Medición de la remodelación ósea y recreación del microambiente tumor-óseo utilizando la cocultura calvaria y la histomorfometría
March 14th, 2020
El cultivo ex vivo de explantes óseos puede ser una herramienta valiosa para el estudio de la fisiología ósea y la evaluación potencial de fármacos en la remodelación ósea y enfermedades óseas. El protocolo presentado describe la preparación y el cultivo de calvarias aisladas de cráneos de ratones recién nacidos, así como sus aplicaciones.
El propósito de este procedimiento es tener un modelo ex vivo para evaluar la remodelación ósea y recrear el microambiente tumoral-hueso utilizando el cultivo de la calvaria o el co-cultivo con células cancerosas. La mayoría de la técnica de la calvaria es un sistema de cultivo de órganos que utiliza huesos de calvaria de ratones neonatales para evaluar la remodelación ósea. Puede probar el potencial terapéutico de diversas moléculas, o incluso recrear el microambiente tumoral óseo cuando utilice co-cultivos con células cancerosas.
Todo ello en un ensayo sencillo y fácil en poco tiempo y bajo costo. El objetivo de esta técnica es contar con una herramienta para evaluar la regeneración ósea en el microambiente óseo canceroso, utilizando un modelo ex vivo de cultivo de órganos calvariales de ratón. Primero, selecciona un cachorro de ratón y colóquelo debajo del capó.
Usamos calvaria de cachorros de ratón de cinco a siete días de edad. Tome la cabeza con la jeringa, corte la piel y despeje el área del cuero cabelludo lo suficiente para diseccionar la calvaria. Identifique las suturas del cráneo, sagital, coronal y lambdoids.
Haga un corte recto a lo largo de las suturas lambdoide, a aproximadamente el nivel del ojo. Cortar a cada lado, de las suturas lambdoide hacia la sutura coronal. En ángulo 45, haga otro corte para conectar el extremo del corte hecho con el corte del fontanel anterior.
Es extremadamente importante definir las suturas del cráneo, sagital, frontal, coronal, lambdoid, para garantizar la correcta inclusión de tejidos y análisis histología. Con fórceps finos, retire la calvaria y colócala en una cubierta de plato de Petri. Con un bisturí, haz un corte recto desde el fontanel posterior a lo largo de la sutura sagital a través de la sutura coronal.
Se obtienen dos hemicalvarias. Recoge cada calvaria con los fórceps, y colócalos en un nuevo plato de Petri con PBS. Para el cultivo, coloque la hemicalvaria en una placa de cultivo de tejido de 24 pozos, que contenga un mililitro de medios, e incubar durante 24 horas a 37 grados.
También podemos usar cultivos calvariales primarios para reproducir el microambiente tumoral-hueso para la resorción ósea. Para ello, co-cultivamos calvarias con células cancerosas, o con medios condicionados de células cancerosas. 24 horas más tarde, retire el soporte y sustitúyalo por un medio que contenga el tratamiento que desea probar.
Si desea evaluar las células cancerosas y las interacciones óseas, o recrear el microambiente tumoral-hueso, pase la calvaria a una placa de unión celular baja, para evitar la unión de las células cancerosas a la placa. Pruebe las células cancerosas, contarlas y colocarlas cuidadosamente en la parte superior de la hemicalvaria. También puede utilizar medios condicionales de células cancerosas y utilizarlos para incubar las hemicalvarias.
Incubar durante seis a siete días a 37 grados, con cinco por ciento de CO2. Al tercer día, cambie los medios de comunicación y continúe incubando. El número de células que se usan en el co-cultivo depende de la línea celular del cáncer.
Primero necesita optimizar el número de celdas que se necesitan para inducir una respuesta en una. Después de la cultura, la calvaria pasa por un proceso de fijación, descalcificación e incrustada en parafina. Además, los tejidos se se dividen en un microtomo, se tiñen y se realiza un análisis histomorfométrico.
La inclusión de la calvaria puede ser complicada. Para asegurarse de que el tejido está protegido durante la inclusión, puede colocar el tejido entre esponjas o usar un papel tisú u otro papel absorbente antes de ponerlo en el cassette. Para el procesamiento de tejidos, envuelva la hemicalvaria en papel tisú.
A continuación, colóquelo en un cassette de incrustación, y fijar en búfer neutro en formalina, durante 24 horas a cuatro grados. Para descalcificar la calvaria, coloque el cassette en un EDTA del 10% durante 48 horas a cuatro grados. Procesar los casetes de tejido con la hemicalvaria en un procesador automático de tejidos.
Siga un ciclo de rotación de día regular, luego, incluya en la parafina. Para el corte, corte cuatro secciones microticas con un microtoma, monte las secciones en diapositivas de microscopio de vidrio y manche con hematoxilina, eosina. El análisis histológico se utilizó para realizar análisis cuantitativos de la superficie ósea y las áreas de remodelación ósea.
Las imágenes de la calvaria en los siete días fueron analizadas utilizando el software de imágenes. Para la evaluación cuantitativa, primero, defina el área para el análisis. Mira en las secciones de la telopa donde cuatro X para identificar la orientación y las suturas.
Defina la sutura coronal e identifique la superficie ósea larga en un lado, y luego la superficie corta en el otro. Bajo el aumento 40X, identifique la sutura coronal y mueva dos o tres campos ópticos lejos de la sutura, a lo largo de la superficie larga. Capture la imagen de esta área para analizarla.
Puede utilizar el software de imágenes para analizar la integridad estructural del hueso. Se puede realizar un análisis histomorfométrico cuantitativo para el espesor y el área ósea de la hemicalvaria. El análisis correcto de la calvaria depende de una buena incrustación y una orientación adecuada para obtener resultados histológicos consistentes.
Asegúrese de usar al menos tres calvarias por condición experimental. Aquí, podemos ver la estructura del hueso. En naranja, se observa el hueso.
También podemos ver la presencia del periosteo, el ostocito, el endosteo y otras partes del hueso. En nuestro caso, utilizamos insulina para aumentar la remodelación ósea. En comparación con un control, podemos ver un aumento significativo en el área ósea.
Aquí, podemos ver el efecto de la línea celular MDA-MB-231 en el modelo calvaria. Podemos ver, en comparación con el control, que la presencia de células cancerosas induce factores osteolíticos que estimulan la destrucción ósea. Usamos el modelo de calvaria para medir la regeneración ósea y las interacciones entre células cancerosas y huesos por co-cultivos con células cancerosas e histología.
También validamos nuestros datos mediante PCR cuantitativo en tiempo real. Este modelo ex vivo tiene muchas ventajas, como la organización tridimensional y la diversidad celular del hueso se conservan, y las condiciones experimentales se pueden controlar. Además, el modelo es simple, se pueden ver los resultados en un corto período de tiempo, y es de bajo costo.
Y se puede combinar con otras técnicas, como PCR cuantitativa en tiempo real, microscopía y micro-CT.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para el cultivo ex vivo de calvarias de ratones recién nacidos, destinado a estudiar la fisiología ósea y evaluar los efectos de los fármacos en la remodelación ósea. La técnica permite la recreación del microambiente tumor-hueso.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Fisiología ósea
- Remodelación ósea
- Biología del cáncer
Fundamentos
- Los explantes óseos pueden cultivarse para estudiar procesos fisiológicos.
- Las calvarias de ratones neonatales sirven como modelo para estudios óseos.
- El cocultivo con células cancerosas puede imitar el microambiente tumor-hueso.
- Este método es rentable y sencillo.
Propósito del estudio
- Evaluar la remodelación ósea en un modelo ex vivo.
- Evaluar el potencial terapéutico de varias moléculas.
- Recrear el microambiente hueso-tumor.
Métodos utilizados
- Aislamiento de calvarias de ratones recién nacidos.
- Técnicas de cultivo ex vivo para explantes óseos.
- Sistemas de cocultivo con células cancerosas.
- Evaluación de la regeneración ósea y efectos de los fármacos.
Resultados principales
- Cultivo exitoso de calvarias para estudiar la remodelación ósea.
- Capacidad para probar agentes terapéuticos en un entorno controlado.
- Demostración de la recreación del microambiente tumor-hueso.
- Método demostrado como eficiente y de bajo costo.
Conclusiones
- El cultivo ex vivo de calvarias es una herramienta valiosa para la investigación ósea.
- Facilita el estudio de los efectos de los fármacos en la fisiología ósea.
- Los sistemas de cocultivo mejoran la comprensión de las interacciones del cáncer con el hueso.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
