Name: Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a evaluar la integridad del ADN en células madre para terapia cardíaca regenerativa usando ensayos de cometa e inmunomarcaje. Estos protocolos garantizan la calidad celular antes del trasplante.

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Este trabajo fue financiado en parte por el corazón nacional, pulmón y sangre Instituto becas to1-HL-99507, HL-114120 131017 HL, HL138023 y UO1-HL-134764 (a J. Zhang) y por el americano corazón Asociación científica desarrollo Grant 17SDG33670677 (a R. Kannappan).

1. ensayo cometa
<ol><li>
Preparación del reactivo
	<ol>
<li>De agarosa de bajo punto de fusión, 500 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 100 mL de DNA / RNA-libre del agua. Calentar el frasco en el microondas hasta que la agarosa se disuelva. Coloque la botella en un baño de agua de 37 ° C hasta que se necesite. Nota: Para mayor información, véase Azqueta et al., quienes estudiaron los efectos de la concentración de agarosa en el momento de desenrollar ADN y varios factores de electroforesis23.</li>
		<li>Diluir el colorante verde de SYBR ADN en tampón Tris-EDTA (TE) en una proporción de 1: 10,000 para obtener un 1 x de solución stock de colorante. Este colorante es sensible a la luz, así que guárdela en un lugar oscuro.</li>
		<li>Para el tampón de lisis celular, disolver 100 mL de tampón de lisis (2.5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Tritón X-100) en agua desionizada (DI H2O). A continuación, añadir 10 M NaOH para ajustar el pH a 10,0. Enfriar la solución a 4 ° C.</li>
		<li>Para el búfer de ejecución de ADN-desenrollar, electroforesis alcalino, disolver 1 L de solución alcalina (NaOH de 0,3 M, 1 mM EDTA) en DI H2O. enfriar la solución a 4 ° C. Asegúrese de que el pH > 13.</li>
		<li>Para diapositivas de cometa prerrevestidos, coloque unas pocas gotas de 0.5% agarosa sobre un portaobjetos de vidrio. Inmediatamente, con la superficie plana de otra diapositiva, difundir la agarosa para formar una capa delgada de la capa de agarosa. Nota: Seque el portaobjetos antes de usar.</li>
		<li>Para cultivo de células iPS, brevemente las células iPS de cultura en sótano revestido de matriz de la membrana (véase Tabla de materiales) de la cultura placas mTESR1 medio de cultivo hasta llega a confluencia. Nota: Las células iPS derivadas de fibroblastos cardiacos humanos fueron utilizadas en el presente Protocolo. La reprogramación de la derivación de células iPS y condiciones de cultivo se describe en los artículos más recientes de nuestro grupo de investigación12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la muestra
	<ol>
<li>Descartar el medio de cultivo y lavar las células. Disociar las células con solución de separación (véase Tabla de materiales). Lavar el precipitado de células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y resuspender las células en PBS 1 x 105 células/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de portaobjetos de la muestra Nota: Realice los siguientes pasos bajo condiciones de poca luz para evitar el daño celular inducido por la luz ultravioleta.<ol>
<li>Mezclar 10 μL de suspensión celular y 90 μL de solución de agarosa (1:10 ratio) en un tubo. Coloque el tubo en un baño de agua de 37 ° C para impedir la solidificación de la agarosa.</li>
		<li>Mezclar las soluciones sin introducir burbujas de aire y pipeta 70 μL/spot el portaobjetos recubiertos cometa. Utilizando una pipeta, Esparza la mezcla de agarosa de la célula para formar una capa delgada. Coloque el portaobjetos en 4 ° C por 15 minutos.</li>
		<li>En un recipiente totalmente sumerja el portaobjetos en tampón de lisis frío. Coloque el recipiente en la oscuridad a 4 ° C durante 1 h.</li>
		<li>Vuelva a colocar el tampón de lisis con solución alcalina fría. Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas. Coloque el recipiente en la oscuridad a 4 ° C por 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroforesis
	<ol>
<li>Colocar el portaobjetos en un tanque de electroforesis horizontal. Llene el tanque con el tampón de electroforesis alcalina fría hasta que las diapositivas estén completamente sumergidas. Aplique tensión a 1 V/cm durante 15 a 30 minutos. Nota: Total de tensión = distancia entre los electrodos x 1 V</li>
		<li>En un recipiente, sumerja completamente el portaobjetos en frío DI H2O. Después de 2 minutos, quite el DI H2O y añada fresca DI H2O. Repita este paso.</li>
		<li>Reemplace el DI H2O con etanol frío al 70%. Esperar 5 minutos suavemente quitar la corredera, no lo incline y déjelo secar al aire.</li>
		<li>Una vez seco, añada 100 μL de colorante diluido de ADN a cada lugar. Esperar 15 min a temperatura ambiente. Usando un filtro FITC en un microscopio de epifluorescencia, tomar imágenes de cometas de 50 a 100 en total por muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de imágenes y cálculo de los resultados
	<ol>
<li>Anotando los cometas, los institutos nacionales de salud (NIH) utilizar ImageJ con plugin de ensayo cometa (descargar ImageJ aquí: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; descarga el plugin aquí: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Nota: El plugin viene con un PDF de instrucciones que contiene todos los datos para realizar el análisis. Además, imágenes del análisis del cometa se muestran en la Figura 2A-C. Imágenes del cometa representante de control y doxorrubicina (Doxo)-células iPS tratada y la cuantificación de los cometas se muestran en la Figura 3A-C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. respuesta del daño de ADN
<ol><li>Preparación de muestra y reactivo
	<ol>
<li>Para un cultivo de células iPS-CM, cultura iPS-CM células en sótano revestido de matriz de la membrana (véase Tabla de materiales) placas en Medio RPMI suplementado con B-27 (CMM) hasta llega a confluencia. Nota: Cardiomiocitos derivados de células iPS humanos fueron utilizados en el presente Protocolo. El protocolo de diferenciación de las células iPS en cardiomiocitos puede encontrarse en artículos recientes de nuestro grupo de investigación12,13,21.</li>
		<li>IPS-CMs en diapositivas de la cámara de la semilla.<ol>
<li>Descartar el medio de cultivo de los pozos de iPS-CM. Lavar las células 3 veces con PBS.</li>
			<li>Añada 1 mL de tripsina 0.25% por pozo e incubar a 37 ° C por 5 min Verifique la placa bajo un microscopio para la separación de la célula. Añadir 1 mL de CMM para detener la tripsina.</li>
			<li>Coloque la suspensión en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 4 ° C y 200 x g. Descartar el medio, agregar 1 mL de CMM y resuspender las células. Contar las células y ajustar la cuenta de célula para obtener 20 x 105 células en 1,6 mL de CMM.</li>
			<li>Semilla 200 μL de suspensión de células por pocillo de la cámara del pozo 8 Deslice (véase Tabla de materiales). Toque el portaobjetos suavemente para extender las células alrededor del pozo e incubar a 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para el tratamiento de doxorrubicina de iPS-CM, desechar el medio de cultivo de los pozos de iPS-CM. Lavar las células con PBS. Tratar las células con 1 doxorrubicina μM y CMM para 4 h. Aspire el medio y lavar las células con PBS.</li>
		<li>Para el amortiguador de bloqueo, prepare 10 mL de solución de albúmina de suero bovino (BSA) que contiene 3% de BSA y 0.05% Tritón X-100. Para preparar 10 mL de solución amortiguadora de bloqueo, agregar 1 mL de suero normal de burro a 9 mL de solución preparada de BSA.</li>
		<li>Para la solución de anticuerpo primario, añadir 1 μL de anti-rabbit phospho-histona H2A. X (Ser139) anticuerpo a 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo.</li>
		<li>Para la mezcla del anticuerpo secundario, añadir 1 μL de anticuerpo secundario de anti-conejo conjugado con fluorocromo DAPI y conjugado con fluorocromo phalloidin a 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunomarcación
	<ol>
<li>Lavar las células 3 veces con PBS y añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% recién preparada (PFA) a cada pocillo. Fijar las células durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Lavar las células con PBS.</li>
		<li>Retirar el PBS y añadir 200 μL de solución amortiguadora de bloqueo por el bien y el bloque de 30 minutos en una cámara de vapor a temperatura ambiente. Retire el amortiguador de bloqueo y añadir 200 μL de solución de anticuerpo primario. Incubar durante 45 minutos en una cámara oscura, humidificada a temperatura ambiente. Luego, lavar los pocillos 3 veces con PBS.</li>
		<li>Retirar el PBS y añadir 200 μL de mezcla de anticuerpo secundario. Incubar durante 45 minutos en una cámara oscura, humidificada a temperatura ambiente. Luego, lavar los pocillos 3 veces con PBS. Lave con DI H2O antes de montar con preservador de fluorescencia. Coloque un cubreobjetos y guardar las diapositivas en la oscuridad a 4 ° C.</li>
		<li>Usando un microscopio de epifluorescencia, tomar tres a cinco imágenes de campos al azar por ejemplo, como se muestra en la Figura 4Ay proceder al análisis de la imagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuento de los focos DDR
	<ol>
<li>Descargar e instalar CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Nota: Procesamiento de imágenes en este estudio se realizan con CellProfiler versión 2.1.1. Tutoriales de CellProfiler que se utilizaron se pueden encontrar en otros lugares (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & lista = PL7CC87670239B4D10). Si se utiliza una versión más reciente de CellProfiler, la tubería podría requerir adaptaciones menores.</li>
		<li>Descargar la tubería punctae_gH2AX.cpipe. Seleccione archivo > importar > tubería desde el archivo y elija punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Arrastrar y soltar la carpeta que contiene las imágenes adquiridas de focos γH2A.X a la ventana de lista de archivos en la sección de Módulos de entrada/imágenes para el análisis (figura 5A). A continuación, siga las instrucciones como se muestra en la Figura 5A-L.</li>
		<li>Definir los siguientes parámetros para las imágenes:<ol>
<li>Arrastre la imagen deseada para el análisis de la lista de archivos. En módulos de entrada, seleccione imágenes (ver figura 5A para ajustes del módulo). En los módulos de entrada, seleccione metadatos (ver figura 5B para ajustes del módulo). En los módulos de entrada, seleccione NamesAndTypes (véase la figura 5 para los ajustes del módulo).</li>
			<li>Para grupos, seleccione no. En los módulos de análisis, seleccione ColorToGray (véase la figura 5 para los ajustes del módulo).</li>
		</ol>
</li>
		<li>En los módulos de análisis, seleccione suave (ver figura 5E para ajustes del módulo). Nota: Este valor deba ser optimizada, dependiendo de la resolución de la imagen.</li>
		<li>En los módulos de análisis, seleccione IdentifyPrimaryObjects (ver figura 5F para ajustes del módulo). Nota: Optimizar estos valores para asegurarse de que está seleccionado el núcleo entero. Después de este paso, el ordenador puede retrasarse.</li>
		<li>En los módulos de análisis, seleccione suave (ver figura 5 para la configuración del módulo). Nota: Este valor deba ser optimizada, dependiendo de la resolución de la imagen.</li>
		<li>En los módulos de análisis, seleccione EnhanceOrSuppressFeatures (ver figura 5 H para ajustes del módulo).</li>
		<li>En los módulos de análisis, seleccione IdentifyPrimaryObjects (véase figura 5I para ajustes del módulo). Nota: Optimizar estos valores para asegurarse de que seleccionan a lo punctae. Después de este paso, el ordenador puede retrasarse otra vez.<ol>
<li>En los módulos de análisis, seleccione RelateObjects (véase figura 5J para ajustes del módulo). En los módulos de análisis, seleccione ClassifyObjects (ver figura 5 K para la configuración del módulo). En los módulos de análisis, seleccione ExportToSpreadsheet (ver figura 5 L para ajustes del módulo).</li>
			<li>Haga clic en Analizar imágenes en el panel izquierdo de la parte inferior para realizar análisis de imagen. En la realización del análisis, se generan varias imágenes (Figura 6A-F). Nota: Los usuarios deben guardar estas imágenes para referencia futura.</li>
			<li>Nota el archivo .csv que contiene datos cuantitativos para su análisis posterior que es generado y guardado en la ubicación apropiada en el equipo. En la hoja de cálculo denominada MyExpt_Image, columnas B y D tendrá el número de núcleos que tienen hasta cinco y más punctae, respectivamente. Añadir columnas B y D para obtener el número total de núcleos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Repita el paso 2.3.3 - 2.3.8 para todas las imágenes (cambiar el nombre de archivo MyExpt_ antes de cada análisis). Parcelas pueden hacerse para evaluar la integridad del ADN, como se muestra en la figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
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<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Integridad del ADN retrata la integridad celular. Las células con ADN dañado están con frecuencia en tensión y eventualmente pierden su integridad. La integridad de la madre y las células derivadas de células madre que están propagándose con el fin de trasplante es principal para las células realizar su función deseada. Transplante de células con ADN dañado resultaría en una tasa de pobres engraftment y rendimiento de la celda8,20. Por lo tanto, examinar la integ...

Evidencia clínica y experimental demuestra que el trasplante de la célula moderado puede mejorar el rendimiento contráctil del ventrículo izquierdo de no corazones1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Los avances recientes se han abierto más atractivas oportunidades de regeneración cardiovascular; Estos incluyen la expresión forzada de los factores de reprogramación de células somáticas para inducir pluripotencia y distinguir estas células pluripotentes inducidas (iPSC) en diversos linajes cardíacos, lo importante de cardiomiocitos (CM)10, 11 , 12 , 13. el material hereditario en cada célula, incluyendo el iPSCs artificialmente generados y derivados de iPSC CM (iPS-CM), es el ADN. Las instrucciones genéticas almacenadas en el ADN determina el crecimiento, desarrollo y función de las células, tejidos, órganos y organismos. El ADN no es inerte; metabolitos, como el oxígeno reactivo, carbonilo y especies de nitrógeno, la célula y agentes alquilantes puede dañar ADN causa in vitro e in vivo14,15,16,17. Lo importante, daño de la DNA ocurre intuitivamente en cada célula, con una frecuencia significativa. Si no se corrigen estos daños, conducirá a la mutación de la DNA, senescencia celular, la pérdida de integridad de ADN y la célula y posiblemente, enfermedades, entre ellas cánceres mortales. Por lo tanto, conservar la integridad del ADN es esencial para cualquier célula, especialmente iPSCs, que tiene un enorme potencial en la clínica.
Para evaluar la cantidad e integridad del ADN genómico aislado, equipo costoso está disponible en el mercado. Sin embargo, no existen métodos simples y rentables para evaluar la integridad del ADN en las células sin aislar las células. Además, la degradación del ADN inducida por el usuario durante el aislamiento del ADN es uno de los principales inconvenientes en el uso de estos métodos. Las sola célula gel electroforesis (conocido como ensayo cometa)18,19 γH2A.X inmunomarcación8 técnicas y son los enfoques fundamentales en los laboratorios de investigación para la evaluación de daños en el ADN. Estos dos métodos no requieren equipos costosos o ADN genómico aislado para analizar ADN integridad8,20,21. Desde entonces, se han realizado estas técnicas con células enteras; degradación de DNA/RNA/proteína inducida por el usuario durante la preparación de la muestra no afecta a estos protocolos. Para evaluar el daño en el ADN y respuesta del daño de ADN en el tallo y las células derivadas de células madre, presentamos protocolos paso a paso para realizar la inmunomarcación γH2A.X y ensayo de cometa. Por otra parte, la combinación de estos dos enfoques, proponemos una evaluación ingenua que puede utilizarse para evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante.
El ensayo cometa, o unicelulares electrophoresis del gel, las medidas de las roturas de ADN en las células. Células encajadas agarosa de bajo punto de fusión son lisis a nucleoids de forma que contengan ADN superenrollado. Sobre electroforesis, pequeños trozos de ADN fragmentado y hebras rotas de ADN migran a través de los poros de agarosa, mientras que el ADN intacto, debido a su enorme tamaño y su conjugación con la proteína de la matriz, tendrá una migración limitada. El patrón de ADN teñido con un microscopio de fluorescencia imita un cometa. La cabeza del cometa contiene ADN intacto y la cola está compuesta de fragmentos y rota filamentos de la DNA. La fracción del daño del ADN puede medirse por la intensidad de la fluorescencia del ADN dañado (cola de cometa) en relación con la intensidad de (cabeza del cometa) ADN intacta. El momento de la cola de parámetro puede calcularse como se muestra en la figura 1.
Daño del ADN induce la fosforilación de la histona H2A. X (γH2A.X) en Ser139 por quinasas ATM, ATR y DNA-PK. La fosforilación y la contratación de H2A. X en roturas del filamento de ADN se llama ADN daños respuesta (DDR) y ocurre rápidamente después de ADN está dañado. Después de este proceso, detención del ciclo celular mediada por el checkpoint y ADN se inician los procesos de reparación. Después de la realización de la reparación del ADN, γH2A.X es defosforilaciones e inactivado por fosfatasas. Prolongada y múltiples roturas del filamento del ADN conducen a la acumulación de focos γH2A.X en el ADN. Esto indica la incapacidad de la célula para reparar el daño en el ADN y la pérdida de integridad de ADN. Pueden identificarse estos focos γH2A.X en el ADN y el número de focos DDR puede contarse utilizando el protocolo en la sección 2.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de 8 pocillos</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Solución de desprendimiento de células</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Suplemento, sin suero,Gibco</td><td></td> <td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento Matrigel reducido</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>FaloidinaA488</td><td>Tecnología de vida</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-histona H2A. X (Ser139)</td><td>Tecnología de señalización de células</td> de anticuerpos <td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Tinción de gel de ácido nucleico Green I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Invitrogen 16520050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antidecoloración</td></tr></tbody></table>

evaluar la integridad del adn de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Vástago y las células derivadas de células madre tienen enorme potencial como terapia regenerativa para diversas enfermedades degenerativas. El ADN es el almacén de la información genética en todas las células, incluyendo células madre, y su integridad es fundamental para su capacidad regenerativa. Las células madre experimentan rápida propagación en los laboratorios para alcanzar el número necesario para el trasplante. Crecimiento acelerado de células conduce a la pérdida de la integridad del ADN por metabolitos acumulados, tales como reactivo oxígeno carbonilo y agentes alquilantes. Transplante de estas células daría lugar a pobres engraftment y regeneración del órgano del deterioro. Por otra parte, el trasplante las células dañadas DNA conduce a mutaciones, inestabilidad del ADN, senescencia celular y posiblemente, mortales enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, hay una necesidad inmediata de un método de control de calidad evaluar la idoneidad de la célula para el trasplante. Aquí, le ofrecemos protocolos paso a paso para la evaluación de la integridad del ADN de células antes del trasplante de la célula.

Se cultivaron células madre humanas pluripotentes inducidas, y el daño en el ADN y el momento de la cola, que fueron utilizados como una medida de la integridad del ADN, fueron analizados por el ensayo cometa. las células iPS eran incrustadas en agarosa de bajo punto de fusión y coloca en un portaobjetos de vidrio. Las células, entonces, trataron con tampón de lisis, seguido por una solución alcalina, para la obtención de ADN superenrollado. Nucleoids fue electrophoresed y cometas fueron ...

Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Para enfermedades neonatales como la cardiomiopatía, la terapia regenerativa que utiliza células derivadas de células madre pluripotentes inducidas tiene un potencial masivo. Sin embargo, el crecimiento celular acelerado in vitro conduce al daño del ADN por metabolitos acumulados como especies reactivas de oxígeno. El trasplante de estas células dañadas por el ADN resultaría en un injerto deficiente y regeneración del órgano.Antes del trasplante, se debe evaluar la calidad de las células. Aquí proporcionamos dos protocolos paso a paso para evaluar el daño del ADN en las células madre. Demostrando los procedimientos estarán Jessica Miller, una investigadora, Nikhil Mardhekar, investigadora, y Vasanthi Rajasekaran, un técnico de laboratorio.Para empezar, coloque 500 miligramos de agarosa de baja fusión en 100 mililitros de agua libre de ARN de ADN. Calienta la botella en un horno microondas hasta que la agarosa se disuelva. A continuación, coloque la botella en un baño de agua de 37 grados centígrados hasta que sea necesario.Para preparar portaobjetos pre-recubiertos, coloque unas gotas de 0.5% de agarosa en un portaobjetos de vidrio. Esparce inmediatamente la agarosa para formar una fina capa de recubrimiento de agarosa usando un cubreobjetos. Trabajando bajo condiciones de poca luz para evitar daños en las células inducidas por luz ultravioleta, mezcle 10 microlitros de suspensión celular y 90 microlitros de solución de agarosa en un tubo.Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius para evitar que la agarosa se solidifice. Mezclar la solución sin introducir burbujas de aire y pipetear 70 microlitros por punto en el portaobjetos pre-revestido. Usando una punta de pipeta, esparza la mezcla de agarosa celular para formar una capa delgada.Coloque la corredera a cuatro grados Centígrados durante 15 minutos. En un contenedor, sumerja completamente la diapositiva en un búfer de lelisis fría. Coloque el recipiente en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante una hora.Sustituya el búfer de lelisis por una solución alcalina fría. Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas. Después de dejar el recipiente en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante otros 30 minutos, coloque el portaobjetos en un tanque de electroforesis horizontal.Llene el tanque con tampón de electroforesis alcalino frío hasta que las diapositivas estén completamente sumergidas. Aplique tensión a un voltio por centímetro durante 15 a 30 minutos. En un recipiente, sumerja completamente el tobogán en agua fría desionizada.Después de dos minutos, retire el agua desionizada y agregue agua fresca desionizada, y luego repita este paso una segunda vez. A continuación, reemplace el agua desionizada por un 70% de etanol frío. Después de cinco minutos, retire suavemente el portaobjetos sin inclinarlo y déjelo secar al aire.Una vez secado, añadir 100 microlitros de tinte de ADN diluido a cada punto, y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Usando un filtro FITC en un microscopio de epifluorescencia, tome imágenes de 50 a 100 cometas en total por muestra. Cultivo iPS-derivados de cardiomiocitos como se describe en el protocolo de texto.Para ver los cardiomiocitos derivados de iPS en diapositivas de cámara, primero deseche el medio de cultivo de los pozos y lave las células tres veces con PBS. Añadir un mililitro de 0.25%Trypsin por pozo, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Compruebe la placa bajo un microscopio para el desprendimiento de células.A continuación, agregue un mililitro de MMC para detener el Trypsin. Coloque la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y centrifugar durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y 200 veces g. Deseche el medio, agregue un mililitro de MMC y resuspend las células.Cuente las células y ajuste el recuento de células para obtener dos millones de células en 1,6 mililitros de MMC. Ahora siembra 200 microlitros de suspensión celular por pozo de la corredera de ocho pozos. Toque suavemente la diapositiva para extender las células alrededor del pozo.Incubar las células a 37 grados centígrados. Para el tratamiento de doxorubicina de cardiomiocitos derivado de iPS, deseche el medio de cultivo de los pozos de cardiomiocitos derivados del iPS y lave las células con PBS. Tratar las células con doxorubicina de un micromolar durante cuatro horas a 37 grados centígrados.Aspirar el medio y lavar las células con PBS. Para realizar el inmunoetiquetado, lave las células tres veces con PBS y agregue 200 microlitros de 4%paraformaldehído recién preparados a cada pozo. Fijar las celdas durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.Después de lavar las células con PBS, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo por pozo, y bloquee durante 30 minutos en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo y añada 200 microlitros de solución primaria de anticuerpos. Después de incubar durante 45 minutos en una cámara húmeda oscura a temperatura ambiente, lave los pozos tres veces con PBS.Retire el PBS y añada 200 microlitros de mezcla de anticuerpos secundarios. Incubar durante 45 minutos en una cámara húmeda oscura a temperatura ambiente. A continuación, lave los pozos tres veces con PBS.Lavar con agua desionizada antes de montar los portaobjetos con antifade. Coloque un vaso de cubierta y guarde los portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Usando un microscopio confocal, tome de tres a cinco imágenes de campos aleatorios por muestra y proceda al análisis de imágenes.Para contar los focos de respuesta al daño del ADN, descargue e instale CellProfiler. Seleccione file, import, pipeline from the file y elija el archivo de canalización denominado puncti gamma-H2AX. Arrastre y suelte la carpeta que contiene las imágenes adquiridas de los focos gamma-H2AX a la ventana de lista de archivos en la sección de imágenes de módulos de entrada para su análisis.A continuación, siga las instrucciones que se muestran en el protocolo de texto. Para establecer los parámetros de las imágenes, arrastre la imagen deseada para su análisis a la lista de archivos. En módulos de entrada, seleccione imágenes.También en los módulos de entrada, seleccione metadatos y, a continuación, seleccione nombres y tipos. Para grupos, seleccione no. Trabajando en módulos de análisis, seleccione el color a gris.A continuación, seleccione suave, seleccione identificar objetos primarios y, de nuevo, seleccione suavizado. A continuación, seleccione mejorar o suprimir operaciones y, a continuación, seleccione identificar objetos primarios. Sigue trabajando en módulos de análisis, selecciona relacionar objetos, luego clasifica objetos y, finalmente, selecciona exportar a hoja de cálculo.Haga clic en Analizar imágenes en el panel inferior izquierdo para realizar análisis de imágenes. Al completar correctamente el análisis, se generan varias imágenes. Tenga en cuenta el archivo CSV que se genera y se guarda en la ubicación adecuada en el equipo.Este archivo contiene los datos cuantitativos para su análisis posterior. En la hoja de cálculo llamada mi imagen de experimento, la columna B tendrá el número de núcleos que tienen hasta cinco puncti, y la columna D tendrá el número de núcleos que tienen más de cinco puncti. Agregue las columnas B y D para obtener el número total de núcleos.Repita estos pasos para todas las imágenes, cambiando el nombre de archivo de mi experimento antes de cada análisis. Aquí se muestran micrografías representativas de cometas de células iPS tratadas con doxo y no tratadas. Se encontró una cantidad basal de daño en el ADN en las células iPS, expresada como una fracción del daño del ADN y el momento de la cola.Sin embargo, el tratamiento con doxo aumentó el daño del ADN en las células iPS como se esperaba, lo que indica que el ensayo del cometa se puede utilizar para evaluar la integridad del ADN en células madre pluripotentes. Las micrografías representativas del inmunoetiquetado gamma-H2AX se muestran aquí, con un aumento más bajo y con un aumento más alto. En el control de cardiomiocitos derivados de iPS, más del 90% de las células tenían menos de cinco focos DDR por núcleo.Y un total de menos del 10% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Para los cardiomiocitos derivados de iPS cultivados durante seis meses, menos del 90% de las células tenían hasta cinco focos DDR por núcleo, y un total de más del 13% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Mientras que en los cardiomiocitos derivados de iPS tratados con doxo, menos del 80% de las células tenían hasta cinco focos de DDR por núcleo.Y un total de aproximadamente el 24% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Estos datos indican que el cultivo prolongado de células cardiomiocitos derivadas de iPS y el tratamiento con doxo indujeron un daño significativo en el ADN, haciéndolos inadecuados para el trasplante celular. Es muy importante evitar las variables mientras se mezcla la suspensión celular, ya que esto podría afectar la electroforesis.Siguiendo este procedimiento, puede realizar los ensayos de cometas y los procedimientos de inmunoetiquetado con células de varios tipos. Estas técnicas permitirán evaluar las células de varios tipos para el daño del ADN antes de ser utilizadas en estudios de trasplante celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Núcleos están aislados cardíaca a través de la sedimentación y la densidad de immunolabeled con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar y clasificar los núcleos de cardiomiocitos mediante citometría de flujo.

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Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

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Aprenda a evaluar la integridad del ADN en células madre para terapia cardíaca regenerativa usando ensayos de cometa e inmunomarcaje. Estos protocolos garantizan la calidad celular antes del trasplante.

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

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