Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría
14 de marzo de 2020
El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.
El propósito de este procedimiento es tener un modelo ex vivo para evaluar la remodelación ósea y recrear el microambiente tumoral-hueso utilizando el cultivo de la calvaria o el co-cultivo con células cancerosas. La mayoría de la técnica de la calvaria es un sistema de cultivo de órganos que utiliza huesos de calvaria de ratones neonatales para evaluar la remodelación ósea. Puede probar el potencial terapéutico de diversas moléculas, o incluso recrear el microambiente tumoral óseo cuando utilice co-cultivos con células cancerosas.
Todo ello en un ensayo sencillo y fácil en poco tiempo y bajo costo. El objetivo de esta técnica es contar con una herramienta para evaluar la regeneración ósea en el microambiente óseo canceroso, utilizando un modelo ex vivo de cultivo de órganos calvariales de ratón. Primero, selecciona un cachorro de ratón y colóquelo debajo del capó.
Usamos calvaria de cachorros de ratón de cinco a siete días de edad. Tome la cabeza con la jeringa, corte la piel y despeje el área del cuero cabelludo lo suficiente para diseccionar la calvaria. Identifique las suturas del cráneo, sagital, coronal y lambdoids.
Haga un corte recto a lo largo de las suturas lambdoide, a aproximadamente el nivel del ojo. Cortar a cada lado, de las suturas lambdoide hacia la sutura coronal. En ángulo 45, haga otro corte para conectar el extremo del corte hecho con el corte del fontanel anterior.
Es extremadamente importante definir las suturas del cráneo, sagital, frontal, coronal, lambdoid, para garantizar la correcta inclusión de tejidos y análisis histología. Con fórceps finos, retire la calvaria y colócala en una cubierta de plato de Petri. Con un bisturí, haz un corte recto desde el fontanel posterior a lo largo de la sutura sagital a través de la sutura coronal.
Se obtienen dos hemicalvarias. Recoge cada calvaria con los fórceps, y colócalos en un nuevo plato de Petri con PBS. Para el cultivo, coloque la hemicalvaria en una placa de cultivo de tejido de 24 pozos, que contenga un mililitro de medios, e incubar durante 24 horas a 37 grados.
También podemos usar cultivos calvariales primarios para reproducir el microambiente tumoral-hueso para la resorción ósea. Para ello, co-cultivamos calvarias con células cancerosas, o con medios condicionados de células cancerosas. 24 horas más tarde, retire el soporte y sustitúyalo por un medio que contenga el tratamiento que desea probar.
Si desea evaluar las células cancerosas y las interacciones óseas, o recrear el microambiente tumoral-hueso, pase la calvaria a una placa de unión celular baja, para evitar la unión de las células cancerosas a la placa. Pruebe las células cancerosas, contarlas y colocarlas cuidadosamente en la parte superior de la hemicalvaria. También puede utilizar medios condicionales de células cancerosas y utilizarlos para incubar las hemicalvarias.
Incubar durante seis a siete días a 37 grados, con cinco por ciento de CO2. Al tercer día, cambie los medios de comunicación y continúe incubando. El número de células que se usan en el co-cultivo depende de la línea celular del cáncer.
Primero necesita optimizar el número de celdas que se necesitan para inducir una respuesta en una. Después de la cultura, la calvaria pasa por un proceso de fijación, descalcificación e incrustada en parafina. Además, los tejidos se se dividen en un microtomo, se tiñen y se realiza un análisis histomorfométrico.
La inclusión de la calvaria puede ser complicada. Para asegurarse de que el tejido está protegido durante la inclusión, puede colocar el tejido entre esponjas o usar un papel tisú u otro papel absorbente antes de ponerlo en el cassette. Para el procesamiento de tejidos, envuelva la hemicalvaria en papel tisú.
A continuación, colóquelo en un cassette de incrustación, y fijar en búfer neutro en formalina, durante 24 horas a cuatro grados. Para descalcificar la calvaria, coloque el cassette en un EDTA del 10% durante 48 horas a cuatro grados. Procesar los casetes de tejido con la hemicalvaria en un procesador automático de tejidos.
Siga un ciclo de rotación de día regular, luego, incluya en la parafina. Para el corte, corte cuatro secciones microticas con un microtoma, monte las secciones en diapositivas de microscopio de vidrio y manche con hematoxilina, eosina. El análisis histológico se utilizó para realizar análisis cuantitativos de la superficie ósea y las áreas de remodelación ósea.
Las imágenes de la calvaria en los siete días fueron analizadas utilizando el software de imágenes. Para la evaluación cuantitativa, primero, defina el área para el análisis. Mira en las secciones de la telopa donde cuatro X para identificar la orientación y las suturas.
Defina la sutura coronal e identifique la superficie ósea larga en un lado, y luego la superficie corta en el otro. Bajo el aumento 40X, identifique la sutura coronal y mueva dos o tres campos ópticos lejos de la sutura, a lo largo de la superficie larga. Capture la imagen de esta área para analizarla.
Puede utilizar el software de imágenes para analizar la integridad estructural del hueso. Se puede realizar un análisis histomorfométrico cuantitativo para el espesor y el área ósea de la hemicalvaria. El análisis correcto de la calvaria depende de una buena incrustación y una orientación adecuada para obtener resultados histológicos consistentes.
Asegúrese de usar al menos tres calvarias por condición experimental. Aquí, podemos ver la estructura del hueso. En naranja, se observa el hueso.
También podemos ver la presencia del periosteo, el ostocito, el endosteo y otras partes del hueso. En nuestro caso, utilizamos insulina para aumentar la remodelación ósea. En comparación con un control, podemos ver un aumento significativo en el área ósea.
Aquí, podemos ver el efecto de la línea celular MDA-MB-231 en el modelo calvaria. Podemos ver, en comparación con el control, que la presencia de células cancerosas induce factores osteolíticos que estimulan la destrucción ósea. Usamos el modelo de calvaria para medir la regeneración ósea y las interacciones entre células cancerosas y huesos por co-cultivos con células cancerosas e histología.
También validamos nuestros datos mediante PCR cuantitativo en tiempo real. Este modelo ex vivo tiene muchas ventajas, como la organización tridimensional y la diversidad celular del hueso se conservan, y las condiciones experimentales se pueden controlar. Además, el modelo es simple, se pueden ver los resultados en un corto período de tiempo, y es de bajo costo.
Y se puede combinar con otras técnicas, como PCR cuantitativa en tiempo real, microscopía y micro-CT.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para el cultivo ex vivo de calotas craneales de ratones recién nacidos, destinado a estudiar la fisiología ósea y evaluar los efectos de fármacos sobre la remodelación ósea. La técnica permite recrear el microambiente tumoral-óseo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fisiología ósea
- Remodelación ósea
- Biología del cáncer
Antecedentes
- Los explantes óseos pueden cultivarse para estudiar procesos fisiológicos.
- Las calvarias de ratones neonatos sirven como modelo para estudios óseos.
- El cultivo conjunto con células cancerosas puede imitar el microambiente tumoral óseo.
- Este método es económico y sencillo.
Objetivo del estudio
- Evaluar la remodelación ósea en un modelo ex vivo.
- Evaluar el potencial terapéutico de diversas moléculas.
- Recrear el microambiente óseo-tumoral.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de calota craneal de ratones recién nacidos.
- Técnicas de cultivo ex vivo para explantes óseos.
- Sistemas de co-cultivo con células cancerosas.
- Evaluación de la regeneración ósea y los efectos de fármacos.
Resultados principales
- Cultivo exitoso de calota para el estudio de la remodelación ósea.
- Posibilidad de probar agentes terapéuticos en un entorno controlado.
- Recreación del microambiente tumor-óseo demostrada.
- El método demostró ser eficiente y de bajo costo.
Conclusiones
- El cultivo ex vivo de calota es una herramienta valiosa para la investigación ósea.
- Facilita el estudio de los efectos de fármacos sobre la fisiología ósea.
- Los sistemas de co-cultivo mejoran la comprensión de las interacciones del cáncer con el hueso.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo de calota ex vivo proporciona un sistema fisiológicamente relevante para evaluar la dinámica de remodelación ósea y las interacciones tumor- hueso en un formato controlado y reproducible. Permite la desintoxicación mecanicista en etapas tempranas de candidatos terapéuticos dirigidos a metástasis ósea u osteoporosis, al mantener la arquitectura tisular nativa y la diversidad celular. El ensayo respalda la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes mediante la cuantificación de respuestas óseas anabólicas y catabólicas bajo condiciones definidas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre las vías de formación y resorción ósea utilizando la co-cultura con insulina o células cancerosas como moduladores.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas al medir los cambios en el área ósea en respuesta a agentes osteolíticos u osteoactivos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir compuestos que estimulan frente a los que inhiben la remodelación ósea en un sistema relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para el ensayo: Genera salidas histomorfométricas cuantitativas estandarizadas para el área de la superficie ósea y el área de remodelación tras la fijación, sección y tinción.
- Reproducibilidad: Requiere un mínimo de tres réplicas biológicas por condición para garantizar un análisis histológico consistente y la fiabilidad de los datos.
- Escalabilidad: Compatible con análisis posteriores como qPCR, microscopía y micro-TC para la validación multiparamétrica de las interacciones hueso-tumor.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la reabsorción ósea inducida por el cáncer mediante células MDA-MB-231 o medio acondicionado para recapitular el microentorno osteolítico.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos in vitro con relevancia in vivo al mantener la organización tisular tridimensional y la diversidad celular del cráneo neonatal.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Aclara si los compuestos en estudio modulan la remodelación ósea mediante efectos directos sobre osteoblastos/osteoclastos o a través de señales mediadas por el cáncer.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, particularmente para agentes moduladores óseos y agentes anticancerígenos con efectos esqueléticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las vías Wnt, RANKL o PTHrP mediante la cuantificación de la formación y la reabsorción ósea en respuesta a moduladores de las vías.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos listos para ensayos sobre el área ósea y la integridad estructural, adecuados para la progresión de descubrimientos iniciales a compuestos líderes.
- Analítica: Permite la comparación estadística del grosor y área óseos entre diferentes condiciones mediante software de imagen y histomorfometría.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al modelar interacciones tumor- hueso relevantes para humanos en un sistema ex vivo murino.
- Reutilización Empresarial: Sirve como una plataforma reutilizable para evaluar compuestos diversos, incluyendo moléculas pequeñas, productos biológicos o medios condicionados, en la fisiopatología ósea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una perspectiva mecanicista sobre la regulación de la remodelación ósea y la comunicación bidireccional entre el cáncer y el hueso, con alta fidelidad fisiológica.
- Valor operativo: Ofrece un sistema ex vivo sencillo, rápido y de bajo costo, con resultados obtenibles en una semana.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir los falsos positivos en la selección de compuestos activos sobre el hueso mediante un modelo relevante para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basándose en efectos validados sobre la formación o la resorción ósea en un contexto de co-cultivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos murinos, procesamiento histológico y análisis histomorfométrico.
- Depende del microtomo, casetes de inclusión, formalina, EDTA y reactivos de tinción para la preparación de tejidos.
- Necesita protocolos estandarizados de orientación y corte para garantizar resultados histológicos y cuantitativos consistentes.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la validación de la preservación del tejido y la viabilidad celular.
- Las limitaciones prácticas incluyen la fragilidad del tejido durante el procesamiento y la necesidad de un manejo cuidadoso para evitar artefactos en la cuantificación de la superficie ósea.
