Medición de la forma y el tamaño de las partículas de lodo activado inmovilizado en Agar con una tubería de Software de código abierto

El tamaño y la forma de las partículas de lodos activados son fundamentales para la eficiencia del tratamiento de aguas residuales. Sin embargo, su medición es a menudo ad hoc. Este protocolo proporciona una medida repetible, bien definida y semiautomática para su medición.

La principal ventaja de este protocolo es que puede medir una gran población de partículas en una amplia gama de morfologías al tiempo que reduce el sesgo subjetivo y sistemático. Si bien esta técnica se centra en los lodos activados, técnicamente cualquier cosa que tenga la misma morfología de partículas como los microplásticos se puede medir con este método. Al intentar esta técnica por primera vez, intente hacer una placa a la vez y practique los movimientos físicos de hacer esa placa.

Además, tómese su tiempo con la microscopía. La versión de vídeo de este artículo es importante porque el muestreo y la preparación de placas requieren una gran cantidad de pequeñas técnicas que se comunican mejor visualmente. Además, mostrar y ver buenas imágenes de las placas es importante para garantizar la reproducibilidad.

Demostrando este protocolo hoy está Joseph Weaver, un candidato de PHD en mi laboratorio. Para empezar, adquiera una muestra representativa de una porción bien mezclada del reactor. Mezcle suavemente la muestra y vierta inmediatamente el volumen de la muestra determinado en un tubo centrífugo de 15 mililitros.

A continuación, agregue cinco microlitros de un uno por ciento de azul de metileno a cada muestra. Tapar y mezclar la muestra invirtiendo suavemente el tubo al menos tres veces. Deje que las muestras se manche durante al menos cinco pero no más de 30 minutos a temperatura ambiente.

Una vez manchado, transfiera un volumen suficiente de agar fundido 7.5 por ciento y agua desionizada al tubo centrífuga con el fin de llevar el volumen total del tubo a entre 6.5 y 9 mililitros. A continuación, vuelva a tapar los tubos centrífugos e invierta suavemente al menos tres veces para mezclar la muestra en el agar. Mientras apunta la tapa lejos de uno mismo, abra la tapa.

Vierta el contenido del tubo de cada tubo en su propia placa de petri de plástico de 100 mililitros mientras balancea suavemente el plato para lograr un recubrimiento completo y suave y una distribución visualmente uniforme de las partículas. Deje que las placas se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, hasta que el agar se solidifique. Coloque la placa descubierta boca arriba en la etapa del microscopio de un microscopio estéreo que sea capaz de 10 a 20 veces el aumento.

Ilumina la muestra desde abajo con luz difusa uniforme, utilizando equipos como un soporte iluminador LED o una placa de luz. Abra el software de captura de imágenes y asegúrese de que la ruta de la luz del microscopio esté configurada en foto. A continuación, seleccione la cámara adecuada en la lista de cámaras.

Ajuste el microscopio para que aparezcan varias partículas en el plano focal con bordes grandes y bien definidos. Utilice un aumento de 10 a 20 veces para medir partículas mientras mantiene un plano focal relativamente profundo. Retire temporalmente la placa de agar y coloque el micrómetro en el escenario.

Ajuste el enfoque fino hasta que las graduaciones del micrómetro aparezcan nítidamente enfocadas en el software de captura de imágenes. Y calibrar la relación píxel a micra. A continuación, establezca el zoom en 100 por ciento haciendo clic en la vista y seleccionando el tamaño real.

A continuación, seleccione las opciones y vaya a calibrar. Aquí, alinee la barra de calibración roja en la ventana gráfica principal a lo largo del eje largo del micrómetro. Con las barras verticales centradas en las graduaciones cero y 200 micras.

En el cuadro de diálogo Calibrar, introduzca el nivel de ampliación actual y la longitud real de 200 micras. Si ya está calibrado, seleccione ampliación en la barra de menús y, a continuación, seleccione el nivel de ampliación actual para confirmar la calibración. En el menú de medidas, vaya a línea y seleccione la línea arbitraria.

Haga clic en la intersección de la graduación cero y el eje largo del micrómetro. A continuación, haga clic de nuevo en la intersección en la línea de 200 micras y el eje largo. Una calibración correcta debe mostrarse como aproximadamente 200 micras.

Elimine la línea haciendo clic en el botón Seleccionar objeto, haciendo clic en la línea, presionando Eliminar y presionando sí en el cuadro de confirmación. A continuación, reemplace la placa de agar y ajuste el enfoque fino para lograr el máximo detalle en el software de imágenes. Para lograr esto, primero aumente la profundidad de bits del valor máximo permitido seleccionando el botón de opción en el panel de profundidad de bits de la barra lateral de la cámara.

Además, configure el software para adquirir imágenes en escala de grises seleccionando el botón de opción adecuado en el panel de grado de color de la barra lateral de la cámara. Ahora, contraiga cualquier panel de barra lateral abierto entre la exposición y el histograma. Reduzca la ganancia a uno y aumente la exposición hasta que aparezca una imagen clara en la ventana gráfica y hasta que el histograma aparezca como una distribución que no esté recortada por ninguno de los extremos del histograma.

Ajuste el histograma para evitar la exposición excesiva y inferior. En el panel del histograma de la barra lateral de la cámara, deslice el límite izquierdo del histograma justo fuera de los valores más bajos y el límite derecho a estar justo fuera de los valores más altos. Guarde la imagen como un archivo TIF sin comprimir.

Incluya la información de ampliación en los metadatos de la imagen marcando la casilla Guardar con información de calibración al guardar. Seleccione otra área que no se superponga a las imágenes anteriores siguiendo un trazado que alterna entre izquierda a derecha y de derecha a izquierda a medida que se mueve hacia abajo en la placa. Capture al menos 500 partículas estimadas visualmente para su análisis.

Adquiera el código de análisis de partículas clonando el repositorio GIT. En la línea de comandos, recupere la versión más reciente del código escribiendo el comando que se muestra aquí. Instale el código de análisis siguiendo las instrucciones del archivo de texto Léame que se encuentra en el directorio de nivel superior del repositorio clonado.

A continuación, edite un archivo de texto que muestre los directorios que se van a procesar junto con los parámetros opcionales. Consulte los ejemplos y el subdirectorio de análisis para obtener una lista de parámetros y ejemplos. Ahora, ejecute el análisis en la línea de comandos escribiendo el comando que se muestra aquí.

La ruta de Fiji es el directorio en el que imageJ-win64. exe se encuentra. Y paramsfile la ubicación del archivo de texto que describe la configuración del análisis.

El nombre del ejecutable puede variar dependiendo del sistema operativo en el que esté instalado Fiji. El análisis se ejecutará automáticamente y tardará unos minutos o unas horas dependiendo del tamaño y el número de imágenes. A continuación, examine los archivos de control de calidad ubicados en el subdirectorio de superposición del directorio de salida especificado.

Observe las imágenes con niebla espuria o partículas mal capturadas, todas aparentes como contornos sombreados que no coinciden con el fondo. Eso es todo. Los datos ya están listos para el análisis específico del experimento y la generación de figuras.

Aunque ningún método de umbral de partículas es perfecto, aquí hay un ejemplo de resultados aceptables. Al evaluar imágenes de control de calidad, se han encontrado tres errores comunes. No ajustarse con precisión a los límites de partículas, no identificar partículas e incluir artefactos.

Aquí, las distribuciones de partículas entre dos reactores experimentales a lo largo del tiempo se muestran y se combinan con metadatos cualitativos observados por el investigador. Este gráfico muestra que en este caso, los reactores tenían distribuciones de tamaño de partícula generalmente similares que tendían hacia una media más grande y una propagación más amplia a medida que avanzaba el tiempo. Al realizar este procedimiento, es fundamental recubrir uniformemente la placa con una fina capa de agar que contenga partículas distribuidas uniformemente.

Asegúrese de practicar y tomar su tiempo. Más allá de este procedimiento, partículas interesantes podrían ser extirpadas del agar y estudiadas. En términos de datos, los archivos resultantes de este protocolo están bien definidos y el cielo es el límite analíticamente.

Esta técnica allanó el camino para proporcionar nuevos conocimientos sobre lodos granulares aeróbicos. Su morfología es muy importante y nos permitió medirla de una manera estándar. Las aguas residuales son biológicamente activas.

Se fomentan las prácticas de nivel uno de biosema seguridad. Además, cómo el agar puede burbujear cuando se microonda el microondas y puede rociar gotas calientes al abrir el tubo de centrífuga.