Name: Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda a aislar tejidos embrionarios de codorniz y pollo mediante microcirugía y digestión enzimática in vitro. Este método permite estudios de expresión génica y formación de órganos quiméricos.

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Los autores agradecemos a Isabel Alcobia por la lectura crítica del manuscrito, Mário Henriques video narración y Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con un sistema de vídeo y Interaves - Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y normas eticas de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. incubación de huevo de codorniz y pollo de fertilizan
<ol><li>Lugar fertilizado huevos de codornices japonesas (japonica del coturnix Coturnix) en una incubadora humidificada de 38 ° C durante 3 días. Incubar los huevos (extremo romo del huevo) hacia arriba en la cámara de aire. Nota: El ambiente humidificado se logra colocando un recipiente de agua en la parte inferior de la incubadora.</li>
	<li>Incubar huevos fertilizados del pollo (Gallus gallus) 2,5 días en una incubadora humidificada de 38 ° C. Incubar los huevos en posición horizontal y marque la parte superior usando un pedazo de carbón para identificar la ubicación del embrión. Nota: Comience con huevos de codorniz 40 y 60 huevos de gallina al establecer este experimento.</li>
</ol>2. aislamiento del endodermo de la codorniz que contiene el dominio prospectivo de rudimento tímico
Nota: Use una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales para los procedimientos de manipulación del huevo en condiciones estériles.
<ol><li>Quitar la región embrionaria que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico, la región faríngea de arco que contiene elrd de 3 y 4th arcos (3/4PAR), como se describe7,8.<ol>
<li>Llene un recipiente grande de vidrio borosilicato (100 x 50 mm, 100 cm3) con 60 mL de frío con tampón fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Con la ayuda de tijeras curvas, toque y corte un orificio circular en la cáscara de una codorniz huevo que ha sido incubada durante 3 días. Hacer el agujero en el lado opuesto del huevo Romo y transferencia de la yema (con embrión) a la taza con PBS frío.</li>
		<li>Retire el embrión de la yema cortando la membrana vitelina externamente a los vasos extra embrionarios con tijeras curvas.</li>
		<li>Con la ayuda de Pinzas finas, transferencia del embrión a un recipiente pequeño (60 mm x 30 mm; 15 cm3) llena con 10 mL de PBS frío.</li>
		<li>Con una espumadera, pasar el embrión a una placa de Petri con una base negra de 100 mm (véase Tabla de materiales) que contienen 10 mL de PBS frío y colocarlo bajo un estereomicroscopio.</li>
		<li>Diseccionar el 3/4PAR, como se describió previamente8.</li>
		<li>Aspirado el 3/4PAR y transfiéralo a un plato de cristal tres cuartas partes llenaron de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar el endodermo que contiene el territorio presuntivo del rudimento tímico (el endodermo 3/4PP) por digestión enzimática con pancreatina.<ol>
<li>Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, 3/4PAR transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de frío pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).</li>
		<li>Incubar durante 1 h en el hielo para la digestión enzimática. Nota: El tiempo de digestión enzimática depende de la etapa del desarrollo (tabla 1).</li>
		<li>Coloque el plato de vidrio bajo el estereomicroscopio (aumento de x-60 x 40) para aislar el endodermo de la 3/4PAR. Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 15 min). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada.</li>
		<li>Para aislar el endodermo de los tejidos circundantes, utilice dos microscalpels de acero inoxidable en los titulares de pin. Nota: Utilice microscalpels con un diámetro entre 0,1 mm y 0,2 mm y níquel pasador titulares con un diámetro de abertura de quijada de 0 mm a 1 mm.<ol>
<li>Primero retire el tubo neural y mesodermo unido a la superficie dorsal del endodermo faríngeo.</li>
			<li>Con el lado dorsal hacia arriba, con cuidado separar y quitar el mesénquima entre los arcos faríngeos y exponer las bolsas faríngeas. Realizar este procedimiento en ambos lados de la 3/4PAR.</li>
			<li>Retire el tubo del corazón y el mesénquima que rodea las bolsas anteriores.</li>
			<li>Con la parte ventral hacia arriba, corte del ectodermo de la 2º y 3rd arcos faríngeos y retire con cuidado el mesénquima a las bolsas. Repita este procedimiento en el otro lado de la 3/4PAR. En esta etapa el rudimento de la tiroides debe ser visible.</li>
			<li>Retire cualquier restantes células mesenquimales que atado al endodermo faríngeo con el dos microscalpels.</li>
			<li>Hacer un corte transversal entre el 2y y 3rd PP, disociando el endodermo faríngeo que contiene elrd de 3 y 4 bolsas delth de la parte anterior del endodermo que el rudimento de la tiroides y 2nd bolsa faríngea.</li>
			<li>Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia el endodermo 3/4PP aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de suero bovino fetal (FBS) de frío de 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Alternativamente, pueden preservarse tridimensionalmente los tejidos aislados y analizados in situ para la expresión génica.</li>
</ol>3. aislamiento de mesodermo somatopleura de pollo
Nota: Ejecutar el huevo procedimientos de manipulación en condiciones estériles, utilizando una campana de flujo laminar horizontal y los instrumentos esterilizados y materiales.
<ol><li>Quitar el territorio embrionario que contiene el mesodermo de la somatopleura del nivel de los somitas 19-24 (ss19-24).<ol>
<li>Retirar el huevo del pollo de la incubadora después de 2,5 días de incubación.</li>
		<li>Con tijeras curvas, abra un pequeño agujero en la cáscara. Inserte una aguja y aspirar 2 mL de albúmina con una jeringa de 10 mL para bajar volumen de albúmina dentro del huevo y evitar daños del embrión (ubicado debajo de la región marcada de la cáscara). Deseche la albúmina aspirada.</li>
		<li>Corte circular (hasta dos tercios de la superficie superior) del agujero en la región marcada del caparazón con unas tijeras curvas.</li>
		<li>Cortar la membrana vitelina externamente a los vasos extraembrionarias mientras sostiene el embrión con pinzas finas.</li>
		<li>Bajo un estereomicroscopio, colocar el embrión en una placa de Petri de 100 mm con una base negra que contiene 10 mL de PBS frío. Nota: Use un estereomicroscopio de aquí en adelante para un aumento progresivo de los procedimientos de microcirugía.</li>
		<li>Use cuatro pernos insectos delgados para mantener el embrión en la parte inferior de la placa. Coloque los pernos en la región extraembrionarias formando un cuadrado.</li>
		<li>Realizar dos cortes entre las somitas 19 y 24 transversalmente en el eje embrionario y cruzar todo el territorio embrión, utilizando tijeras de ojo de wecker.</li>
		<li>Liberar la sección embrión, ss19-24, por marginal embrionaria bordes de corte.</li>
		<li>Los tejidos aspirados ss19-24 y transferencia a un plato de cristal tres cuartas partes llenan de PBS frío con una pipeta Pasteur estéril de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar el mesoderm lateral de la región de la somatopleura (ss19-24) por digestión enzimática con pancreatina (8 mg/mL; dilución 1:3 de 25 mg/mL con PBS frío).<ol>
<li>Con la ayuda de una espátula y pinzas finas, transferencia de los tejidos ss19-24 a un vaso plato tres cuartos llenados con solución fría de pancreatina.</li>
		<li>Incubar durante 30 min en hielo para la digestión enzimática.</li>
		<li>Bajo el estereomicroscopio, aislar el mesodermo de los tejidos circundantes con dos microscalpels en un soporte. Nota: Mantenga todas las superficies y soluciones de frío durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución de pancreatina frío si tomando mucho tiempo para disecar los tejidos (> 10 min.). Como fuente de iluminación, utiliza luces LED incorporadas en el estereomicroscopio o en las fibras ópticas, teniendo en cuenta la carga térmica limitada.</li>
		<li>Durante el aislamiento del mesodermo, primero retire el ectodermo en la superficie, seguida por la separación cuidadosa de los tejidos splancnopleura situado ventralmente.</li>
		<li>Suelte el mesodermo lateral derecho de la somatopleura cortando en un movimiento paralelo al tubo neural.</li>
		<li>Repita la separación del mesodermo del lado izquierdo del embrión. Nota: Hacer lentos movimientos de microscalpel durante este procedimiento. Las proteínas de la matriz extracelular expuesta se pegan a los tejidos e instrumentos de prevención de movimientos fluidos.</li>
		<li>Con la ayuda de una espátula y pinzas finas transferencia el mesodermo aislado a un plato de cristal tres cuartas partes lleno de equipos frío.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantener el plato de vidrio con los tejidos aislados en el hielo durante la preparación del ensayo in vitro.</li>
</ol>4. In vitro organotypic ensayo: heteroespecíficas Asociación de endodermo 3/4PP de codorniz y pollo somatopleura mesodermo
<ol><li>Preparar el medio de cultivo con Medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS y 1% pluma/Strep3,5.</li>
	<li>Colocar una rejilla metálica en una placa de Petri con 5 mL de medio de cultivo de 35 mm. Nota: Retire el exceso de líquido a nivel de la superficie del medio con la parte superior de la rejilla.</li>
	<li>Con la ayuda de Pinzas finas, un filtro de membrana de la inmersión en el medio de cultivo y colocarla en la parte superior de la cuadrícula para tener una superficie de contacto con el aire. Nota: Un cuarto de la superficie de la membrana (con 13 mm de diámetro) es adecuado para la Asociación de tejidos.</li>
	<li>Bajo el estereomicroscopio, asociar los tejidos aislados en la parte superior del filtro de membrana. Primero transferir el endodermo 3/4PP (paso 2) desde el plato de vidrio suave deslizamiento con la ayuda de un trasplante de la cuchara (o espátula) y finas pinzas. Repita este procedimiento para el mesodermo aislado (paso 3). Nota: Con la ayuda de un microscalpel, mezcla de los tejidos para maximizar su asociación.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente los tejidos asociados en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO2 para tejidos cultivados 48 h. pueden ser injertados en la membranas corioalantoideas (CAM). Nota: La formación ectópica de órgano en la leva fue anteriormente detallada8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model%3A+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualuzed+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li>
<li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li>
<li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento de aislamiento de tejido embrionario detallado aquí fue mejorado de las técnicas anteriores para producir embriones quiméricos pollo codorniz en contextos biológicos3,5,6.
Este enfoque es adecuado para aislar los tejidos embrionarios puros sin necesidad de manipulación genética o el uso de marcadores específicos de tejido, que son a menudo indeterminado, limitar el uso de modelos anim...

En la década de 1970, un sistema elegante de codorniz-gallina de quimera fue desarrollado por Le Douarin, abriendo nuevas vías para entender el papel de la migración celular y las interacciones celulares durante el desarrollo1,2. El modelo fue ideado en la premisa de que del intercambio entre las dos especies no molestaría considerablemente embriogénesis, confirmado más adelante cuando se utiliza para el estudio de numerosos procesos de desarrollo, incluyendo la formación de nervioso y las hematopoyéticas sistemas1. Tomando este último como un ejemplo, las ondas cíclicas de progenitores hematopoyéticos colonizando el rudimento epitelial tímica se observó por primera vez utilizando el sistema quimera de codorniz-gallina de3. Para ello, el territorio prospectivo del timo, el endodermo de las bolsas de tercer y cuarto faríngeos (3/4PP), era mecánica y enzimáticamente aislado de embriones de codorniz (q) en 15 - 30 etapa somite [día embrionario (E) 1.5-E2.5]. Estas etapas corresponden a pollo Hamburger y Hamilton4 (HH) - 12-17. Los procedimientos de aislamiento comenzaron con el uso de la tripsina enzimáticamente disociar el endodermo de la mesénquima adjunto. El endodermo aislado se injertó en la región de la somatopleura de un embrión de pollo (c) de host en el E3-E3.5 (HH-etapas 20-21). Este mesénquima heteróloga consideró "permisivo" para el desarrollo de epitelio tímico, contribuyendo también a la formación de órganos3. Después, sucesivas oleadas de las células del progenitor transmitidas por la sangre del huésped pollo se infiltraron en la codorniz donantes tímicas epiteliales contraparte contribuyendo a la formación del timo en el embrión huésped del3.
Más recientemente, una versión modificada de este método fue demostrada para ser importante para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. En este sentido, los tejidos involucrados en la formación del timo ectópico en embriones quiméricos3 fueron aislados de embriones de donante y huésped y asociados ex vivo. Se utilizó un protocolo mejorado para aislar el endodermo 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) y el mesodermo de la somatopleura de pollo (E2.5-E3). Brevemente, los tejidos embrionarios se aislaron por microcirugía y digestión in vitro pancreatina. Además, las condiciones de digestión enzimática, temperatura y tiempo de incubación fueron optimizadas según el tipo de tejido y etapa de desarrollo (tabla 1).
A continuación, los tejidos aislados se asociaron en un organotypic sistema vitro durante 48 h, como previamente divulgados5,6. La Asociación in vitro de tejidos imita las interacciones locales de celulares en el embrión, superando algunas limitaciones de la manipulación en vivo. Este sistema es particularmente útil para el estudio de las interacciones celulares en complejos eventos morfogénicos, como el desarrollo del aparato faríngeo.
La contribución de cada tejido en la histogénesis del timo, así como la capacidad de la Asociación heteroespecíficas para generar un timo puede ser más explorado utilizando la metodología de CAM, anteriormente detallada5,7,8. Sucintamente, los tejidos cultivados fueron injertados en la leva de embriones cE8 y permitió desarrollar en ovo por 10 días. Entonces, formación de timo fue evaluada mediante análisis morfológico de los explantes cosechados. Como en la clásica de codorniz-gallina de estudios3, el epitelio tímico de codorniz fue colonizado por las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs) derivadas del embrión de pollo, que fue demostrado más adelante para contribuir al desarrollo de órgano9,10 . Los HPCs emigraron del embrión a timo ectópico quimérico a la altamente vascularizado CAM5,7,8. Codorniz derivada epitelio tímico puede identificarse por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, QCPN - MAb codorniz PeriNuclear), superación de la necesidad de marcadores moleculares específicos de tejido.
Este método experimental, como el enfoque de dos pasos registrado en la anterior publicación8, permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos in vitro y en el desarrollo de ovo. También, los explantes se pueden cosechar en cualquier momento del curso del experimento8.
Por último, el protocolo de aislamiento aquí detallado permite la preservación de las propiedades naturales y 3D-arquitectura de los tejidos embrionarios, particularmente útiles para detallar patrones de expresión génica en situ de territorios embrionarios de lo contrario inaccesibles por métodos convencionales. Además, enfoques de análisis del transcriptoma, incluyendo RNA-seq o microarrays, pueden también aplicarse en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos mientras que proporciona un análisis de alto rendimiento de tejidos específicos "ómicas".

<table><tbody><tr><td>Huevos fertilizados de gallina (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Granja avícola&nbsp;</td></tr><tr><td>Huevos fecundados de codorniz (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Granja de aves&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga PP de 15 mL Tubos de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>PP de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Platos de Pyrex de 60 x 20 mm</td><td>Grupo Duran</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>Platos de Pyrex de 100 x 20 mm</td><td>Grupo Duran</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla metálica</td><td>Rejilla de acero inoxidable Goodfellows</td><td></td> de <td>malla fina</td></tr><tr><td>Filtro de membrana</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Filtro de membrana Isopore</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 x 30 mm cuencos de pyrex (tamaño pequeño)</td><td></td><td></td> <td>de supermercado&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuencos de pyrex de 100 x 50 mm (tamaño grande)</td><td></td><td></td> <td>del supermercado&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>Pipeta de plástico de 2 mL</td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio Pasteur</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td></td><td></td> de plástico transparente <td>de supermercado&nbsp;</td></tr><tr><td>Citoqueratina (pan; ácida y básica, citoqueratinas tipo I y II), clon Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>Prepare una solución de 25 mg/mL de acuerdo con las instrucciones del fabricante; centrifugar y filtrar antes de la alícuota y almacenar a -20 °C. Las alícuotas se pueden mantener congeladas durante varios años.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN</td><td>anticuerpo Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Kit de elastómero de silicona 1,1 kg</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Para preparar la base trasera de la placa de Petri</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Pinzas finas</td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas, curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Tijeras curvas Alfileres para</td></tr><tr><td>insectos&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0,3 mm Pasador de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Micro espátula&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Cuchara de trasplante</td></tr><tr><td>Pinutien Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>0,2 mm Microbisturí de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Pines Minutien Fine</td><td>Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0,1 mm Microbisturí de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Moria Soporte de pasadores niquelado Fine</td><td>Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Soporte de alfileres niquelado</td></tr><tr><td>Moria Cuchara perforada</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker tijera de ojo</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td>Microscopio <td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer&nbsp; S360 Digital&nbsp; escáner de diapositivas&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

La capacidad de aislar los tejidos embrionarios fue un paso esencial para establecer el sistema de pollo de codorniz quimera, que a su vez ha proporcionado contribuciones indiscutibles a develar procesos clave en la biología del desarrollo.
Es en este documento se describe un método optimizado para aislar los tejidos embrionarios de codornices y pollos por microcirugía y digestión enzimática conservando sus propiedades biológicas. Después de aislamiento, los tejidos de ambas especies se asocian en un ensayo in vitro organotypic de 48 h. de codorniz y los tejidos de pollo pueden ser discriminados por las características nucleares distintas y marcadores moleculares, lo que permite el estudio de la diafonía celular entre heteroespecíficas Asociación de tejidos. Este enfoque es, por lo tanto, una herramienta útil para el estudio de las interacciones de tejido complejo en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas, tales como ésos que ocurren durante la morfogénesis faríngea y la formación del foregut órganos derivados del endodermo. Este enfoque experimental primero fue desarrollado para estudiar las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación del timo. En este sentido, el rudimento tímico potencial derivados del endodermo y mesodermo derivado mesenchyme, fueron aislados de embriones de codorniz y de pollo, respectivamente.
La capacidad de los tejidos asociados para generar órganos puede probarse más por injerto sobre la membranas corioalantoideas (CAM) de un embrión de pollo. El CAM proporciona nutrientes y permite intercambios de gases a los tejidos explanted. Después de 10 días de desarrollo de ovo, los órganos quiméricos pueden ser analizados en los explantes cosechados por los métodos morfológicos convencionales. Este procedimiento también permite estudiar las contribuciones específicas de tejido durante la formación de órganos, desde su desarrollo inicial (desarrollo in vitro) la fase final de la organogénesis (en desarrollo de ovo).
Por último, el método de aislamiento mejorado también proporciona tridimensionalmente (3D) conserva los tejidos embrionarios, que también pueden utilizarse para el análisis topográfico de alta resolución de los patrones de expresión génica específica de tejido.

El protocolo detalla un método para aislar los tejidos embrionarios aviares a utilizarse en varios métodos técnicas de biología celular y del desarrollo. Este método fue empleado anteriormente para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. Aquí, nuevos resultados se muestran en la figura 1 y figura 2, usando métodos similares.
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Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar un enfoque experimental optimizado para aislar los tejidos embrionarios de los embriones de codornices y pollos. Con esta técnica, obtenemos tejidos embrionarios puros que se pueden utilizar en estudios de expresión génica y ensayos funcionales. Los tejidos de los embriones de codorniz y pollo están aislados por microcirugía y están sujetos a una digestión enzimática in vitro, preservando al mismo tiempo sus propiedades biológicas.Después del aislamiento, los tejidos preservados tridimensionales se pueden utilizar para el análisis de patrones de expresión génica topográfica de alta resolución. Este enfoque es particularmente útil para detallar la expresión génica in situ en territorios embrionarios de otro modo inaccesibles por métodos convencionales. Además, los enfoques de análisis de transcriptomas también se pueden aplicar en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos, al tiempo que proporcionan un análisis oémico de alto rendimiento específico del tejido.Alternativamente, los tejidos aislados de ambas especies se pueden asociar en un ensayo organotípico in vitro durante 48 horas. Este enfoque permite estudiar las interacciones de los tejidos, ya que las células de codornices y pollos pueden ser discriminadas por características nucleares y marcadores moleculares distintos. La capacidad de los tejidos de cultivo para formar órganos se puede probar aún más en el ensayo ovo.Por lo tanto, este método es una herramienta útil para estudiar interacciones complejas de tejidos en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas y también puede ayudar a revelar el potencial de territorios embrionarios específicos a la formación de órganos. Como ejemplo, en este documento se describe la formación de timo quimérico de codornices-pollo a partir de tejidos embrionarios aislados. En primer lugar, el endodermo de la tercera y cuarta bolsa faríngea, el rudimento tirámico prospectivo se aísla de la región faríngea de embriones de codorniz con tres días de desarrollo.Entonces, este tejido se asocia con un mesenquime capaz de apoyar su desarrollo, el mesodermo somatopleura. Finalmente, la asociación heteroespecífica de los tejidos se cultiva in vitro y en ovo para formar un timo quimérico. Realice todos los procedimientos de manipulación de óvulos en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar horizontal e instrumentos y materiales esterilizados.Los huevos de codorniz fertilizados fueron incubados con la cámara de aire hacia arriba. Para comenzar, retire los huevos de codorniz de la incubadora. Prepare un tazón grande de vidrio borosilicato lleno de PBS frío.Con tijeras curvadas, toque y corte un agujero circular en la cáscara de un huevo de codorniz con tres días de incubación. Haga el agujero en el lado opuesto del huevo contundente, y transfiera la yema al tazón con PBS frío. Retire el embrión de la yema cortando la membrana vitellina externamente a vasos extramblarónicos.Con la ayuda de fórceps delgados, transfiera el embrión a un tazón pequeño lleno de PBS frío, luego mueva el embrión a un plato de Petri con base negra con un skimmer. Retire la región faríngea que contiene la tercera y cuarta bolsas faríngeas como se describe en la ligadura anterior de Jove SPA. Luego, transfiera la tercera y cuarta región del arco faríngeo a un vaso que se llene de pancreatina fría e incubar durante una hora, sobre hielo, para la digestión enzimática.Tenga en cuenta que el período de incubación de la digestión enzimática depende de la etapa de desarrollo. Coloque la placa de vidrio debajo del microscopio estéreo y aísle el endodermo de la tercera y cuarta región del arco faríngeo, utilizando dos microescalpelos en un soporte. Primero coloque la región faríngea con el lado dorsal hacia arriba, mostrando internamente el endodermo y el ectodermo en la superficie externa.Observe el ectodermo, el endodermo, el mesenquime, el tubo cardíaco y la porción ventral del tubo neural. Retire el tubo neural y el mesodermo unido a la superficie dorsal del endodermo faríngeo. Observe el endodermo de la faringe, la cuarta y tercera bolsas faríngeas y el tubo cardíaco.Con el lado dorsal hacia arriba, desprende cuidadosamente y retire el mesenquime entre los arcos faríngeos y exponga las bolsas faríngeas. Realice este procedimiento en el otro lado de la región faríngea. Retire el mesenquimo unido a la parte más posterior del endodermo y observe la cuarta bolsa faríngea.Con el lado posterior hacia arriba, observe las bolsas faríngeas izquierda y derecha. Continúe retirando el mesenquime unido a la parte más posterior del endodermo y a la segunda bolsa. Retire el tubo cardíaco y el mesenquime que rodea las bolsas interiores.Con el lado ventral hacia arriba, observe el endodermo de faringe, y el lado derecho del segundo arco faríngeo. En esta etapa, el endodermo del rudimento tiroideo debe ser visible. Separar el ectodermo del segundo y tercer arco faríngeo y eliminar cuidadosamente el mesenquime de los arcos.Observe la extirpación del mesenquime del segundo arco faríngeo en el lado derecho. Tenga en cuenta la ubicación de la cuarta y tercera bolsas y el rudimento tiroideo. Retire los restos de las células mesenquimales unidas a las bolsas faríngeas.Observe la tercera y cuarta bolsa del lado derecho y la cuarta bolsa del lado izquierdo. Repita el destacamento de mesenquime del lado izquierdo. Observe ahora la tercera bolsa del lado izquierdo.Observe el desprendimiento de mesenquime del segundo arco en el lado izquierdo. Tenga en cuenta que todas las superficies y soluciones deben mantenerse frías durante este procedimiento. Cambiar a una nueva solución y plato de pancreatina fría en caso de tomar mucho tiempo para diseccionar los tejidos.Finalmente, hacer un corte transversal entre la segunda y la tercera bolsas faríngeas para eliminar las segundas bolsas y el rudimento tiroideo. En este punto, el endodermo aislado se compone de la tercera y cuarta bolsas faríngeas y la punta posterior de la faringe. Retire los restos de mesenquime separados con la ayuda de dos microescalpelos.Transfiera el endodermo aislado a un plato de vidrio lleno de suero bovino fetal frío y manténgalo sobre hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Los huevos se colocaron en posición horizontal y la parte superior marcada para el uso de un carbón vegetal. Para comenzar, retire los huevos de la incubadora.Con una tijera curva, abra un pequeño agujero en la cáscara, inserte una aguja y aspire dos mililitros de albúmina con una jeringa de 10 mililitros. Abra un agujero circular en la región marcada de la cáscara y corte la membrana vitellina externamente a los vasos embrionarios adicionales mientras sostiene el embrión con fórceps delgados. Bajo un microscopio estéreo, coloque el embrión en un plato de Petri con base negra que contenga PBS frío.Utilice cuatro pasadores de insectos para sujetar el embrión en la parte inferior de la placa. Coloque los pasadores en la región extraembónica formando una forma cuadrada. Realizar dos cortes entre las somitas 19 y 24 transversalmente al eje embrionario y cruzar el embrión.Suelte esta sección cortando los bordes embrionarios marginales. Observe la placa lateral, el tubo neural y las somitas. Aspirar y transferir los tejidos a un plato de vidrio lleno de pancreatina fría.Incubar durante 30 minutos sobre hielo para la digestión enzimática. Bajo el microscopio estéreo, aísle el mesodermo de los tejidos circundantes utilizando dos microescalpelos en soportes. Observe el mesodermo somatopleura, la esplancnopleura, el tubo neural y el ectodermo.En primer lugar, retire el ectodermo en la superficie. Observar el mesodermo somatopleura disociado del ectodermo. Luego, separe cuidadosamente la splanchnopleura situada ventralmente de la somatopleura.Observe el mesodermo lateral derecho de la somatopleura. Suéltelo cortándolo en un movimiento paralelo al tubo neural. Tenga en cuenta que todas las superficies y soluciones deben mantenerse frías durante este procedimiento.Cambiar a una nueva solución y plato de pancreatina fría en caso de tomar mucho tiempo para diseccionar los tejidos. Observe el mesodermo lateral izquierdo de la somatopleura, los somites, el tubo neural y el ectodermo. Repita la liberación del mesodermo de este lado.Realiza movimientos lentos con el microescalpelo. Las proteínas de matriz extracelular expuestas se asientan a través de tejidos e instrumentos, evitando movimientos de fluidos. Corte cuidadosamente la somatopleura en un movimiento paralelo al tubo neural.Transfiera el mesodermo aislado a un plato de vidrio lleno de suero bovino fetal frío y manténgalo sobre hielo durante la preparación del ensayo in vitro. Coloque una rejilla de metal mallada fina en un plato de Petri y llene con un medio de cultivo. Retire los líquidos excesivos para nivelar la superficie media con la parte superior de la rejilla.Con la ayuda de fórceps delgados, sumerja un filtro de membrana en el medio de cultivo y colóquelo cuidadosamente en la parte superior de la rejilla para tener una superficie en contacto con ella. Bajo el microscopio estéreo, transfiera el endodermo aislado del plato de vidrio al filtro de membrana deslizando suavemente con la ayuda de espátulas y fórceps delgados. Repita este procedimiento para el mesodermo aislado.Con la ayuda de un microescalpelo, mezcla los tejidos para maximizar su asociación. Coloque cuidadosamente los tejidos asociados en una incubadora humidificada a 37 grados con 5%CO2 durante 48 horas. Después del período de incubación, injerte los tejidos de cultivo en la membrana de tipo coriolan y permita que se desarrolle en óvalo durante 10 días para completar la formación de órganos como se describió anteriormente.Aquí está el método reticular que permite el aislamiento de los tejidos embrionarios aviares para ser utilizado en enfoques experimentales distintos. Como ejemplo, la expresión de genes que se sabe que participan en la formación de las bolsas faríngeas también se evaluó un endodermo aislado que contenía la segunda, tercera y cuarta bolsas faríngeas de embriones de pollo en el día embrionario tres y medio por hibridación en el monte in situ. La expresión de Sonic Hedgehog fue detectada en el endodermo de la faringe central y excluida de las bolsas, mientras que BMP7 se expresó en el endodermo de la segunda y tercera bolsas faríngeas y se excluyó de la faringe central y la cuarta bolsa faríngea.Los tejidos aislados también pueden ser asociados específicamente in vitro durante 48 horas, injerto en la membrana de tipo coriolan, y permitidos desarrollarse durante 10 días más. Los explantes pueden ser analizados por histología convencional e inmunohistoquímica. Algunos resultados representativos de la asociación del endodermo de codornices de la tercera y cuarta bolsa faríngea con mesodermo de somatopleura de pollo son los siguientes injertos mostraron un timo quimérico completamente formado con células epiteliales timicas derivadas de codornices positivas para QCPN y células linfoides de pollo.Además, el epitelio timico positivo de citoqueracina mostró rasgos morfológicos normales, mostrando una arquitectura reticular típica. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo aislar los tejidos embrionarios de codorniz y pollo que se pueden utilizar en estudios de expresión génica y mediante la formación de órganos quiméricos también puede ayudar a descifrar la complejidad de la genética orgánica.

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Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Aprenda a aislar tejidos embrionarios de codorniz y pollo mediante microcirugía y digestión enzimática in vitro. Este método permite estudios de expresión génica y formación de órganos quiméricos.

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