Name: Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a medir la susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae en agregados bacterianos mediante ensayos de ATP y tinción vivos/muertos. Esta técnica cuantifica la supervivencia tras tratamiento con ceftriaxona.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de salud para D.C.S. y W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., y E.N. fueron apoyadas en parte o participar en el programa "La experiencia y de investigación primer año innovación" financiado por la Universidad de Maryland. Los fundadores no tenían ningún papel en el estudio de diseño, recopilación de datos y análisis, decisión de publicar o preparación del manuscrito. Reconocemos el UMD CBMG Imaging Core para todos los experimentos de microscopía.

1. general mantenimiento de cepas de GC
<ol><li>Raya de cepas de N. gonorrhoeae en el agar de GCK con 1% Kellogg suplementos18 (tabla 1, tabla 2) de las existencias de congelador e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h. uso MS11 expresando fase variable Opa (MS11Opa +), no hay Opa (MS11ΔOpa), o a LOS truncada (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Cuidadosamente escoge pili negativo (Colonia sin borde oscuro) o positivo (Colonia con borde oscuro) colonias de cada cepa basada en morfología de Colonia19 mediante una disección microscopio y raya en una nueva placa de GCK.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 16-18 h antes de su uso.</li>
</ol>2. cuantificación de viabilidad de agregaciones de GC
<ol><li>Recoger el GC mediante un aplicador estéril. Hisopo de GC de la placa y volver a suspender GC en caldo precalentado (GCP, tabla 3) había complementada con 4.2% de NaHCO3 y 1% Kellogg soluciones18. Uso de espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm (un OD650 de 1 = ~ 1 x 109 ufc/mL) para determinar la concentración de bacterias suspendidas.</li>
	<li>Ajustar la concentración de GC ~ 1 x 108 UFC/mL.</li>
	<li>Añadir 99 μl de la suspensión ajustada de GC en los pocillos de una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Incube la placa durante 6 h a 37 ° C con 5% CO2 para permitir que las bacterias a agregado.</li>
	<li>Añadir 1 μl de serie ceftriaxona diluida (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 μg/mL) en cada pocillo. Dejar algunos pozos sin tratamiento como controles.</li>
	<li>Incubar la placa de 24 h a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Someter a ultrasonidos la suspensión 3 veces en cada pozo de 5 s en 144 W y 20 kHz.</li>
	<li>Añada 100 μl de reactivo de resplandor de utilización de ATP disponible en el mercado en cada pozo, pipeta para arriba-abajo 3 veces e Incubar 15 min a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Cuidadosamente transfiera 150 μL de mezcla de cada pozo en un nuevo pozo en una microplaca de 96 pozos negro y evitar la introducción de burbujas.</li>
	<li>Medir la absorbancia de cada pocillo a 560 nm con el lector.</li>
	<li>Calcular la tasa de supervivencia por la relación de la lectura obtenida después del tratamiento de ceftriaxona serial a la lectura de los pozos sin tratar.</li>
</ol>3. análisis microscópico fluorescencia de vivos/muertos de agregados de GC
<ol><li>Recoger el GC mediante un aplicador estéril. GC de la torunda de la placa y GC vuelva a suspender en precalentado media BPC más 1% suplementos Kellogg.</li>
	<li>Determinar el número de bacterias por espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm y ajustar la concentración de GC ~ 1 x 107 UFC/mL.</li>
	<li>Añadir 198 μl de suspensión de la GC en cámaras de 8-bien fondo cubreobjetos.</li>
	<li>Incubar la cámara durante 6 h a 37 ° C con 5% CO2 para permitir la formación de agregación.</li>
	<li>Añadir 2 μl de ceftriaxone (100 μg/mL o varias diluciones) en cada pocillo dentro de cada estado de agregación. Incubar durante el tiempo deseado a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Añadir 0,6 μl de live/dead coloración mezcla de solución en cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Adquisición de imágenes de la serie Z utilizando un microscopio confocal (un microscopio equivalente puede ser utilizado).</li>
	<li>Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ para medición del tamaño de agregados de la GC y la relación de intensidad de fluorescencia (FIR) de vivo a muerto la coloración en cada agregado.</li>
</ol>4. Análisis de la imagen
<ol><li>Estimación del tamaño de agregados bacterianos.<ol>
<li>Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.</li>
		<li>Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación en la imagen del círculo.</li>
		<li>Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.</li>
		<li>Obtener el número en una nueva ventana en la columna de la zona .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación del porcentaje de vivo a muerto de agregaciones<ol>
<li>Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.</li>
		<li>Haga clic en analizar | Establecer las medidas en la barra de menú de ImageJ.</li>
		<li>Comprobar la densidad integrada en la ventana emergente y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Haga clic en imagen | Color | Herramienta de los canales en la barra de menú y seleccionar el Color.</li>
		<li>Ver canal 1 como la fluorescencia de la tinción de bacterias vivas.</li>
		<li>Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación del círculo.</li>
		<li>Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.</li>
		<li>Obtener el número en la columna de IntDen .</li>
		<li>Ver canal 2 como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Repita los pasos 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Obtener la relación de vivo a muerto dividiendo el número de paso 4.2.8 número de paso 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis estadístico<ol>
<li>Abra GraphPad Prism y escriba los números obtenidos de ImageJ a la columna deseada.</li>
		<li>Haga clic en analizar y seleccionar pruebas t bajo análisis de la columna.</li>
		<li>Verifique la columna deseada para la comparación y haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Obtener el valor de P en la ventana de análisis .</li>
		<li>Seleccione la Regresión lineal bajo análisis XY en el paso 4.3.3</li>
		<li>Obtener el R-cuadrado y el Valor de P debajo de la ventana de análisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC obtenid...

La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar la transmisión del organismo y esto puede llevar a complicaciones como enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) y diseminada infección gonocócica (DGI)6. Gonorrea resistente a los antibióticos es una crisis de salud pública importante y un aumento de la carga socioeconómica7. Reducida susceptibilidad a las cefalosporinas ha producido cambio de régimen de tratamiento de un antibiótico único a la terapia dual, que combina la azitromicina o doxiciclina con ceftriaxona8. El mayor fracaso de ceftriaxona y azitromicina9,10, en combinación con infecciones asintomáticas, destaca la necesidad de entender los fracasos de tratamiento de la gonorrea.
La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI), incluyendo agar dilución y disco pruebas de difusión, se ha utilizado como la prueba médica estándar para la identificación de resistencia a un antibiótico. Sin embargo, no está claro si la prueba MIC refleja resistencia antibiótica bacteriana in vivo. La formación de biofilms bacterianos contribuye a la supervivencia de las bacterias en presencia de concentraciones bactericidas de antibiótico: la prueba de MIC es incapaz de detectar este efecto11. Porque la GC puede formar biofilms en superficies de la mucosa12, presumimos que antibiótico susceptibilidad dentro de agregados sería distinta al visto en GC individual. Además, los estudios han demostrado que las moléculas de superficie variable, Pili, opacidad asociada a proteina (Opa) de tres fases, y lipooligosaccharides (LOS), que regulan las interacciones entre bacterias, conducen a diferentes agregados tamaño13, 14 , 15. la contribución de estos componentes para resistencia a los antibióticos no ha sido examinada por la falta de métodos adecuados.
Actualmente, existen varios métodos para medir la eliminación del biofilm. El método cuantitativo más utilizado es mediante la medición de los cambios en la biomasa usando cristal violeta16la coloración. Sin embargo, el método requiere manipulación experimental importante, que potencialmente puede generar errores en el experimento se repite17. El método de coloración en vivo/muerto aquí permite la visualización de bacterias vivas y muertas y su distribución dentro de la biopelícula. Sin embargo, la estructura del biofilm puede plantear como una barrera física que reduce la penetración del tinte. Por lo tanto, para cuantificar las bacterias muertas o vivir dentro de un grupo, la tinción se limita a pequeñas biofilms o su precursor microcolonias o agregaciones. Otros métodos, incluyendo los agar dilución y disco pruebas de difusión, no son capaces de medir los efectos de la agregación. Para examinar la susceptibilidad de la GC dentro de la agregación después de la exposición a antibióticos, un método ideal necesitan tener tanto un ensayo que puede medir viven bacterias y visualizar su distribución.
El procedimiento descrito aquí combina una medida de la utilización del ATP y un vivo/muerto tinción análisis cuantitativo a y examinar visualmente la susceptibilidad de la GC dentro de agregados en presencia de antibióticos.

<table><tbody><tr><td>100x Suplemento</td><td></td><td></td><td></td>de Kellogg's</tr><tr><td>Agar</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC base media&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato férrico, nonahidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina Polvo cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight tinción viva/muerta</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae cepa</td><td></td><td></td><td>amablemente proporcionada por el Dr. Herman Schneider, Walter Reed Instituto del Ejército para Investigación</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Peptona&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Almidón soluble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8 pocillos cámara de fondo deslizante&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Corning, Gabinete</td> de bioseguridad Falcon <td>3370</td><td></td></tr><tr><td>(NU-425-600 Clase II, A2 Campana de riesgo biológico de flujo laminar)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td> Microscopio confocal modelo 3530 <td></td></tr><tr><td>equipado con cámara de imagen en vivo</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Iluminador Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Glomax&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (0.1-10 y micro; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1000 y micro; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (200 y micro; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estériles (1,7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores estériles con punta de poliéster</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>Equivelent a 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de neisseria gonorrhoeae utilización del atp utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.

Dos métodos fueron empleados: un análisis de utilización de ATP y una prueba de tinción vivo/muerto. Los resultados pueden combinar o utilizar individualmente para estudiaron la supervivencia bacteriana en agregados después del tratamiento antibiótico. Ha demostrado el análisis de utilización de ATP para medir exactamente viables bacterias en biofilms de S. aureus 20,21. Aquí, MS11Opa + Pil + cepa fue utilizado para exami...

Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.

Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Esta técnica nos permite medir la susceptibilidad a los antibióticos en condiciones clínicamente relevantes. La técnica también nos permite determinar la verdadera concentración de antibióticos que puede matar bacterias en áridos. Esta técnica se puede aplicar para determinar la concentración necesaria para eliminar los agregados GC.El método también se puede aplicar para medir la susceptibilidad antimicrobiana de cualquier bacteria que sea capaz de formar agregados. Preste atención a los pasos de la lelisis para asegurarse de que la lelisis está completa. De lo contrario, el ensayo de medición de ATP subestimará el número de bacterias viables.La visualización de este método permitirá a otros investigadores seguir y replicar este experimento con consistencia. Comience por rayar Neisseria gonorrhoeae, o cepas de GC, en el agar GCK complementado con 1%Kellogg para una incubación de 16 a 18 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. A la mañana siguiente, utilice un microscopio de luz para seleccionar cuidadosamente colonias pili-negativas sin bordes oscuros o colonias pili-positivas con bordes oscuros de cada plato, y rayar las colonias recogidas en nuevas placas GCK para un cultivo de 16 a 18 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.A la mañana siguiente, utilice un aplicador estéril para recoger colonias de GC de cada plato y resuspender cada hisopo en caldo caliente complementado con 4.2%sodio bicarbonato y 1%Kellogg solución. Mida la densidad óptica a 650 nanómetros, o OD650, para determinar la concentración de las bacterias suspendidas y ajustar la concentración de GC a aproximadamente una por 10 a las ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, agregue 99 microlitros de la suspensión GC en pozos individuales de una placa de 96 pozos y permita que las bacterias se acumule a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante seis horas.Al final de la incubación, añadir un microlitro de ceftriaxona diluida en serie a cada pozo dejando algunos pozos sin tratar para servir como controles y devolver la placa a la incubadora durante otras 24 horas. Al día siguiente, sonicar la suspensión en cada pozo tres veces a 144 vatios y 20 kilohercios durante cinco segundos por sonicación y añadir 100 microlitros de reactivo de brillo de utilización de ATP disponible comercialmente a cada pozo. Transfiera cuidadosamente 150 microlitros de mezcla de cada pozo a pozos individuales de una nueva microplaca negra de 96 pocillos y mida la absorbancia de cada pozo a 560 nanómetros en un lector de placas.A continuación, calcular la tasa de supervivencia por la proporción de la lectura obtenida después del tratamiento antibiótico en serie a la lectura de los pozos no tratados. Para la visualización de los agregados GC vivos/muertos, utilice un aplicador estéril para recoger GC de las placas cultivadas durante la noche y resuspender el GC en medio GCP precalificado complementado con 1%Kellogg. Mida el OD650 por espectrofotometría y ajuste la concentración a aproximadamente una vez 10 a las siete unidades formadoras de colonias por mililitro.A continuación, añada 198 microlitros de suspensión GC en cámaras de ocho pozos de fondo de tapapso e incubar las cámaras a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Al final de la incubación, tratar las bacterias con dos microlitros de ceftriaxona por condición de agregación y devolver las cámaras a la incubadora para el período de incubación experimental adecuado. Al final de la incubación, añadir 0,6 microlitros de solución de tinción viva/muerta en cada pocóy que las cámaras vuelvan a la incubadora durante 20 minutos adicionales.A continuación, utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de la serie z. Para medir el tamaño de los agregados GC, abra la primera imagen en ImageJ y seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación de la imagen. Haga clic en analizar y medir.El tamaño de los agregados se indicará en la columna de área. Para cuantificar la relación de intensidad de fluorescencia de la mancha viva a muerta en cada agregado, haga clic en analizar y establecer mediciones y compruebe la densidad integrada en la ventana emergente. Haga clic en Aceptar y haga clic en la herramienta imagen, color y canales.Seleccione el color y el canal uno como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Seleccione líneas a mano alzada para rodear el área de cada agregación y haga clic en analizar y medir para obtener la relación de intensidad de fluorescencia para cada agregado en la columna de densidad integrada. Seleccione el canal dos para la fluorescencia para la tinción bacteriana viva y mida la intensidad de la fluorescencia en cada agregado como acaba de demostrar.A continuación, divida los datos de intensidad de fluorescencia en vivo por los datos de intensidad de fluorescencia muertos para obtener la relación de intensidad de fluorescencia viva a muerta. En este experimento representativo, las bacterias pili positivas no agregadas, positivas o agregadas y alteradas pili positivas fueron tratadas con diluciones en serie de ceftriaxona antes de la medición de sus niveles de ATP. El GC preagregado demostró una supervivencia significativamente mayor que la GC no agregada o la agregación interrumpida cuando se trata con concentraciones iguales de ceftriaxona o superior.Las cepas Pili-positivas que forman agregados más grandes mostraron los niveles más altos de ATP después del tratamiento con ceftriaxona en comparación con las cepas mutantes. Independientemente de la cepa probada, la tinción viva/muerta antes de que el tratamiento con antibióticos revelara bacterias muertas ubicadas en gran medida en las capas externas del cultivo, mientras que la GC viva se identificó principalmente dentro del núcleo de los agregados tratados con ceftriaxona. Como era de esperar, las bacterias pili-positivas formaron los agregados más grandes, mientras que los cultivos pili-negativos formaron los más pequeños.En particular, los agregados pili-positivos todavía estaban vivos en sus capas principales después del tratamiento con antibióticos, mientras que GC en los pequeños agregados mutantes sueltos estaban muertos. Basado en el tamaño y la supervivencia del GC, se puede trazar un gráfico de correlación para examinar la relación entre el tamaño de agregación y la supervivencia de los antibióticos de las bacterias. La sonicación es importante para asegurarse de que el ATP de cada bacteria individual se libera dentro de los agregados estrechamente unidos.De lo contrario, las mediciones no serán coherentes. Es importante planchar las bacterias después de que se agregan y son tratadas con antibióticos para medir tanto las bacterias viables como las capaces de replicación. La técnica mide la influencia de la agregación de bacterias en la susceptibilidad a los antibióticos permitiendo a los investigadores desarrollar mejores fármacos para el tratamiento de enfermedades.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Evaluación de la filamentación inducida por antibióticos en E. coli mediante ensayo de placa y citometría de flujo

Fuente: Maurakis, S. y Cornelissen, C. N. Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a metales y adquisición de metales de ligandos huéspedes. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento para detectar transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae cultivados en condiciones limitadas de metales mediante un ensayo de transferencia de puntos, que involucra la unión de ligandos, la detección de anticuerpos y...

Detección de los transportadores de metales de superficie en Neisseria gonorrhoeae mediante transferencia de puntos

Este vídeo muestra una técnica in vitro para estudiar el impacto del tratamiento antimicrobiano en los agregados de Pseudomonas aeruginosa (Pa). Las células Pa marcadas con fluorescencia se cultivan como agregados, imitando el patrón de crecimiento durante la infección. Al desafiar los agregados con una concentración subletal del antibiótico colistina, la evaluación en tiempo real de la interacción bacteria-antibiótico se realiza mediante microscopía de fluorescencia.

Una técnica in vitro para el estudio de tratamientos antimicrobianos sobre agregados bacterianos

Este video describe el sencillo ensayo de medición de ATP utilizando el reactivo de brillo de luciferasa. Este ensayo se utiliza para cuantificar la supervivencia de Neisseria gonorrhoeae después del tratamiento con ceftriaxona.

Un ensayo de utilización de ATP para determinar la supervivencia bacteriana bajo tratamiento con antibióticos

Central para el campo de la patogénesis bacteriana es la capacidad de definir si y cómo los microbios sobreviven después de la exposición a las células eucariotas. Este artículo describe protocolos para el uso de colorantes fluorescentes que revelan la viabilidad de las bacterias individuales dentro y asociados con las células huésped.

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Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

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Péptidos antimicrobianos producidos por presión selectiva incorporación de aminoácidos no-canónico

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Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

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Aprende a medir la susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae en agregados bacterianos mediante ensayos de ATP y tinción vivos/muertos. Esta técnica cuantifica la supervivencia tras tratamiento con ceftriaxona.

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