Name: Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende mutagénesis sitio-dirigida mediante PCR de dos y tres pasos para estudiar interacciones ARN-ARN y ARN-proteína en Escherichia coli. Este método versátil permite introducir mutaciones específicas de forma eficiente y económica.

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Los autores desean dar las gracias a subvenciones de la política de acceso abierto Universidad de Dinamarca Meridional.

1. selección de vector
<ol><li>Elegir un vector para realizar experimentos posteriores con. Cualquier vector es aplicable para este método PCR de 2 y 3 pasos.</li>
	<li>Basado en elección del vector, seleccionar enzimas de restricción apropiadas para la clonación.</li>
</ol>2. primer diseño por sitio dirigido mutagénesis
<ol><li>Decidir entre bien la estrategia PCR paso 2 o 3 pasos (paso 2 es sólo para las mutaciones < 200 bp de cualquiera de los extremos de la DNA de interés). Para la PCR de 2 pasos, vaya al paso 2.2 y para la PCR de 3 pasos, vaya al paso 2.3.</li>
	<li>Diseño de primers para PCR de 2 pasos.<ol>
<li>Diseño cartilla 1 y 3 para amplificar el ADN de interés y con 5' de la proyección contiene 4 nucleótidos (por ejemplo, ATAT o AGCT) seguidos por el sitio de reconocimiento de restricción relevante necesario para clonar en el vector elegido.</li>
		<li>Diseño de cartilla 2 presentar mutación en el sitio deseado y flanquean la mutación con 10 a 15 nucleótidos complementarios en ambos lados. Hacer la cartilla reversa si la mutación se introduce en el extremo 5' o hacia adelante si la mutación se introduce en el extremo 3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseño de primers para PCR de 3 pasos.<ol>
<li>Diseño cartilla 1 y 4 para amplificar el ADN de interés y con 5' de la proyección contiene 4 nucleótidos (por ejemplo, ATAT o AGCT) seguidos por el sitio de reconocimiento de restricción relevante necesario para clonar en el vector elegido.</li>
		<li>Diseño de cartilla 2 y 3 presentar mutación en el sitio deseado (s) y la mutación del flanco por 10 a 15 nucleótidos complementarios en ambos lados. Cartilla 2 y 3 son inversa complementaria.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. amplificación por PCR salvaje del tipo de ADN para clonación
Nota: Para más detalles sobre la polimerización en cadena, ver6.
<ol><li>PCR6 usando las cartillas 1 + 2 (2-step PCR) o 1 + 4 (PCR de 3 pasos) y DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener PCR producto I. uso el programa PCR en la tabla 1.</li>
	<li>Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa.<ol>
<li>Hacer un agarose gel solución (2%) mediante la adición de 2 g de agarosa por 100 mL de 1 x Tris-acetato-etilendiaminotetracético ácido (EDTA) (TAE) almacenador intermediario. Disolver la agarosa por ebullición en el microondas. Añadir el bromuro de etidio colorante tinción de DNA (a una concentración final de ~ 0,5 μg/mL) solución para la visualización del gel a la agarosa.</li>
		<li>Gel de agarosa del molde, colocarlo en una unidad de electroforesis y cargar muestras PCR (mezcladas con el tinte de la carga de ADN) y una escalera de ADN de tamaño conocido. Ejecutar ejemplos 75 W por 45 min o hasta que las bandas se separan adecuadamente y visualizar las bandas en una mesa a ultra violeta (UV) o con un gel sistema de imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).</li>
	<li>Almacenar el ADN purificado a-20 ° C (en tampón Tris-EDTA (TE)-almacenamiento a largo plazo) o a 4 ° C (dH2O – almacenamiento de corto plazo) hasta utilizado en el paso 5.</li>
</ol>4. PCR para introducir mutaciones sitio-dirigida de la DNA
<ol><li>PCR para PCR de 2 pasos (ver paso 4.2 para PCR de 3 pasos)<ol>
<li>Realizar PCR6 usando las cartillas 1 + 2 si las mutaciones están en el extremo 5' o 2 + 3 si las mutaciones están en los 3' extremo y utilizar DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR II (ver tabla 1 para el programa PCR).</li>
		<li>Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.</li>
		<li>Purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).</li>
		<li>Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta utilizado en el paso 5.</li>
		<li>Realizar PCR6 usando el producto de PCR II como la cartilla junto con cartilla 3 si las mutaciones están en el extremo 5' o cartilla 1 si las mutaciones están en el extremo 3' y usan la DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR III (ver tabla 1 para el programa PCR).</li>
		<li>Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.</li>
		<li>Purificar el producto de PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).</li>
		<li>Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta el paso 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR para PCR de 3 pasos<ol>
<li>Realizar PCR6 usando las cartillas 1 + 2 y 3 + 4 en reacciones separadas y usar DNA de tipo salvaje como plantilla para obtener el producto de PCR II y III (ver tabla 1 para el programa PCR).</li>
		<li>Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.</li>
		<li>Purificar productos PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).</li>
		<li>Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O).</li>
		<li>Polimerización en cadena6 usando las cartillas 1 + 4 y 2-5 ng de ambos productos de la polimerización en cadena II y III como las plantillas (en la misma reacción) obtener PCR producto IV (ver tabla 1 para el programa PCR).</li>
		<li>Validar la PCR por electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2. Nota: No es inusual conseguir varias bandas incorrecta (se puede a veces reducir con menos plantilla). Sin embargo, los productos PCR incorrecta pueden ser ignorados si la banda de tamaño correcto es suprimida y gel extraído.</li>
		<li>Si es correcta, purificar productos PCR con un kit de extracción de gel (Tabla de materiales) y medir la concentración de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales).</li>
		<li>Tienda purificado ADN a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta el paso 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recombinación de tipo salvaje y mutantes versiones de DNA en el vector elegido
Nota: Para información sobre pasos, ver7.
<ol><li>Digest purificar productos de PCR I y III (de PCR de 2 pasos) o IV (del paso 3 polimerización en cadena) usando las enzimas de restricción relevantes.<ol>
<li>En 20 μl de 1 x de buffer de digestión con 1 μl de cada enzima de restricción, digest 200 ng del producto de PCR a 37 ° C durante 30-60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar el producto PCR digerido por extracción de gel utilizando un kit de extracción de gel (Tabla de materiales), medir la concentración de ADN de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales) y almacenar a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (en dH2 O) hasta que paso 5.6.</li>
	<li>Digerir vector purificado con las enzimas de restricción y tratar con fosfatasa alcalina para disminuir eventos de vector a la ligadura. No tratar a los productos PCR con fosfatasa alcalina.<ol>
<li>En 30 μl de 1 x de tampón de digestión con 1 μl de cada enzima de restricción y 1 μl de la fosfatasa alcalina, digest 1.000 ng del vector a 37 ° C durante 30-60 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vector digerido separada de ADN basura (por ejemplo, vector sin cortar y corte de ADN) mediante electroforesis en gel de agarosa como en el paso 3.2.1 y 3.2.2.</li>
	<li>Purificar el vector digerido por extracción de gel utilizando un kit de extracción de gel (Tabla de materiales), medir la concentración de ADN de DNA purificado con un espectrofotómetro (Tabla de materiales) y almacenar a-20 ° C (en tampón TE) o a 4 ° C (dH2O) hasta que paso 5.6.</li>
	<li>Ligar los productos PCR digeridos en vector digerido con las reacciones que se especifica en la tabla 2.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 2 h o noche a la mañana a 16 ° C.</li>
	<li>Transformar la tensión receptora (por ejemplo, e. coli K12) con reacciones de ligadura.<ol>
<li>Crece tensión en OD600= 0.3-0.5 y transferir 1 mL de la cultura a tantos tubos de 1,5 mL como reacciones de ligasa.</li>
		<li>Centrifugado a 3.500 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender las células en 200 μL de tampón de transformación (10 mL de caldo de lisogenia (LB) con 0,1 g/mL polietilenglicol 3350, 5% dimetil sulfato y 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Agrega reacción de la ligadura y coloque los tubos en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Choque térmico por 2 min a 42 ° C.</li>
		<li>Añadir 1 mL de LB en los tubos de 1.5 mL y permiten la expresión fenotípica de la resistencia a los antibióticos durante al menos 45 min a 37 ° C.</li>
		<li>Girar las células a 3.500 x g durante 5 min., descartar 1 mL de sobrenadante y resuspender las células en el sobrenadante restante.</li>
		<li>Las células en las placas de la placa con los antibióticos apropiados e incubar durante una noche a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar transformantes que vectores con éxito de la integración del inserto de ADN (por ejemplo, por PCR usando las cartillas específicas vector e insertar).</li>
	<li>Validar la secuencia de DNA sanger secuenciación. PRECAUCIÓN: No utilice los mismos cebadores de secuencia como paso 5.9.</li>
</ol>6. usando vectores construidos para los experimentos in vitro o in vivo
<ol><li>Experimento in vivo Nota: Este es un ejemplo de la utilización de un vector para expresar tipo salvaje/mutado RNA para caracterizar la regulación postranscripcional. Para más detalles sobre western blot, ver8.<ol>
<li>Cepas de e. coli K12 con vectores construidos en medio apropiado e inducen la expresión si es necesario. Recolección de muestras por centrifugación.</li>
		<li>Preparar muestras para la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE) por disolver el pellet celular en 1 x de tampón de SDS (62,5 mM Tris-HCl de pH 6.8, 2.5% SDS, azul de bromofenol 0,002%, 5% β-mercaptoetanol, glicerol al 10%) y hierve a 95 ° C por 5 min. Nota: Es posible emitir un gel o un gel prefabricado disponible en el mercado. El último fue utilizado en los resultados presentados en la figura 3 (Tabla de materiales).</li>
		<li>Carga 107 células de cada muestra en pocillos distintos (incluye una escalera de proteína) y corren gel 200 V hasta que las proteínas se separan (aproximadamente 45 minutos).</li>
		<li>Blot las proteínas a una membrana de celulosa por transferencia semiseco en 80 mA durante 1 hora.</li>
		<li>Bloquear la membrana con una mezcla de proteínas (por ejemplo, 5% leche-polvo disuelto en 1 x Tween 20-Tris-buffer salina (TTBS) solución tampón).</li>
		<li>Añadir el anticuerpo primario (disuelto en 1 x TTBS solución tampón) que apuntar de la proteína del interés (e.g., GFP, bandera o HIS-tagged proteína) e incubar durante 1 h con agitación suave.</li>
		<li>Lavar la membrana en 1 x TTBS durante 10 min para eliminar los anticuerpos no Unidos. Repetir dos veces más.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo secundario (disuelto en 1 x TTBS solución tampón) que se dirige a los anticuerpos primarios y permiten la detección (por ejemplo, con peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado anticuerpos secundarios. Incubar durante 1 h con agitación suave.</li>
		<li>Lavar la membrana en 1 x TTBS durante 10 min para eliminar los anticuerpos no Unidos. Repetir dos veces más.</li>
		<li>Visualizar la membrana con una técnica compatible con los anticuerpos secundarios (por ejemplo, por proyección de imagen después de la incubación con un derivado luminol QL, si se utilizó un anticuerpo secundario conjugado con HRP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Experimento in vitro Nota: Este es un ejemplo de usar el vector como una plantilla para la transcripción in vitro de ARN para caracterizar las interacciones RNA-proteína. Para obtener más información sobre EMSA, ver9.<ol>
<li>Hacer la transcripción in vitro utilizando un T7 en vitro kit de transcripción (Tabla de materiales) y vectores en el paso 5 como plantillas.</li>
		<li>Transcritos de RNA por página de un 4.5% de urea de 7 M desnaturalización gel de separar y extraer RNA directamente el gel por elución del electro con los tubos de diálisis (Tabla de materiales).</li>
		<li>RNA de la etiqueta (por ejemplo, radiolabeling con γ -32P-ATP utilizando cinasa T4 Polinucleótido (Tabla de materiales) y purificar nuevamente con columnas (Tabla de materiales). PRECAUCIÓN: Antes de trabajar con material radiactivo, consulte con el oficial de seguridad de radiación local.</li>
		<li>La mezcla RNA etiquetados con el aumento de las concentraciones de proteína en diferentes reacciones en un 1 x de tampón de unión (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Ditiotreitol (DTT)). Nota: en los resultados presentados (figura 4), 2 nM de radiactivo csgD mRNA fue mezclado con un gradiente de la proteína de Hfq de 0 a 2 μm (concentración de monómero).</li>
		<li>Que proteínas y ARN para hibridar antes de cargar la mezcla de hibridación en gel de poliacrilamida no desnaturalizantes y correr el gel durante 1,5 h a 200 V.</li>
		<li>Visualizar el gel con una técnica compatible con el etiquetado de paso 6.1.3. (p. ej., por phosphoimaging si radiolabeling se aplicó).</li>
		<li>Cuantificar la intensidad relativa de las bandas cambiadas de puesto con un programa de procesamiento de la proyección de imagen y ajuste de una curva (sigmoidal) a los datos mediante el uso de un gráfico y software de análisis de datos (Tabla de materiales). Basado en la curva cabida, la valores de constantes de disociación (Kd) se puede determinar automáticamente con el software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.

Mutagénesis sitio-dirigida tiene una amplia gama de aplicaciones, y aquí, se incluyeron como ejemplos de cómo hacer conclusiones biológicas mediante la técnica de los resultados representativos de un experimento in vitro y en vivo. Mutagénesis sitio-dirigida ha sido durante mucho tiempo el estándar de oro para los estudios de interacción de la RNA. La fuerza de la técnica radica en la combinación de la introducción de mutaciones relevantes con posteriores ensayos y experimentos (por ejemplo, western blot o EMSA) para sac...

ADN se refiere a menudo como el plan de acción de una célula viva ya que todas las estructuras de la célula están codificadas en la secuencia de su ADN. Replicación exacta y mecanismos de reparación del ADN aseguran que se producen sólo muy bajas tasas de mutaciones, que es esencial para mantener la correcta funciones de genes codificados. Los cambios de la secuencia del ADN pueden afectar funciones sucesivas en diferentes niveles a partir de ADN (reconocimiento de factores de transcripción y las enzimas de restricción), entonces RNA (complementariedad de pares de base y alteraciones de la estructura secundaria) o proteínas (aminoácidos ácido sustituciones, supresiones, adiciones o cambios de marco). Mientras que muchas mutaciones no afectan significativamente la función gene, algunas mutaciones en el ADN pueden tener implicaciones enormes. Así, la mutagénesis sitio-dirigida es una valiosa herramienta para el estudio de la importancia de sitios específicos del ADN en todos los niveles.
Este protocolo describe un enfoque de mutagénesis dirigida utilizado para introducir mutaciones específicas. El protocolo se basa en dos estrategias diferentes de la polimerización en cadena: un paso de 2 o un PCR de 3 pasos. La PCR de 2 pasos es aplicable si la mutación deseada está cerca del extremo 5' o el extremo 3' del ADN de interés (< 200 pares de bases (bp) desde el extremo) y la PCR de 3 pasos es aplicable en todos los casos.
En el enfoque PCR de 2 pasos, 3 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cartillas 1 y 3, adelante y atrás, respectivamente) y una sola cartilla está diseñada para incorporar la mutación. La mutación de la introducción de la cartilla (cartilla 2) debe tener una orientación inversa, si la mutación está cerca del extremo 5' y una orientación hacia adelante si la mutación es cerca del extremo 3'. En el primer paso de la polimerización en cadena, cartilla 1 + 2 o 2 + 3 amplifica un fragmento pequeño cerca del extremo 5' o 3' final, respectivamente. El producto resultante de la polimerización en cadena se utiliza entonces como una cartilla en el paso dos con la cartilla de 1 o 3, lo que resulta en un producto PCR con una mutación en el ADN de interés (figura 1A).
En la PCR 3 pasos, 4 cartillas están diseñados, en la que está diseñado un conjunto de iniciadores para amplificar el ADN de interés (cebadores 1 y 4, adelante y atrás, respectivamente) y un conjunto de iniciadores está diseñado para incorporar mutaciones específicas con la superposición de complementariedad (cartillas 2 y 3, atrás y adelante, respectivamente). En el paso uno y dos, cartillas 1 + 2 y 3 + 4 amplifican el extremo 5' y 3'. En el paso tres, los productos resultantes de la polimerización en cadena del paso uno y dos se utilizan como plantillas y amplificado con cebadores 1 + 4. Así, el producto resultante de la polimerización en cadena es el ADN de interés con la mutación deseada (figura 1B).
Mientras que el ADN mutado puede usarse para cualquier aplicación posterior, este protocolo describe cómo volver a combinar el ADN en un vector de clonación. El uso de vectores de clonación tiene varias ventajas tales como facilidad de clonación y aplicaciones experimentales específicas dependiendo de características del vector. Esta función se utiliza a menudo para estudios de interacción de la RNA. Otra técnica para estudios de interacción de la RNA es sondear estructural del ARN en complejo con otro RNA1,2 o proteína3,4. Sin embargo, sondeo estructural sólo se realiza in vitro mientras que mutagénesis sitio-dirigida y posterior clonación permiten estudios de interacción in vivo.
Mutagénesis dirigida se ha utilizado extensivamente para estudios de interacción de la RNA presentada aquí. Sin embargo, el método clave acerca de 2 - o 3-step PCR es aplicable a cualquier pieza de ADN y así no sólo se limita a los estudios de interacción de la RNA.
Para ejemplificar la técnica y sus posibles usos, se utiliza la caracterización de las regiones importantes para la regulación postranscripcional de la ARNm, csgD, de Escherichia coli (e. coli). En e. coli, csgD es dirigida por el pequeño ARN no codificante, McaS, en cooperación con una proteína Hfq, para reprimir la expresión de la proteína CsgD2,4,5. La técnica se utiliza para introducir mutaciones en la región de bases entre csgD y McaS y el sitio de unión de Hfq de csgD. El ADN obtenido luego se clona en un vector adecuado para experimentos posteriores. Aplicaciones posteriores de la técnica incluyen experimentos tanto in vivo como in vitro. Para Ilustración, caracteriza en vivo usando un análisis de western blot ejemplo 1 y ejemplo 2 se caracteriza in vitro usando un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA). En ambos casos, es ilustrada cómo dirigida mutagénesis puede utilizarse en combinación con otras técnicas para establecer conclusiones biológicas sobre un gen de interés.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-GroEL producido en conejo</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Estación de trabajo de imágenes</td></tr> de <tr><td>gel Oligo de ADN personalizado</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11 DeNovix</td><td></td><td>NA</td><td>Espectrofotómetro para mediciones de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Colorante de carga de gel de ADN (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio 1 %</td><td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Tubos de diálisis para electroelución</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Sistema de electroforesis horizontal</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG M2 producido en ratón</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Inmunoglobulinas de ratón</td><td>Dako Citomatación</td><td>P0447</td><td>HRP Anticuerpo secundario conjuncionado</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>purificación de ARN</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Gel de proteína Bis-Tris</td><td>Geles Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris para la separación de proteínas</td></tr><tr><td>Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>M0531S</td><td>ADN polimerasa</td></tr><tr><td>PowerPac HC Fuente de alimentación de alta corriente Bio-Rad</td><td></td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Inmunoglobulinas</td><td>Dako Citomatación</td><td>P0448</td><td>HRP conjuncionada anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Herramienta de software de análisis de datos y gráficos</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>máquina de PCR</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa New</td><td>England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligasa</td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagénesis sitio-dirigida para in vitro e in vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la arn en escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ADN para investigar la interacción entre moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) no codificante pequeñas y destino mensajero RNAs (mRNAs). Además, mutagénesis sitio-dirigida se utiliza para asignar sitios de unión de la proteína específica a RNA. Se describe una introducción de PCR basado en 2 pasos y 3 pasos de mutaciones. El enfoque es relevante para todos los estudios de interacciones RNA-RNA y proteína-RNA. En definitiva, la técnica se basa en el diseño de cartillas con la mutación deseada y a través de 2 o 3 pasos de PCR sintetizar un producto PCR de la mutación. El producto PCR entonces se utiliza para la clonación. Aquí, describimos cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con el enfoque de paso 2 y 3 para introducir mutaciones la sRNA, McaS y el mRNA, csgD, para investigar interacciones RNA-proteína y ARN-ARN. Aplicamos esta técnica para investigar las interacciones RNA; sin embargo, la técnica es aplicable a todos los estudios de mutagénesis (por ejemplo, las interacciones DNA proteína, aminoácido sustitución/supresión/adición). Es posible introducir a cualquier tipo de mutación excepto bases no natural pero la técnica sólo es aplicable si un producto PCR se puede utilizar para uso aguas abajo (por ejemplo, clonación y plantilla para más PCR).

Interacción del RNA con respecto a la regulación postranscripcional de csgD, fue elegida una configuración de doble vector: uno para expresar el csgD ARNm y otra para expresar el pequeño ARN no codificante, McaS. csgD fue reproducido en pBAD33, que es un plásmido arabinosa de la copia medio inducible con resistencia a cloranfenicol y McaS fue clonado en mini pNDM220 R1, que es un plásmido de copia baja inducible β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isopropílico con...

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).

Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

La mutagénesis dirigida por el sitio es útil para estudiar las interacciones moleculares, como el ARN-ARN, y las interacciones de proteínas de ARN. Este protocolo describe cómo realizar la mutagénesis dirigida por el sitio con un enfoque de PCR de dos o 3 pasos. Las principales ventajas del método son la diversidad de diferentes mutaciones que se pueden incorporar, así como una relativa facilidad y costo para hacerlo.Para empezar, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación dos, uno y dos, tres, específicos para pares de 2 pasos, o pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, específicos para PCR de 3 pasos para obtener el producto PCR uno. Para validar los productos de PCR mediante electroforesis de gel de agarosa, haga un gel de 2% de agarosa disolviendo dos gramos de agarosa en 100 mililitros de tampón 1X TAE, utilizando un horno microondas. Añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0,5 microgramos por mililitro.Luego echa el gel de agarosa. Cuando se solidifice, colóquelo en una unidad de electroforesis. Cargue una escalera de ADN de tamaño conocido, y las muestras de PCR mezcladas con tinte de carga de ADN en pozos.Ejecuta muestras a 75 voltios durante 45 minutos. Y visualice las bandas en un transiluminador UV o con un sistema de imágenes de gel. A continuación, purificar el producto PCR con un kit de extracción de gel según el protocolo de los fabricantes y medir la concentración del ADN purificado con un espectrofotómetro.A continuación, almacene el ADN purificado en menos 20 grados centígrados en el tampón TE. Para comenzar la mutagénesis dirigida por el sitio con una PCR de 2 pasos, primero utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje, luego la imprimación empareja dos, uno y dos, dos, para cinco mutaciones de imprimación, o pares de imprimación dos, dos y dos, tres para tres mutaciones priment para obtener el producto PCR dos. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.A continuación, utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y el producto PCR dos como la imprimación, junto con la imprimación dos, tres para cinco mutaciones priment, o primera dos, una para tres mutaciones priment, para obtener el producto PCR tres. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. A continuación, almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE.Para comenzar la mutagénesis directa en el sitio con una PCR de 3 pasos, utilice primero la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, uno y tres, dos para obtener el producto PCR dos. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres. Utilice la plantilla de ADN de tipo salvaje y los pares de imprimación tres, tres y tres, cuatro, para obtener el producto PCR tres.Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente. Por último, utilice dos a cinco nanogramos de productos de PCR dos y tres como plantilla junto con los pares de imprimación tres, uno y tres, cuatro, para obtener el producto PCR cuatro. Validar el producto PCR por electroforesis de gel, purificar el producto PCR y medir su concentración como se describió anteriormente.Almacene el ADN purificado a menos 20 grados centígrados en el tampón TE. En este estudio, se utilizaron mutagénesis dirigida por el sitio de 2 y 3 pasos para investigar las interacciones de ARN con respecto a la regulación post transcripción de la CsgD. El CsgD de tipo salvaje fue PCR amplificado para producir PCR producto IA, y el tipo salvaje mcaS fue PCR amplificado para producir PCR producto IB. Utilizando una estrategia de PCR de 3 pasos, los productos de PCR IIA y IIIA se sintetizaron en los dos primeros pasos, e IVA en el tercer paso para introducir mutaciones en CsgD.Del mismo modo, se introdujeron mutaciones gratuitas dirigidas al sitio en mcaS para producir productos de PCR IIB, IIIB, en los dos primeros pasos, y IVB en el tercer paso. El análisis de western blot mostró que si bien la expresión de mcaS de tipo salvaje impide la traducción de la CsgD de tipo salvaje, las mutaciones en mcaS o CsgD alivian la represión observada. Sin embargo, las mutaciones tanto en la CsgD como en la mcaS impiden la traducción de la ENFERMEDAD de Csg.Utilizando una estrategia de PCR de 2 pasos, los productos de PCR IIC, IID, IIE, IIF e IIG, se sintetizaron en el primer paso, y los productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, en el segundo paso para introducir mutaciones en todo el ADN CsgD. Los resultados de la EMSA de la unión HFQ a los ARN mutantes y de tipo silvestre CsgD transcritos in vitro, sintetizados con productos de PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF y IIIG, mostraron el aumento de los valores de KD de los alelos mutantes. Esto demostró que HFQ podría unirse menos eficientemente a los mutantes.Además, HFQ tiene varios sitios de unión en CsgD, lo que se muestra en los tres turnos observados para el ARN de tipo salvaje. Sin embargo, sólo se observan dos sitios de enlace para diferentes ARN mutantes. Por lo tanto, el enfoque mutacional dirigido por el sitio identifica las estructuras primarias o secundarias del ARNm CsgD que son importantes para la unión completa de HFQ.El método de mutagénesis dirigida por el sitio descrito aquí se basa en la PCR. Las buenas prácticas de PCR son cruciales para el método y podrían requerir la optimización para tener éxito. La mutagénesis dirigida por el sitio sólo es poderosa con los tres métodos como EMSA e Western Blotting.Otros métodos, por ejemplo, incluyen varios ensayos estructurales y algunos ensayos de actividad, y estudios de modificación posterior a la traducción.

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Investigación

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Biochemistry

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Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal

Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

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