Name: Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprende a inmovilizar Caenorhabditis elegans con un chip microfluídico ultra-delgado de polidimetilsiloxano que retiene agua. Este método permite irradiación dirigida, ensayos conductuales y observación a largo plazo sin desecación.

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Los autores agradecen el Dr. Atsushi Higashitani Consejo bueno con respecto al tratamiento de C. elegans , los Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota y Yasuhiko Kobayashi para discusiones valiosas. Los autores agradecen el centro genético de Caenorhabditis proveer cepas de C. elegans y e. coli. Agradecemos a la tripulación del ciclotrón de TIARA en QST Takasaki por su amable ayuda con los experimentos de irradiación. Agradecemos al Dr. Susan Furness para editar un borrador de este manuscrito. Este estudio fue apoyado en parte por KAKENHI (beca números JP15K11921 y JP18K18839) de JSP a M.S.

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
<li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li>
<li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li>
<li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li>
<li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li>
<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li>
<li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li>
<li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).</li>
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<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Inmovilización de la en-viruta de C. elegans bajo condiciones vivo usando un chip de microfluidos mojable de PDMS permite la irradiación de microhaz objetivo eficiente de múltiples animales. La facilidad de manejo y características para prevenir la resequedad que este sistema adecuado para aplicaciones en microhaz irradiación, sino también en diversos estudios de comportamiento. Estas hojas gusano ya han sido comercializadas y pueden obtenerse fácilmente. Chips microfluídicos convencional, como astillas de olfat...

Radiación, incluyendo rayos x, rayos gamma y haz de iones pesados, es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas como en el diagnóstico de cáncer y tratamiento y para la cría de la viga de ion. Numerosos estudios y desarrollos técnicos actualmente se centra en los efectos de la radiación1,2,3. Irradiación de microhaz es un medio poderoso de identificación de sitios sensible a la radiación en la vida de los organismos4. La Takasaki avanzado radiación Instituto de nacional institutos de investigación de Quantum y radiológicas de la ciencia y tecnología (QST-Takasaki) ha desarrollado una tecnología para irradiar células individuales bajo observación microscópica con iones pesados microhaces5y ha establecido métodos para permitir la irradiación de microhaz específicas de varios animales modelo, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans4,6gusanos de seda7y Oryzias latipes (medaka japonesa)8. Irradiación de microhaz específicas del nematodo C. elegans permite la caída efectiva de regiones específicas, tales como el anillo del nervio en la región de la cabeza, ayudando así a identificar las funciones de estos sistemas en procesos tales como locomoción.
Se ha desarrollado un método para la inmovilización de la en-viruta de C. elegans individuos sin necesidad de anestesia para permitir la irradiación de microhaz4. Además, para mejorar la microfluídica virutas usadas en el anterior estudio4, recientemente hemos desarrollado chips de microfluídicos mojable, ion-permeable, polydimethylsiloxane (PDMS), contempladas como hojas de gusano (véase Tabla de materiales), para inmovilización de individuos de C. elegans 9. Estos forman parte de hojas de suaves ultra delgadas (espesor = 300 μm; ancho = 15 mm; longitud = 15 mm) con múltiples canales de microfluidos recto (20 o 25) (profundidad = 70 μm; ancho = 60 μm o 50 μm; longitud = 8 mm) en la superficie (figura 1A, D). Los canales de la microfluídica están abiertos y permite que varios animales ser incluido en ellos al mismo tiempo (figura 1E). Las hojas son flexibles para permitir que los canales de microfluidos para ampliar (~ 10%, figura 1F), y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales.
Los canales no hacen daño los gusanos cuando están siendo cerrados o cuando se recogen. Además, las hojas están hechas de PDMS, que es esencialmente hidrofóbicas, pero la retención de agua se logra impartiendo hidrofilia del material. La retención de agua y el espesor son características favorables de las hojas de gusano. La capacidad de retención de agua evita la deshidratación de los animales después de la inmovilización prolongada y permite observaciones a largo plazo para llevarse a cabo.
Además, como se describe anteriormente9, las hojas son sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono (con un rango de aproximadamente 1 mm de agua) para pasar a través de la hoja que encierra a los animales. Esto permite que las partículas de iones para ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Por otra parte, las hojas de gusano pueden ser reutilizadas y así son económicas. Con el método de inyección convencional, los animales incluidos son a veces muertos y no puede ser sacados del canal; sus huevos también pueden obstruir los canales. Esto hace que el chip inutilizables. Chips son, por lo tanto, básicamente disponible y el costo-beneficio relación es pobre.
En el presente trabajo, describimos detalladamente una serie de métodos para la inmovilización de la en-viruta de vivo C. elegans individuos utilizando hojas de gusano. A través de análisis de la locomoción de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta, evaluamos la película cubierta conveniente. Además, mostramos los ejemplos de inmovilización de la en-viruta para observaciones de imágenes y de la irradiación de microhaz.

<table><tbody><tr><td>C. elegans cepa silvestre</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EE. UU.</td><td>N2</td><td>Cepa C. elegans de tipo salvaje generalmente utilizada en este estudio</td></tr><tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutante cepa</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EE. UU</td>. <td>CB4845</td><td>C. elegans cepa solo empleada como ejemplo de mutantes con forma corporal anormal&nbsp;</td></tr><tr><td>C. elegans cepa transgénica HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>HBR4</td><td>El genotipo de esta cepa transgénica C. elegans es HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&ndash; 3' utr, unc-119(+)]V. Esta cepa solo se empleó para la observación por imágenes.</td></tr><tr><td>E. coli cepa</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, EE. UU.</td><td>OP50</td><td>E. coli cepa utilizada como alimento para C. elegans</td></tr><tr><td>Hoja de gusano IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japón</td><td>BCM17-0001</td><td>Chip microfluídico con 25 rectas 50/60-&micro; Canales de ancho m utilizados en todos los experimentos y observaciones en este documento&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoja de gusano 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japón</td><td>BCM18-0001</td><td>Chip microfluídico con 20 60 rectos y micro; Canales de ancho m. Esto es sitable para adultos de 3 a 5 días después de la eclosión a 20 ° C.</td></tr><tr><td>Hoja de gusano 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japón</td><td>BCM18-0002</td><td>Chip microfluídico con 20 50 y micro rectos; Canales de ancho m. Esto es sitable para los adultos ~ 3 días después de la eclosión a 20 ° C.</td></tr><tr><td>MICRO CUBIERTA DE VIDRIO</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Cubreobjetos (espesor: 130-170 y micro; m) utilizado en ensayos de locomoción en Protocolo 3</td></tr><tr><td>Película de poliestireno</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japón</td><td>BCM18-0001 / BCM18-0002</td><td>Artículos agrupados de hojas de gusano. PS filim (espesor: ~130 &micro; m) utilizados en los ensayos de locomoción del Protocolo 3.</td></tr><tr><td>Película de poliéster Lumirror</td><td>TORAY INDUSTRIES, INC., Tokio, Japón</td><td>Lumirror T60 (t 125 y micro; m)</td> <td>PET filim (espesor: 125 y micro; m) utilizado en ensayos de locomoción en el Protocolo 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/plato no tratado</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japón).</td><td>1010-060</td><td>Plato no tratado utilizado en la inciuvación de C. elegans en el Protocolo 1</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/plato no tratado</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japón).</td><td>1010-035</td><td>Plato no tratado utilizado en ensayos de locomoción en el Protocolo 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, Francia</td><td></td><td>Agua ultrapura</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokio, Japón</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm; 200 hojas/caja</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td><td>59-AWP</td><td>Recogedor Platina especializado para recoger C. elegans</td></tr><tr><td>Sistema de microscopio estereoscópico</td><td>de investigación OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td> Micriscopio <td>SZX16</td><td>utilizado en todos los experimentos y observaciones en este documento Soporte de</td></tr><tr><td>enfoque motorizado para SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Este se utilizó para la observación de campo claro en el Protocolo 3-8.</td></tr><tr><td>Lente del objetivo (&times; 1)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td><td>SDFPLAPO1&times; PF</td><td>NA: 0,15; Diámetro exterior: 60 mm. Esto se utilizó para la observación de campo claro en el Protocolo 3-8.</td></tr><tr><td>Lente del objetivo (&times; 2)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA: 0.3; Diámetro exterior: 20 mm. Esto&nbsp; Lends se utilizó para las observaciones de imágenes.</td></tr><tr><td>Fuente de luz de mercurio</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td><td>U-LH100HG</td><td>El amplio espectro de emisión permite realizar una serie de experimentos de imágenes de fluorescencia utilizando todos los fluoróforos comunes.</td></tr><tr><td>SZX16 Unidad de filtro fluorescente (alto rendimiento para YFP)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japón</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Ex: 490-500 nm; Teléfono: 510-560. Esto se utilizó para la observación por imágenes de la cepa HBR4.</td></tr><tr><td>Cámara digital de alta velocidad EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokio, Japón</td><td></td><td>EX-F1 Figura 1B, 1E, 1F, Figura 2A-C y Video 1 se obtuvieron utilizando esta cámara digital.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, EE. UU</td><td></td>. <td>EXCEL Software utilizado para análisis estadísticos</td></tr></tbody></table>

inmovilización de personas en caenorhabditis elegans con un chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiación es ampliamente utilizada para aplicaciones biológicas y para la cría de la viga de ion, y entre estos métodos, irradiación de microhaz representa un medio poderoso para identificar sitios sensible a la radiación en los organismos vivos. Este papel describe una serie de métodos de inmovilización de la en-viruta para la irradiación de microhaz específicas de individuos vivos de Caenorhabditis elegans. En particular, el tratamiento de las virutas de microfluidos de polidimetilsiloxano (PDMS) que desarrollamos anteriormente para inmovilizar a C. elegans individuos sin necesidad de anestesia se explica en detalle. Este chip, conocido como la hoja de un gusano, es flexible para permitir que los canales de microfluidos para ampliarse, y la elasticidad permite a los animales envolver suavemente. También, debido a la capacidad de la adsorción de los PDMS, los animales pueden sellarse en los canales cubriendo la superficie de la hoja de gusano con una película fina de la cubierta, en que animales no se empujan en los canales para el recinto. Girando la tapa de la película sobre, podemos recoger fácilmente los animales. Además, el gusano muestra retención de agua y permite a los individuos de C. elegans a ser sometidos a observación microscópica por largos periodos bajo condiciones vivo. Además, la hoja es sólo 300 μm de espesor, permitiendo que iones pesados tales como los iones de carbono pase a través de la hoja que encierra a los animales, permitiendo que las partículas de iones ser detectado y la dosis de radiación aplicada a medirse con precisión. Porque la selección de las películas de cubierta utilizado para que los animales es muy importante para la inmovilización a largo plazo exitosa, se realizó la selección de las películas de la cubierta conveniente y demostró una recomendada entre algunas películas. Como un ejemplo de aplicación de la viruta, presentamos imágenes observación de actividades musculares de los animales que incluye el canal microfluídico de la hoja de gusano, así como la irradiación de microhaz. Estos ejemplos indican que las hojas Gusano han expandido las posibilidades para experimentos biológicos.

Activo C. elegans individuos podrían ser inmovilizados con éxito usando un PDMS ultrafino, mojable, chip de microfluidos (hoja de gusano). Se investigó la conveniencia de películas de diversa cubierta para el sellado de la hoja de gusano, como se describe en el artículo 3 del protocolo. Para evaluar los efectos de sellado de las películas de la tapa, se determinó la movilidad de los animales 3 h después de la inmovilización de la en-viruta con cubierta de vidrio (espesor: 130-170...

Se ha establecido una serie de métodos de inmovilización para permitir la irradiación dirigida de vivo Caenorhabditis elegans individuos utilizando un microfluídicos polidimetilsiloxano ultrafino recientemente desarrollados de la viruta con retención de agua. Esta novela inmovilización de la en-viruta también es adecuado para observaciones de imágenes. El tratamiento detallado y ejemplos de aplicación de la viruta se explican.

Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Una ventaja de este protocolo es que la hoja de gusanos es fácil de manejar. La hoja tiene características que evitan el secado, lo que nos permite llevar a cabo la irradiación de microbo remos a los animales vivos, realizar varios ensayos conductuales y la observación a largo plazo. Los canales microfluídicos en esta hoja de gusanos están abiertos, por lo que es más fácil recoger animales.Estas hojas de gusano también se pueden utilizar repetidamente, haciéndolos más económicos. Cuando estábamos desarrollando esta técnica, queríamos irradiar sólo una parte de los animales con un micro hacedo bajo un microscopio. Así que necesitábamos fichas claras, muy delgadas capaces de sostener a los animales.Para empezar, coloque una hoja delgada y transparente en el escenario para usarla como película de cubierta inferior. Coloque suavemente una hoja de gusano en la película de la cubierta inferior con pinzas planas. Coloque al menos tres gotas de solución tampón en la superficie de una placa Petri de 6 centímetros sin tratar.Luego, escoge varios C.elegans adultos con un recolector de platina de un plato de cultivo. Transfiera a los animales a una gota con el recolector de platina y permita que los animales naden en tampón para eliminar cualquier bacteria. Lavar a los animales en dos gotas separadas y enjuagar los animales en otra gota.A continuación, coloque una gota de solución de búfer en la superficie de la hoja de gusano. Retire los animales lavados de la gota de tampón y transfiéralos a una gota en la hoja de gusano. Utilice pinzas planas para colocar una película de cubierta PS sobre la hoja de gusanos y presione suavemente sobre los canales de un extremo de la hoja al otro.O simplemente deje caer los animales en gotas y selle suavemente con la película de la cubierta para que las gotas se esparcen entre la cubierta y las hojas de gusanos con los animales dentro del canal. Confirme que los animales están vivos comprobando si hay movimiento con un microscopio con aumento de 1-2x. Registre las posiciones de los animales y observe específicamente el número del canal en el que está encerrado cada animal, y la posición de cada animal en el canal.Para recoger animales inmovilizadores, utilice pinzas planas para retirar la película de cubierta de la hoja de gusano y, a continuación, deje caer entre 10 y 15 microlitros de solución tampón en uno de los canales microfluídicos que encierran a los animales. Bajo el estereomicroscopio, observa a los animales a medida que empiezan a girar. A continuación, utilice el recolector de platina para recoger a los animales de natación y transferirlos a una placa de ensayo.Después de encerrar a los animales como se ha demostrado anteriormente, observe manchas fluorescentes en los animales con un microscopio de harina. A continuación, imagine la propagación de ondas de iones de calcio utilizando la adquisición de vídeo para observar actividades dinámicas. Coloque la hoja de gusano usada en un petri-dish de seis centímetros y coloque alrededor de 100 microlitros de agua ultrapura esterilizada en la hoja.Use los dedos engulatados para esparcir agua en la superficie de la sábana y lavar cualquier contaminante. A continuación, utilice toallitas desechables para eliminar la humedad de la hoja de gusano. Dispensar cinco mililitros de 70% de etanol en el Petri-dish y usar dedos engulo para esparcir el etanol sobre la hoja de gusano.Finalmente, después de que la hoja esté seca, coloque la hoja en un Petri-dish estéril y cubra. Usando este protocolo, se investigó la idoneidad de diferentes películas de portada. No hubo diferencia significativa en la motilidad entre los animales de control y los animales encerrados en canales microfluídicos con película PS.Por el contrario, la motilidad se redujo significativamente en animales encerrados bajo un vaso de cubierta. La motilidad de los animales encerrados con una película para mascotas también disminuyó significativamente. Es importante seleccionar cuidadosamente las películas de cubierta para el sellado de canales microfluídicos.Usando este protocolo, evaluamos la idoneidad de diferentes películas de cubierta a través de ensayos de locomoción de los animales tres horas después de la inmovilización en el chip. Usando esta técnica, teníamos la intención de desarrollar un chip humectable ultrafino sólo para la irradiación de microbios. Sin embargo, estas hojas de gusanos ya se han utilizado para ensayos de imágenes y comportamiento más allá de sus aplicaciones originales.

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Aprende a inmovilizar Caenorhabditis elegans con un chip microfluídico ultra-delgado de polidimetilsiloxano que retiene agua. Este método permite irradiación dirigida, ensayos conductuales y observación a largo plazo sin desecación.

Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua (Video) | JoVE Journal

Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua

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