Caracterización totalmente autónoma y colección de datos de cristales de macromoléculas biológicas
March 22nd, 2019
Aquí, se describe cómo utilizar la selección automática y opciones de recopilación de datos disponibles en algunos beamlines del sincrotrón. Los científicos enviaran muestras de cryocooled el sincrotrón, las propiedades de difracción son evaluadas, los conjuntos de datos son recogidos y procesados y, cuando sea posible, una solución de la estructura se lleva a cabo, todo ello sin intervención humana.
La cristalografía de rayos X es la técnica dominante para determinar la información estructural 3D a partir de proteínas. Las líneas de haz de sincrotrón son necesarias para obtener datos de los cristales pequeños y débilmente difractizantes que producen las proteínas. Massive es una línea de haz única porque automatiza completamente el proceso de recopilación de datos de macromoléculas biológicas.
Desde el montaje de muestras, la ubicación y la recopilación final de datos. La automatización completa de este tipo es muy importante, ya que permite a los investigadores pasar su tiempo en el laboratorio, en lugar de recopilar datos en la línea de haz. La línea de haz también es inteligente y, en promedio, puede recopilar mejores datos que cuando la línea de haz es operada por los seres humanos.
Para comenzar este protocolo, realice el montaje de cristal y solicite el tiempo de haz en Massive uno como se describe en el protocolo de texto. Navegue hasta el sistema de información para las líneas de haz de cristalografía de proteínas, o el sitio web de ISPyB. Elija experimentos MX, inicie sesión con el número de experimento y la contraseña.
Haga clic en el envío, agregue nuevo y proporcione la información necesaria. A continuación, haga clic en Guardar. Haga clic en Agregar parcela y rellene la información solicitada.
Haga clic en Guardar y, a continuación, haga clic en Agregar contenedor. Dar el código de barras del disco como el nombre, y elegir disco de la columna vertebral, de nuevo haga clic en guardar. Haga clic en el símbolo del contenedor y edite, y rellene la información necesaria sobre las muestras, como el nombre de la proteína, el flujo de trabajo preferido y la posición del cristal, en el disco.
Elija la proteína que ha sido aprobada por el grupo de seguridad ESRF. Escriba un nombre de muestra único para identificar cada muestra individual. Opcionalmente, escanee el código de barras del pin.
El resto de la información que se va a incluir también es opcional. Para cada muestra individual, especifique el tipo de experimento. Esto define qué flujo de trabajo automático se utilizará para procesar cada cristal.
Dado que los cristales GCSH son agujas, elija MX presione P.Next, ingrese un grupo espacial. Si está presente, esto se utilizará para los cálculos de estrategia de recopilación de datos y para las líneas de tuberías de procesamiento de datos automáticos disponibles. Introduzca la resolución deseada.
Esto define la distancia de cristal a detector desde los escaneos de malla iniciales, la caracterización y la recopilación de datos predeterminada. Ahora, establezca la resolución de umbral deseada para evitar la recopilación de conjuntos de datos completos de cristales que no difractifien a este límite. Esto puede ahorrar espacio de almacenamiento de datos y analizar el tiempo.
Establezca la integridad necesaria. A continuación, establezca la multiplicidad necesaria. Si hay más de un cristal en el soporte de la muestra, establezca el número máximo de cristales que se analizarán.
El valor predeterminado es uno o cinco para la pulsación MX P.El tamaño de viga adecuado también se puede seleccionar. Coloque el grupo de espacio, si se conoce, en la columna del grupo de espacio de fuerza. A continuación, ajuste la sensibilidad a la radiación de los cristales.
Si lo desea, establezca el ángulo de rotación total que se recopilará para la recopilación completa del conjunto de datos. Una vez que toda la información se ha introducido en el sistema, guarde los valores. Haga clic en, devuelva a los envíos y pulse Enviar envío a ESRF.
Imprima la etiqueta de envío y envíe las muestras. Los usuarios deben organizar una recogida con un mensajero utilizando los detalles de la cuenta ESRF. El día del experimento, las muestras se transfieren al enorme rocío de alta capacidad.
Los científicos de la línea de haz inician la recopilación de datos, que pueden seguir los usuarios de forma remota. Para cada tipo de ejemplo diferente, los usuarios reciben un correo electrónico informándoles de que se ha iniciado la recopilación de datos. La ejecución de todos los pasos en todos los flujos de trabajo se puede seguir en línea y en tiempo real.
Esto es accesible para el usuario iniciando sesión en ISPyB. Los resultados también se pueden ver y descargar. Para cada muestra analizada, examine los resultados del experimento automático en ISPyB.
Haga clic en la sesión experimental deseada en ID30A1. Seleccione la canalización de procesamiento automático preferida. Descargue los datos escritos en el grupo de espacio correcto con la mayor integridad y resolución más alta.
Haciendo clic en el último recoger resultados y luego descargar. El flujo de trabajo MX press P fue utilizado por la línea de haz ESRF Massive one para montar completamente automáticamente, centrarse en el haz de rayos X, caracterizar y recopilar conjuntos completos de datos de difracción de una serie de cristales de GCSH humano. Las muestras fueron montadas y el bucle analizado para un área para escanear.
Después de los análisis de difracción, se seleccionaron cuatro puntos dentro del cristal para la recopilación de datos. La determinación manual de la estructura por reemplazo molecular produjo un mapa de densidad de electrones de alta calidad después de un único ciclo de refinamiento automatizado. Para este conjunto de datos, la canalización automatizada cortó los datos en una resolución de un punto tres angstrom.
Sin embargo, los usuarios pueden decidir cortar los datos con una resolución más baja. La densidad continua de electrones es visible para toda la cadena de aminoácidos, aparte de la etiqueta de histidina eterminal. De las cuatro sustituciones que distinguen la GCSH humana y bovina, tres son fácilmente identificables en la densidad de electrones.
Esto es menos claro para el ácido aspártico a la sustitución de lisina 125. Para lo cual la densidad de electrones de la cadena lateral sólo se resuelve parcialmente debido a la flexibilidad. El modelo obtenido actualmente tiene un valor de trabajo R de 20 puntos cuatro por ciento y un valor libre de R de 23 puntos ocho por ciento y se puede optimizar aún más mediante ciclos adicionales de construcción y refinamiento de modelos automatizados y manuales.
Es importante adaptar los requisitos a su sistema. Por ejemplo, establecer la resolución ya observada en un valor conocido puede ahorrar tiempo y garantizar una mejor recopilación de datos. La recopilación de datos totalmente automática ha democratizado la cristalografía y ahora incluso los laboratorios pequeños pueden embarcarse en un proyecto famoso cuando esto era factible antes sólo con un enorme poder del hombre.
Visión general
Este artículo describe el proceso automatizado de selección y recolección de datos en líneas de haz de sincrotrón para cristalografía de proteínas. El sistema completamente automatizado permite a los investigadores recolectar y procesar datos de muestras crioenfriadas de manera eficiente sin intervención humana.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Cristalografía de proteínas
- Difracción de rayos X
- Automatización en la recolección de datos
Antecedentes
- La cristalografía de rayos X es esencial para determinar estructuras de proteínas.
- Las líneas de haz de sincrotrón son cruciales para obtener datos de cristales que difractan débilmente.
- La automatización mejora la eficiencia y calidad de la recolección de datos.
- Massive one ofrece una línea de haz completamente automatizada para macromoléculas biológicas.
Propósito del estudio
- Demostrar el proceso automatizado de recolección de datos en líneas de haz de sincrotrón.
- Destacar las ventajas de la automatización en cristalografía de proteínas.
- Proporcionar un protocolo detallado para que los investigadores lo sigan.
Métodos utilizados
- Montaje de muestras y envío al sincrotrón.
- Utilización del sistema de información ISPyB para la gestión de experimentos.
- Flujos de trabajo automatizados de recolección y procesamiento de datos.
- Monitoreo en tiempo real de la recolección de datos y análisis de resultados.
Principales resultados
- Recolección exitosa de datos de difracción de alta calidad de cristales de GCSH humano.
- El procesamiento automatizado produjo un mapa de densidad electrónica de alta resolución.
- Identificación de diferencias estructurales entre GCSH humano y bovino.
- Demostración de la efectividad de los flujos de trabajo automatizados en cristalografía.
Conclusiones
- La automatización en la recolección de datos democratiza el acceso a la cristalografía.
- Los laboratorios más pequeños pueden ahora emprender proyectos complejos previamente limitados a instalaciones más grandes.
- La adaptación de los parámetros experimentales puede mejorar la eficiencia de la recolección de datos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
