Name: Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Aprende a cultivar células adrenocorticales primarias de rata para estudiar la esteroidogénesis y la respuesta al estrés. Este protocolo permite analizar la producción de corticosterona mediante ensayos funcionales.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Taiwán de Consejo Nacional de ciencia (NSC102-2320-B-037-008-MY3) y una nacional Cheng Kung University Hospital beca de investigación (NCKUH-10102045).

Todos los procedimientos incluyendo temas animal han sido aprobados por institucional Animal cuidado y uso Comité de Kaohsiung Medical University.
1. experimental procedimiento
<ol><li>Sacrificio de las ratas de SD hembra/macho adulto (8 a 12 semanas de edad) por eutanasia de CO2 .</li>
	<li>Aplicar etanol al 70% y dejar ser absorbidos por la piel y luego limpie la piel con un papel de tejido.</li>
	<li>Colocar la rata en una placa de plástico en la posición supina.</li>
	<li>Levante la piel con unas pinzas curvas "externas" en la línea media y realizar una disección Roma mediante la creación de una forma de "Y" (desde el nivel del muslo en el ángulo subcostal).<ol>
<li>Enjuague tijeras con etanol al 70% y, a continuación, cortar el músculo, creando una forma de "Y".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Encontrar la glándula suprarrenal izquierda detrás del estómago. Nota: la adrenal derecha se encuentra profundamente detrás del hígado.<ol>
<li>Utiliza un par de fórceps para levantar el estómago o el hígado y aislar las glándulas suprarrenales con otro fórceps curvado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de poner las glándulas suprarrenales en un recipiente estéril, retire con cuidado la cápsula suprarrenal con pinzas finas.</li>
	<li>Con un delicado par de tijeras, corte las glándulas suprarrenales en pequeños trozos con un poco poco de Dulbecco sin suero de modificado medio de águila (DMEM) / F-12 medio.</li>
	<li>
Prepare tres pipetas de Pasteur diferentes tamaño de poro y use la primera pipeta de Pasteur para aspirar todas las piezas suprarrenales en un tubo cónico de 50 mL que contiene medio con colagenasa II (~0.5–0.8 mg/mL).
	<ol>
<li>Suavemente triture el tejido de piezas de 10 x. Usar el resto de las pipetas y repita los pasos anteriores hasta que todas las piezas se hacen más pequeñas. Nota: Los tamaños de poro diferentes de las Pipetas Pasteur se pueden crear por calentamiento con fuego. La primera pipeta es el tamaño original (aproximadamente 1 mm), el tamaño del poro del segundo es aproximadamente de 0,8 mm y la tercera pipeta de Pasteur es de aproximadamente 0,5 mm. Durante la digestión, las piezas de la suprarrenal será más pequeño. Así, mediante el procedimiento mecánico, las glándulas suprarrenales pueden ser digeridas más completa. Incubar el tubo en un baño de agua (a 37 ° C) y agitarlo cada 5 min x 4 en total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la incubación de 20 minutos, añadir medio fresco y fresco (sixfold volumen; por ejemplo, 5 mL de tejido + 25 mL de medio DMEM/F-12 cool) que contiene 2,5% suero bovino fetal (FBS) y 5% de suero de caballo para detener el efecto de la enzima.</li>
	<li>Recoger los pellets de células por centrifugación a 800 x g por 10 min.</li>
	<li>Añadir un volumen adecuado de medio para suspender las células. Nota: Cada glándula puede hacer unos ~ 3 x 105 a ~ 4 x 105 células.</li>
	<li>Las células en placas deseadas o platos de la placa con medio de crecimiento (mezcla 1:1 [v/v] de medio DMEM y Ham F-12 complementado con 25 mM HEPES y 1% de penicilina y estreptomicina) durante la noche (día 0) a 37 ° C, en un ambiente humidificado de 95% aire y 5% CO2. Nota: Generalmente, la placa de células en placas de 24 pozos (cuatro glándulas/placa) para el ensayo de corticosterona y en 35 mm platos (una glándula/aproximadamente uno o dos platos) para western blot análisis.</li>
	<li>Lavar cuidadosamente las células 2 x con suero caliente medio DMEM/F-12 (día 1). Vuelva a colocar el nuevo medio de crecimiento.</li>
	<li>Mantener las células a 37 ° C en un ambiente humidificado de 95% aire y 5% de CO2 hasta el día 3.</li>
</ol>

<ol><li>Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrith%2C+CH+%22+Endocrine+System.+Monographs+on+Pathology+of+Laboratory+Animals%22"> Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals</a>. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).</li>
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<li>Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+cell+proliferation+and+steroidogenesis+in+cultured+human+fetal+adrenal+cells+chronically+exposed+to+adrenocorticotropic+hormone%3A+rationalization+of+in+vitro+and+in+vivo+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings.</a> Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).</li>
<li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins%3A+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li>
<li>Hoeflich, A., Bielohuby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+adrenal+gland+growth%3A+signal+integration+by+extracellular+signal+regulated+kinases1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).</li>
<li>O'Hare, M. J., Neville, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+responses+to+corticotrophin+and+cyclic+AMP+by+adult+rat+adrenocortical+cells+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture.</a> Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las glándulas suprarrenales desempeñan un papel clave en la adaptación al medio3. La hormona que segrega la corteza suprarrenal puede regular y ajustar las funciones fisiológicas y homeostasis3. El modelo in vivo refleja los efectos fisiológicos reales en el cuerpo. Sin embargo, todavía está influenciada por muchos factores complejos, causando efectos inestables en experimentos. En contraste, el modelo de célula en vitro tiene ventajas que lo hace incomparable para el model...

El sistema endocrino es responsable de la regulación de actividades fisiológicas y homeostasis1. Glándulas suprarrenales, situadas en el polo craneal de los riñones son uno de los principales órganos endocrinos que secretan mineralocorticoides, glucocorticoides y andrógenos2,3. Hay dos partes distintas de la glándula suprarrenal: la corteza y la médula. La corteza suprarrenal se compone de tres capas: la glomerulosa externa, fasciculada intermedia y los reticularis interno3. La zona glomerular es el sitio original de la secreción de la aldosterona, un mineralocorticoide, que ayuda en la reabsorción de iones de sodio y agua en los riñones3. La zona fasciculada produce principalmente un nivel basal de glucocorticoides en condiciones fisiológicas normales3. Corticosteroides en roedores y cortisol en los seres humanos actúan para ayudar al cuerpo para lidiar con el estrés mediante la regulación de la glucosa de sangre3. Hasta cierto punto, pueden inhibir las respuestas inflamatorias y regulan el sistema inmune4,5. A diferencia de otros mamíferos, ratones y ratas no tienen un reticularis de zona funcional debido a la falta de una expresión de 17α-hidroxilasa en la glándula suprarrenal6,7. Así, las glándulas suprarrenales de las ratas y ratones están desprovistas de la secreción de esteroides de C-19 suprarrenales (cortisol y andrógenos suprarrenales).
Primario las células adrenocorticales cultivadas han demostrado ser útiles para investigar los mecanismos que controlan la fisiología suprarrenal8. Como otros tejidos steroidogenic, cada zona suprarrenal sintetiza sus esteroides colesterol libre9. Sobre el estímulo de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), el colesterol libre se libera de gotitas de lípidos de ruptura y, por lo tanto, mejora la producción de esteroides en el fasciculata y reticularis10.
Muchos grupos han tratado de establecer líneas celulares estables de carcinomas adrenocorticales. Sin embargo, varios problemas han limitado el uso de líneas de células adrenocorticales como en vitro modelos8. Las respuestas de esteroides de las líneas celulares pueden diferir entre pasajes, el número de lote de suero y la calidad del suero, etcetera. Por otra parte, líneas de células suprarrenales comercial (Y1 y SW13) no secretan de corticosterona, lo que es más difícil estudiar la esteroidogénesis suprarrenal8. Uso de bovinas y Equinas, las glándulas suprarrenales como ex vivo modelos pueden ser una buena opción, aunque los tejidos de estos mercados pueden ocultar algunos riesgos desconocidos. En comparación con ellos, dirigiendo las glándulas suprarrenales de rata es más fácil y la fuente es relativamente más estable y libre de patógenos. Tomados en conjunto, el presente método descrito aquí podría utilizarse para investigar el mecanismo relacionado de la síntesis de corticosterona en las células de fasciculada suprarrenal de rata.

<table><tbody><tr><td>Ratas hembra/macho, SD/Wistar (8-12 semanas)Las</td> ratas macho o feminas <td>de BioLASCO</td><td></td><td>son adecuadas para los experimentos. Las glándulas suprarrenales de las hembras son más grandes que las ratas macho, sin embargo, las ratas hembras poseen los ciclos estrales que pueden influir en los experimentos</td></tr><tr><td>Colagenasa, tipo II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td>aislamiento de células suprarrenales</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12800-017</td><td>medios en polvo para células suprarrenales</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>ThermoFisher</td><td>21700-075</td><td>medios en polvo para células suprarrenales</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>TJ.baker</td><td>4018</td><td>tampón (polvo)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>JT.baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Hyclone</td><td>16050014</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>SAFC</td><td>12103C</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10.000 U)-estreptomicina (10.000 ug/mL)</td><td>Antibióticos Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>BRAUN</td><td>BD343R</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>BRAUN</td><td>BD331R</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td><td>BRAUN</td><td>BC224R</td><td>corte piel y músculo de rata</td></tr><tr><td>Tijera delicada</td><td>BRAUN</td><td>BC101R</td><td>corte glándulas suprarrenales</td></tr><tr><td>Proteína relacionada con la diferenciación adiposa</td><td>Abcam</td><td>ab108323</td><td>Anticuerpo para la proteína asociada a gotas de lípidos</td></tr><tr><td>Kit ELISA de corticosterona</td><td>caimán</td><td>500655</td><td>ensayo para la síntesis de corticosterona</td></tr><tr><td>Microscopía de luz invertida Microscopio</td> de fluorescencia <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT.baker</td><td>X198-07</td><td>para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>IgG anti-conejo de cabra Alexa 488 Anticuerpo secundario de flúor</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11034</td><td>para tinción</td></tr> <tr><td>por inmunofluorescenciaAnti-ADFP</td><td>Abcam</td><td>108323</td><td>para la tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant antidecoloración</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>para la tinción por inmunofluorescencia</td></tr></tbody></table>

cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones steroidogenic

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

La hormona que segrega la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. El método descrito aquí es el procedimiento de células suprarrenales primarios de rata cultivadas y ensayos funcionales relacionados (tinción de inmunofluorescencia de proteína superficial de la gota de lípidos, así como análisis de corticosterona). A diferencia de un modelo in vivo, la variación del interexperiments en cultivos monocapa suprarrenal es inferior y la condición experimental es fácil de controlar. Además, la fuente de las ratas también es más estable que otros animales, como bovinos. También hay varias líneas de células suprarrenales humanas (NCI-aviones usados H295 NCI-H295R, SW13, etc.) que pueden utilizarse en estudios suprarrenales. Sin embargo, la producción de esteroides de estas líneas todavía se verá afectada por numerosos factores, que incluyen el número de lote de suero, pasaje número, mutante, pérdida de genes distintos, etcetera. Excepción de falta de 17α-hidroxilasa, el cultivo primario de células adrenocorticales de rata es una técnica mejor y más conveniente para el estudio de fisiología suprarrenal. En Resumen, culturas suprarrenal de la rata principal podrían ser una buena plataforma in vitro por investigadores investigar los mecanismos del reactivo de interés en el sistema de la glándula suprarrenal.

Utilizando el procedimiento descrito aquí, las células suprarrenales cultivadas primarias podían distinguirse bajo el microscopio de contraste de fase (figura 1A). Para confirmar aún más que las vesículas dentro del citoplasma son gotitas del lípido, la tinción de inmunofluorescencia de proteína relacionada con la diferenciación adiposa (ADRP) podría llevarse a cabo en día 3 culturas (figura 1B). Las células fueron cultivadas en ...

La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

El protocolo presentado es muy fácil y ayudará a los investigadores a preparar cultivos suprarrenales primarios. Proporciona un procedimiento fácil para iniciar la esteterogénesis suprarrenal. Esta técnica se puede aplicar en el cribado de las enfermedades relacionadas con el estrés, todas las potencialidades de las respuestas inflamatorias inhibidas por el agente.Demostrando el procedimiento estará Wei-Chang Lee, un estudiante de maestría de mi laboratorio. Comience por esterilizar rata SD eutanizada usando 70%etanol y dejando que se absorba en la piel. Después de limpiar la piel con el papel tisú, coloque la rata en una placa de plástico limpia en la posición supina.A continuación, utilice fórceps curvos externos para levantar la piel en la línea media. Utilice tijeras para realizar una disección contundente de la piel mediante la creación de una forma Y desde el nivel del muslo hasta el ángulo subcostal. Después de enjuagar las tijeras con 70%etanol, cortar el músculo, también creando una forma Y.Localice la glándula suprarrenal izquierda detrás del estómago en la derecha detrás del hígado. Con un par de fórceps estándar y un par de fórceps curvos, levante el estómago y el hígad

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Investigación

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Biología

Médula suprarrenal cromafines sistemas de cultivos celulares son muy útiles para el estudio del acoplamiento excitación-secreción en el establecimiento in vitro. Este protocolo se ilustra el método utilizado para diseccionar las glándulas suprarrenales y luego aislar a la región medular al eliminar la corteza suprarrenal. La digestión de la médula en una sola las células cromafines se demostró entonces.

Ratón cromafín aislamiento de células

En este trabajo se describe la forma típica de aislar y cultivar el corazón de rata adulta miocitos. Colagenasa y la proteasa se utilizan para digerir y aislar a los miocitos individuales. Miocitos cultivadas seguir este protocolo cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos.

Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

La arginina-vasopresina (AVP) controla la puesta a punto de la homeostasis del agua corporal facilitando la reabsorción de agua por las células principales renales. A continuación, se presenta un protocolo para el cultivo de la rata medular interna primaria recoger células de los conductos adecuados para la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la reabsorción de agua AVP-mediada.

El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto

Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.

Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

En este trabajo se presenta un protocolo para aislar y cultivar células madre epiteliales endometriales (reESCs) de rata, generando organoides endometriales de rata. Este método facilita los estudios in vitro de las enfermedades endometriales, permitiendo la edición génica y otras manipulaciones celulares.

Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Se desarrolló un enfoque robusto y reproducible para establecer cultivos primarios 2D de células enriquecidas en zona glomerulosa y zona fasciculata para la corteza suprarrenal del ratón. Este sistema preserva características moleculares y funcionales clave de cada zona, permitiendo una investigación enfocada de las vías de señalización, la producción hormonal y el comportamiento de las células corticales suprarrenales ex vivo.

Establecimiento de cultivos primarios enriquecidos en zonas a partir de la corteza suprarrenal del ratón

Aprende a cultivar células adrenocorticales primarias de rata para estudiar la esteroidogénesis y la respuesta al estrés. Este protocolo permite analizar la producción de corticosterona mediante ensayos funcionales.

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

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