Ingeniería genética de Dictyostelium discoideum las células basada en selección y crecimiento de las bacterias
25 de enero de 2019
Dictyostelium discoideum es un organismo popular modelo para estudiar los complejos procesos celulares tales como la migración celular, la endocitosis y el desarrollo. La utilidad del organismo depende de la viabilidad de la manipulación genética. Aquí, presentamos métodos para transfectar células de Dictyostelium discoideum que superaran las limitaciones existentes de cultivo de células en medios líquidos.
El valor de este protocolo es que permite que casi cualquier cepa de dictyostelium discoideum sea manipulada por genética molecular, independientemente de si dicha cepa crecerá axíricamente en medio líquido o no. La otra ventaja de esta técnica es que es rápida y sencilla. Transponer a células transfectales con un plásmido exocromosomal antes de comenzar a mezclar dictyostelios.
Los resultados ya se pueden validar dos días después de la transfección mediante microscopía. Es inusual trabajar con células de dictyostelio y suspensión de bacterias. La visualización ayudará a dar a los experimentadores una idea de cómo se realizan los diferentes pasos de los protocolos.
Demostrar el procedimiento conmigo será Soudabeh Imanikia, un postdoctorado de mi laboratorio. Para empezar, preparar 1000 mililitros de solución de trabajo de soensen tampón con cloruro de magnesio y cloruro de calcio de acuerdo con el protocolo de texto. Después de esto, utilice una sola colonia de K aerogenes para inocular un litro de medio LB.
Permita que las bacterias crezcan durante la noche a 37 grados centígrados con temblores. Gire las células hacia abajo en dos tubos centrífugos de 500 mililitros para cosechar las células. Luego, lave las bacterias una vez con 500 mililitros de tampón.
Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón. Utilice un fotómetro para comprobar la densidad óptica de la muestra y diluir la muestra con búfer hasta que la densidad óptica sea de aproximadamente 100. Después de esto, prepare el búfer de electroporación H40 de acuerdo con el protocolo de texto.
Crecer K aerogenes para confluir un medio SM durante la noche a temperatura ambiente. Añadir 400 microlitros de suspensión bacteriana a una placa de agar SM y extenderlo uniformemente. Luego, tome un lazo estéril e inocularlo con células de dictyostelio y extienda las células en un borde de la placa.
Incubar la placa a 22 grados centígrados durante dos días, para asegurar que las zonas de crecimiento sean lo suficientemente grandes para la transfección. Agregue 10 mililitros de suspensión de a aerogene K a un plato de Petri tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros. A continuación, utilice un bucle de inoculación desechable de 10 microlitrotros para raspar las células de las zonas de crecimiento de la placa de cultivo.
Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros, que contiene un tampón H40 helado. Gire las células durante dos segundos a 10000 veces la gravedad. A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend las celdas en el búfer H40.
A continuación, agregue 100 microlitros de las células a un tubo que contenga de uno a dos microgramos de ADN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transferir la mezcla de ADN celular a una cubeta de electroporación preenfriada. No añada más de dos microgramos de ADN.
Una mayor concentración de ADN es tóxica para las células y reduce la eficiencia. Después de la electroporación, transfiera inmediatamente las células a una placa Petri preparada de 10 centímetros y permita que las células se recuperen durante cinco horas. Para seleccionar un transfectante para un knock-out, knock-in, o un acto cinco knock-in, separar las células de la placa Petri pipeteando líquido sobre la superficie.
A continuación, configure tres diluciones del agente selectivo de acuerdo con el protocolo de texto. Por último, distribuya 150 microlitros de las diluciones preparadas en cada pocillo de placas de cultivo de tejido plano de 96 pocillos. En este protocolo, se demostró un sistema de plásmido extracromosomico de reportero dual.
32 horas después de la transfección, la mayoría de las células expresaban ambas proteínas fluorescentes de fusión etiquetadas. Un acto cinco M cherry knock-in y un NC4 también se intentó. Se obtuvieron dos bandas después de ejecutar el digestor en un gel de agarosa.
La banda de par base 4127 contiene la construcción deseada. El ADN purificado se utilizó para la transfección de células NC4. Dos clones de la transfección NC4 fueron analizados a través de PCR y ambos mostraron los patrones de banda predichos.
La mancha meridional se utilizó entonces para validar los resultados de la PCR. El NC4 creció más rápido en céspedes bacterianos que las células Ax2. Después de cuatro horas, más de las células NC4 fueron capaces de arrastrarse bajo la agarosa que las células Ax2.
Las células NC4 fueron más rápidas y mostraron una respuesta quimiotáctica más fuerte al folato que las células de Ax2. Utilice siempre las células de las placas SM recién configuradas. Nunca utilice celdas de más de cuatro días, de lo contrario la eficiencia disminuirá.
Las cepas de HAP blancas, recién aisladas y no extensitivas se utilizan comúnmente para abordar preguntas relacionadas con un ruching o comportamiento social de los dictyosteliums. Nuestro permite aplicar la genética molecular a través de esos aislados.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para transfectar células de Dictyostelium discoideum, lo que permite la manipulación genética independientemente de las condiciones de crecimiento de la cepa. El método es eficiente y sencillo, posibilitando la validación rápida de resultados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Manipulación genética
- Organismos modelo
Antecedentes
- Dictyostelium discoideum es un organismo modelo ampliamente utilizado para estudiar procesos celulares.
- La manipulación genética es fundamental para explorar diversas preguntas biológicas.
- Los métodos existentes tienen limitaciones basadas en las condiciones de crecimiento de diferentes cepas.
- Este protocolo tiene como objetivo superar estas limitaciones.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para la transfección de diversas cepas de Dictyostelium discoideum.
- Facilitar aplicaciones de genética molecular en cepas que no crecen de forma axénica.
- Mostrar la eficiencia del proceso de transfección.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones bacterianas y tampón para la transfección.
- Electroporación de células de Dictyostelium discoideum con ADN plasmídico.
- Validación de los resultados de transfección mediante microscopía y PCR.
- Evaluación del comportamiento y crecimiento celular en respuesta a la transfección.
Resultados Principales
- Transfección exitosa de múltiples cepas de Dictyostelium discoideum.
- Expresión de proteínas fluorescentes observada 32 horas después de la transfección.
- Las células NC4 mostraron un crecimiento más rápido y respuesta quimiotáctica en comparación con las células Ax2.
- Validación de las modificaciones genéticas mediante análisis de PCR y blot de Southern.
Conclusiones
- El protocolo permite la manipulación genética eficaz de cepas de Dictyostelium discoideum.
- Proporciona un marco para estudios futuros sobre el comportamiento celular y la genética.
- Las cepas recién aisladas ofrecen los mejores resultados en cuanto a eficiencia de transfección.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la manipulación genética de cepas silvestres de Dictyostelium que crecen sobre bacterias, superando las limitaciones de cepas adaptadas a medios axénicos con señales Ras alteradas. Ofrece un método escalable y rápido para la validación de dianas en un sistema modelo relevante para enfermedades, facilitando la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. Este enfoque extiende la genética molecular a cepas aisladas del ambiente, mejorando la continuidad traslacional y la confianza predictiva en los flujos de trabajo de cribado fenotípico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en vías de señalización y motilidad no alteradas mediante el uso de cepas no axénicas con señalización Ras intacta.
- Valor operativo: Reduce los factores de confusión experimentales derivados de los defectos en macropinocitosis y alteraciones en la migración observados en cepas axénicas.
- Valor predictivo: Facilita la validación funcional de dianas y la reducción del riesgo biológico al permitir la mutagénesis en condiciones de crecimiento fisiológicamente relevantes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera células recombinantes que expresan reporteros fluorescentes duales en menos de 32 horas, lo que permite lecturas rápidas de ensayos para la selección de compuestos.
- Valor operativo: Estandariza el protocolo de transfección mediante céspedes bacterianos y electroforesis, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Escalabilidad: Acelera el proceso desde la transfección hasta la obtención de clones validados, reduciéndolo a días en lugar de semanas, lo que facilita la ingeniería de cepas de alto rendimiento.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el estudio de la quimiotaxis y el comportamiento social en cepas silvestres recién aisladas, mejorando la relevancia del modelo de enfermedad.
- Valor operativo: Permite la aplicación directa de genética molecular a aislamientos ambientales sin necesidad de adaptación axénica previa.
- Continuidad traslacional: Vincula la validación de dianas en fase de descubrimiento con fenotipos preclínicos mediante resultados medibles como la quimiotaxis inducida por folato y los ensayos de penetración en agarosa.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en las etapas iniciales de descubrimiento hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar modelos genéticamente manipulables para la interrogación de vías y el cribado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis en quimiotaxis, macropinocitosis y señalización del desarrollo utilizando cepas silvestres intactas.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia y crecimiento sobre céspedes bacterianos para una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Permite la validación mediante PCR, hibridación Southern y microscopía de modificaciones genéticas en un plazo de 32 a 48 horas tras la transfección.
- Investigación Traducional: Conecta la manipulación genética con ensayos funcionales como quimiotaxis y crecimiento bajo agarosa, aportando información para el avance ajustado al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la ingeniería de cualquier cepa de Dictyostelium, independientemente del origen de aislamiento o de las condiciones de crecimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al eliminar artefactos derivados de la adaptación axénica y restaurar las vías de señalización nativas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la estandarización de preparaciones de tampón, parámetros de electrotransferencia y protocolos de selección.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir los plazos de ingeniería de cepas y permitir decisiones rápidas de continuar/no continuar en la validación de dianas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante la generación de modelos con modificaciones genéticas validadas y desprovistos de riesgos mecanicistas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microbiología para la preparación de cultivos bacterianos y el manejo de Dictyostelium en céspedes bacterianos.
- Depende del acceso a equipos de electroforesis y a infraestructura estéril de cultivo celular para los pasos de transfección y recuperación.
- Necesita la estandarización de la densidad del inóculo bacteriano (OD ~100) y de la preparación del tampón H40 entre diferentes usuarios.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el protocolo a diferentes aislamientos silvestres o cepas ambientales.
- Se limita a cepas capaces de crecer en céspedes bacterianos; la eficiencia disminuye con células mayores de cuatro días posteriores al aislamiento.
