. Después de esto, retire el tubo del imán y agregue un mililitro de tampón de liberación de temperatura ambiente. Coloque el tubo sobre un rotador de tubo y gire mientras incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.A continuación, coloque el tubo en el imán durante un minuto. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo. Retire el tubo del imán, añada un mililitro de RPMI a temperatura ambiente y mezcle bien.Coloque el tubo de nuevo debajo del imán durante un minuto, asegurándose de recoger el sobrenadante en el mismo tubo cónico de 15 mililitros. Mezcle bien y tome una muestra de 20 microlitros para contar las células. Centrifugar las células a 400 veces G y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas en RPMI. Siembra las células en una placa de seis pozos a una concentración de 300.000 células por pozo en 2,5 mililitros de medios de activación de células NK. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada durante 48 horas.En una campana, utilice una pipeta serológica para transferir las células YAC1 en medios a un tubo de 50 mililitros sobre hielo y mezclar bien. Tome una alícuota de 20 microlitores para contar las células. Gire las células a 300 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Usando una pipeta serológica, recoja el sobrenadante de la placa de seis pozos de celda NK previamente preparada en tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue trypsin EDTA a cada pozo. Toque la placa y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados.Después de que las células hayan incubado con trippsina EDTA durante aproximadamente cinco minutos, utilice un rascador de placa estéril para raspar la placa. A continuación, agregue un mililitro de medios celulares NK a cada pozo. Usando una pipeta serológica, recoja las células y los medios y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Tome una alícuota de 20 microlitores para contar las células. Centrifugar las células NK a 400 veces G y a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. En primer lugar, obtener un fondo redondo, cultivo tratado 96 placa de pozo y configurarlo como se describe en la tabla uno del protocolo de texto.Centrifugar la placa de ensayo a 250 veces G durante cuatro minutos para estar seguro de que el efector y las células diana están en contacto. A continuación, incubar la placa en una cámara humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. 45 minutos antes de cosechar los sobrenadantes, añadir 10 microlitros de solución de lisis 10X a los pozos máximos de liberación de LDH de la célula objetivo y devolver la placa a la cámara humidificada.Cuando la incubación esté completa, centrifuga la placa a 250 veces G durante cuatro minutos, luego utilice una pipeta multicanal para transferir 50 microlitros alícuotas de cada pozo a una placa de ensayo inferior plana fresca de 96 pocillos. Añadir 50 microlitros de reactivo de ensayo a cada pozo de la placa de ensayo. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de esto, agregue 50 microlitros de Stop Solution a cada pozo. Asegúrese de leer la placa dentro de una hora después de agregar la solución Stop y registre la absorbancia a 490 nanómetros. Las células NK placentarias obtenidas de ratas NP y RUPP se incuban durante cinco horas con células diana en sus respectivos medios con una proporción de 50:1.Los datos de absorbancia sin procesar registrados a 490 nanómetros se muestran aquí. Se calcula la absorbancia media del fondo del medio cultural y los pozos de control de corrección de volumen, y estos promedios se restan de los pozos apropiados indicados en el protocolo del fabricante. A continuación, los valores corregidos se utilizan para obtener la citotoxicidad utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.Aunque este método no requiere habilidades especializadas, aparte de pipetear con precisión, el aislamiento de las células mononucleares y la configuración de la placa de ensayo son pasos que pueden ser más fáciles de entender e imitar si se observan visualmente. Después del aislamiento de las células NK, se podrían realizar otros procedimientos, como experimentos de co-cultivo para determinar el papel de las células NK placentarias en la atribución a la migración de trofoblastos durante el embarazo. También recogemos los medios de las células NK expandidas para evaluar la citoquinasa secretada de las células estimuladas diferencialmente.La pureza de las células aisladas también podría evaluarse a través de la citometría de flujo.

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Ensayos de citotoxicidad para medir las respuestas de las células asesinas naturales lítica de células infectadas con VIH se ve limitada por la pureza de las células diana. Estamos aquí demostrar el aislamiento de una población altamente purificada de VIH-1 primario de células T explosiones mediante el aprovechamiento de la capacidad del VIH-1 s de abajo modular CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

Este video muestra un ensayo para medir la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas utilizando la tinción de Calceína AM. La reducción del número de células cancerosas fluorescentes después del cocultivo con células asesinas naturales indica citotoxicidad mediada por células asesinas naturales hacia las células cancerosas.

Tinción de acetoximetilo de calceína para evaluar la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales hacia las células cancerosas

Este video muestra una técnica in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas (CIK) contra las células cancerosas. Tras el cocultivo de células cancerosas diana con células CIK, las células cancerosas muertas se identifican utilizando un colorante fluorescente de viabilidad y se cuantifican mediante citometría de flujo, estimando el efecto citotóxico de las células CIK.

Ensayo in vitro para estudiar la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Este video muestra la realización de un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa para determinar la citotoxicidad de las células asesinas naturales (NK) contra las células cancerosas objetivo. El ensayo cuantifica la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa citoplasmática de las células cancerosas midiendo la absorbancia del producto de color rojo formado.

Un ensayo in vitro para evaluar la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas

El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

La evasión de la erradicación mediada por células mortales por asesinos naturales (NK) por las células cancerosas es importante para la iniciación y progresión del cáncer. Aquí, presentamos dos protocolos no basados en la radiactividad para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK hacia las células tumorales hepáticas. Además, se presenta un tercer protocolo para analizar la migración de células NK.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a evaluar la función citolítica de células asesinas naturales placentarias de rata mediante un ensayo colorimétrico en placa. Este método simple y económico permite comparar la citotoxicidad sin equipos especializados.

Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de citotoxicidad basada en placas para la evaluación de la función citolítica de la célula asesina natural placentaria de rata

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