Name: Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprende a sintetizar una nanoemulsión de ácido oleico-platino(II) estabilizada con el tripéptido lisina-tirosina-fenilalanina para encapsular fármacos antitumorales. Este método biodegradable mejora la administración de cisplatino en cáncer de ovario.

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Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.

1. síntesis del Acids–Platinum(II) ácido oleico conjugado
<ol><li>Activación de cisplatino<ol>
<li>Suspender (0.167 mmol) de 50 mg de cisplatino, en 4 mL de agua (por ejemplo, nanopure) a 60 ° C.</li>
		<li>Añadir gota a gota 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 en 0,5 mL de agua a la solución de cisplatino y revuelva la reacción durante al menos 2 h a 60 ° C. El precipitado blanco de AgCl forma indicando el progreso de la reacción.</li>
		<li>Para determinar si la reacción de activación se ha completado, realice la prueba con 10% ácido clorhídrico la presencia de iones de Ag+ libre en solución. La prueba debe ser negativa (no debe formar más precipitado de AgCl).</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de reacción a 3.220 x g por 10 min y remover el precipitado blanco de AgCl.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 mm. Prueba el sobrenadante para detectar la presencia de platino aplicando 2 ó 3 gotas de la solución mediante pipeta Pasteur al SnCl2 cristales. La prueba es positiva si el color del complejo coordinado de lata con platino es amarillo y naranja oscuro.</li>
		<li>Utilice el sobrenadante con Pt(II) activado para el segundo paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reacción de ácido oleico con Pt(II) activado<ol>
<li>Suspender 94,2 mg de ácido oleico (0.333 mmol) en 3 mL de agua a 60 ° C.</li>
		<li>Añadir 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH en 1 mL de agua y mezclar con la solución de Pt(II) activados en el paso 1.1</li>
		<li>Revuelva la reacción 2 h a 60 ° C y luego a temperatura ambiente durante la noche. El producto crudo es un precipitado marrón/amarillo aceitoso.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla de reacción a 3.220 x g por 10 min y retirar el sobrenadante. Secar el producto crudo a 25 ° C utilizando un evaporador rotatorio. Purifique el producto por múltiples lavados con acetonitrilo. El color final de puro acids–Pt(II) ácido oleico conjugado es amarillo pálido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. síntesis de KYF-Pt-NE y el marcado con FITC nanoemulsión FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Síntesis del tripéptido KYF y el tripéptido marcada fluorescencia FITC-KYF<ol>
<li>Sintetizar la KYF usando química de péptidos de estado sólido estándar. Utilice el estándar siguiente condiciones de acoplamiento para conectar cada aminoácido: Wang resina (2.19 mmol), protegido de Fmoc Aminoácidos (4.38 mmol), tetrafluoroborato 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (TBTU) (4.38 mmol) y diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Disolver los aminoácidos con TBTU en dimetilformamida (DMF) y DIPEA.</li>
		<li>Remoje 5,7 g de resina de alcohol 4-alkoxybenzyl de Fmoc-L-Phe (0.382 meq/g) en 25 mL de DMF para 1 h antes de su uso.</li>
		<li>Desprotejera el grupo amino del aminoácido L-fenilalanina con 15 mL de solución al 20% piperidina/DMF durante 5 minutos, eliminar el disolvente y repetir el lavado con ciclo de 20 minutos.</li>
		<li>Lavar la resina durante 1 min con los siguientes solventes: DMF, alcohol isopropílico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Desechar el disolvente después de cada lavado.</li>
		<li>Realizar la prueba de Kaiser para determinar la presencia de grupo de2 NH libre en la resina (ver pasos) y positivo (la semilla de la resina es morada), añadir los aminoácidos Fmoc-L-tirosina y realizar el acoplamiento durante la noche.<ol>
<li>Preparar a Kaiser prueba soluciones en botellas separadas.</li>
			<li>Disolver 5 g de ninhidrina en 100 mL de etanol.</li>
			<li>Disolver 80 g de fenol en 20 mL de etanol.</li>
			<li>Mezclar 2 mL de solución acuosa de 0,001 M de cianuro de potasio con 98 mL de piridina.</li>
			<li>Añadir 2-3 gotas de cada Kaiser probar soluciones muestra y calor en agua hirviendo durante 5 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Al acoplamiento exitoso del segundo aminoácido, realice la prueba de Kaiser y en caso negativo continuar con protocolo de desprotección (pasos 2.1.3 a 2.1.5). Repita el proceso con el aminoácido fenilalanina Fmoc.<ol>
<li>Al acoplamiento de los aminoácidos, lave la resina durante 1 minuto con 5 mL de DMF, IPA, DMF, metanol, diclorometano y éter dietílico, después de cada lavado deseche el solvente. Guardar la resina para su posterior procesamiento.</li>
			<li>Utilizar la mitad de la resina para los siguientes pasos (2.1.7-2.1.9) para modificar el péptido con FITC. Para obtener el tripéptido KYF sin modificar, siga el procedimiento a partir de 2.1.10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Modificar el aminoácido N-terminal de KYF KYF-N3 con ácido 6-azidohexanoic. Para ello, mezcle 1 g (0.382 mmol) de resina de KYF Wang y 120,1 mg (0.764 mmol) de ácido 6-azidohexanoic con 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU y 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA en 30 mL de DMF. Revuelva la reacción durante la noche a temperatura ambiente.</li>
		<li>Obtener KYF-FITC de la síntesis de KYF-N3 con fluoresceína propargyl vía una reacción de clic. Para ello, mezcle de 253 mg (0.097 mmol) de KYF-N3 Wang resina 3,78 mg (0.019 mmol) de CuI sólido, 71,9 mg (0.193 mmol) de fluoresceína propargyl y 2,24 mg (0.017 mmol) de DIPEA. La reacción debe cambiar de color de verde a marrón.</li>
		<li>Después de 24 h, lavar tres veces la resina durante 1 min alternativamente con 5 mL de DMF y IPA cinco veces, metanol y agua tres veces, DMF y tres veces y con diclorometano y éter dietílico. Desechar el disolvente después de cada lavado.</li>
		<li>Hender el KYF-FITC o péptido KYF de la resina con una solución de ácido trifluoroacético (TFA) / Triisopropilsilano (consejos) / h2O en el cociente del 95/2.5/2.5 más de 3 horas.</li>
		<li>Precipitar el crudo péptido en un éter dietílico frío, luego seco bajo el vacío y lavar tres veces con éter frío.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntesis de nanoemulsión FITC-KYF-estabilizado con ((FITC-KYF-Pt-NE) II) y Pt-KYF-NE<ol>
<li>Disolver 10 mg (0.0126 mmol) de acids–Pt(II) ácido oleico conjugado en 1,5 mL de isopropanol y coloque en una jeringa de 5 mL.</li>
		<li>Colocar la jeringa con acids–Pt(II) ácido oleico conjugado en una bomba de jeringa y ajuste el flujo a 0,1 mL/min.</li>
		<li>Para sintetizar el FITC-KYF-Pt-NE, disolver 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF y 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (relación molar 1:2 de FITC-KYF:KYF) en 20 mL de agua y ajustar la temperatura de la solución a 37 ° C. Cubren las paredes del recipiente con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de fluoróforo FITC. Para sintetizar la NE-Pt-KYF, disolver 2 mg (0,0044 mmol) de tripéptido KYF en 20 mL de agua y ajustar la temperatura de la solución a 37 ° C.</li>
		<li>Añadir el conjugado de ácido oleico acids–Pt(II) gota a gota a la solución de FITC-KYF/KYF o KYF tripéptido. Realizar este paso bajo el capó.</li>
		<li>Agitar la solución durante la noche a temperatura ambiente para evaporar los solventes orgánicos y permitir el uno mismo-Asamblea de FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-ne</li>
		<li>Concentrar el FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-NE en un concentrador centrífugo (10k MWCO) y lavar tres veces con 4 mL de agua nanopure.</li>
		<li>Almacenar las soluciones acuosas de KYF-Pt-NE y FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.</li>
		<li>Análisis de contenido de platino mediante espectroscopia de absorción atómica (AAS), después guía48 del fabricante de la.<ol>
<li>Preparar normas de platino en la solución de ácido clorhídrico 10% para la curva de calibración (alcance efectivo de AAS es entre 100 a 1.200 ppb (partes por billón)).</li>
			<li>Disolver 50 μl de solución de KYF-Pt-NE de paso 2.2 en 100 μl de agua regia (una mezcla 3:1 de ácido clorhídrico concentrado y ácido nítrico) y dejar a temperatura ambiente durante la noche. Agregar 850 μl de agua para alcanzar un volumen de muestra final de 1 mL. Análisis de la muestra mediante AAS. La concentración final de ácido debe ser de 10% en todas las muestras analizadas.</li>
			<li>Registrar la lectura de la concentración de Pt en el MPP y calcular el contenido final de platino de la muestra (cuenta para dilución de la muestra y el volumen inicial de nanoemulsión).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. confocal proyección de imagen de la captación celular de FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>6 líneas de células de cáncer de ovario (A2780 CP70, SKOV3, OV90, TOV21G y ES2), la semilla en 4 platos confocales de cámara bien en la densidad de 4.7 x 104 células por cámara y la cultura durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Después de 24 h, lavar las células tres veces con solución salina buffer fosfato (PBS) e Incube con FITC-KYF-Pt-NE en medio de cultivo celular (ver paso 6.1 para celular línea detalles específicos) por 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la incubación, retirar los medios de comunicación y lavar las células 3 veces con PBS.</li>
	<li>Fijar las células con metanol frío por 5 min a-20 ° C y lavar tres veces con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Permeabilizar las células con 1 mL de 0.1% de Triton X durante 10 min a temperatura ambiente y lavar tres veces con 1 mL de PBS.</li>
	<li>Incube las células durante 90 minutos con LAMP1 anticuerpo conjugado con Alexa Fluor 647 (1 mL) en 1:50 dilución en PBS a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células 3 veces con PBS.</li>
	<li>Diluir la solución madre de DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL en PBS. Luego, añadir 1 mL de la solución diluida a cada cámara e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces con PBS.</li>
	<li>Monte el cubreobjetos sobre un portaobjetos con medio de montaje.</li>
	<li>Imagen de las células con el microscopio confocal de células vivas en longitud de onda de excitación de 405 nanómetro, 488 nm y 633 nm. Configurar los parámetros de detección como sigue: energía del laser de 0.2% y no más del 1%, unidad Pinole 1 ventilado, Gain master offset Digital de 650-750, 0.</li>
	<li>Imagen abierta en software de imágenes. En imagen visualizada, seleccionar gráficos y seleccione Insertar barra de escala, para insertar la barra de escala a la imagen.</li>
</ol>4. drogas liberación estudios
<ol><li>Realizar los estudios de liberación de droga en PBS. Ajuste los valores de pH de tres buffers PBS a 7.4, 6.8 y 5.0 respectivamente.</li>
	<li>Diluir 5 μL de KYF-Pt-NE en 180 μL de tampón PBS de pH apropiado, transferencia a 3.5 taza de diálisis mini de MWCO kDa e incubar a 37 ° C en PBS.</li>
	<li>Elimine el tampón cada tres tubos de diálisis mini en 2, 4, 6, 24, 48 y 140 h y medir las concentraciones de platino por AAS. Preparar las muestras según el paso 2.2.8 pero ajustar el volumen final de la muestra de 500 μl.</li>
</ol>5. métodos de cultivo celular
<ol><li>Cultivo celular líneas A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 en la célula cultura medio (DMEM) suplementado con 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) o con suero bovino fetal (FBS), de 15% (TOV 21G, OV-90) con L-glutamina y penicilina/estreptomicina. Crecen todas las células en un 5% CO2, ambiente saturado de agua a 37 ° C.</li>
	<li>Semillas 3 x 105 células cada placa de 96 pocillos y la cultura durante la noche para los experimentos de incubación in vitro. Preparar las soluciones KYF-Pt-NE, el cisplatino y el carboplatino en el agua. Ajustar la concentración de Pt(II) en KYF-Pt-NE para que coincida con la concentración de carboplatino y cisplatino para cada línea celular. Incubar por 72 horas a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la incubación, evaluar la viabilidad celular mediante un ensayo colorimétrico (el ensayo de MTT la proliferación celular). Brevemente, quite medio y añadir 110 μL de 10% MTT en medio a cada uno bien e incubar por 2 h a 37 ° C. Luego agregar 100 detergente μL a cada pozo e incubar durante 5 h a 37 ° C.</li>
	<li>Compruebe la absorbancia a 570 nm usando el lector de placas. Analizar los resultados utilizando el análisis estadístico con la prueba Z y prueba de P.</li>
</ol>

Autores no tienen un conflicto de interés que revelar.

Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condiciones sintético...

En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1, 5,6. Materiales derivados biológicamente, tales como proteínas y péptidos, durante mucho tiempo han sido reconocidos como componentes prometedores de nanoestructuras multifuncionales debido a su flexibilidad de secuencia7,8. Péptidos, uno mismo-montar en arquitecturas supramoleculares altamente ordenadas formación helicoidal cintas9,10, andamios fibroso11,12y muchos más, allanando así el camino para la construcción Nanoestructuras basados en biomoléculas híbrido utilizando un fondo enfoque13.
Péptidos se han explorado para aplicaciones en medicina y biotecnología, especialmente para la terapia contra el cáncer14 y enfermedades cardiovasculares15 así como en cuanto a desarrollo de antibiótico16,17, metabólicos trastornos18y19de las infecciones. Hay más de un centenar de pequeños péptidos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos20. Péptidos son fáciles de modificar y a sintetizar a bajo costo. Además, son biodegradables, que facilita sus aplicaciones biológicas y farmacéuticas21,22. El uso de péptidos como componentes estructurales incluye la ingeniería de nanopartículas basada en péptidos, sensibles y depósitos de hidrogel para liberación controlada23,24,25,26 , 27, biosensores basados en péptidos28,29,30,31o dispositivos bio-electrónicos32,33,34. Lo importante, se encontraron péptidos cortos incluso con dos o tres residuos de aminoácidos que incluyen fenilalanina para guiar a la uno mismo-Asamblea35,36,37 los procesos y crear emulsiones estabilizadas38 .
Fármacos basados en platino, debido a su alta eficacia, se utilizan en muchos regimenes de tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con otros agentes39,40. Compuestos de platino inducen daño en el ADN por formación de enlaces cruzados de monoadducts e intrafilamentoso o interstrand. Las lesiones de Pt-ADN son reconocidas por la maquinaria celular y, si no se repara, conducen a la apoptosis celular. El mecanismo más importante, por que Pt(II) contribuye a la muerte de la célula de cáncer, es la inhibición de DNA transcripción41,42. Sin embargo, los beneficios de la terapia de platino son disminuidos por la toxicidad sistémica de Pt(II) que provoca efectos secundarios graves. Esto conduce a baja dosificación clínicos de Pt(II)43, que a menudo resulta en concentraciones subterapéuticas de platino alcanzando el ADN. Como consecuencia, la reparación del ADN que sigue contribuye a la supervivencia de la célula de cáncer y adquisición de resistencia de Pt(II). La quimio-resistencia del platino es un problema importante en la terapia contra el cáncer y la principal causa de fracaso de tratamiento44,45.
Hemos desarrollado un estable nanosistemas que encapsula al agente Pt(II) para proporcionar un efecto protector en la circulación sistémica y a disminuir los efectos secundarios inducidos por el Pt II. El sistema se basa en un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) estabilizado con un tripéptido KYF para formar una nanoemulsión (KYF-Pt-NE)46. Los bloques de edificio de KYF-Pt-NE, los aminoácidos de la tripéptido así como el ácido oleico, poseen el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) con alimentos y drogas (FDA). KYF-Pt-NE se prepara utilizando un método de nanoprecipitation47. En Resumen, el acids-Pt(II) oleico conjugado es disuelto en un solvente orgánico y luego se agrega gota a gota a una solución acuosa de KYF (figura 1) a 37 ° C. La solución se agita durante varias horas permitir que uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-ne La nanoemulsión está concentrada en concentradores centrífugos de 10 kDa y lavaron tres veces con agua. La modificación química de KYF con un fluoróforo permite la síntesis de FITC-KYF-Pt-NE fluorescente adecuado para la proyección de imagen biomédica.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Plato confocal de 4 pocillos</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Para la obtención de imágenes</td></tr> del <tr><td>ácido 6-bromohexanoico</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Modificación de clic para el péptido</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Generosamente realizado por el profesor John Martignetti del Hospital</td><td></td> Mount Sinai <td>Línea celular de cáncer de ovario</td></tr><tr><td>Barnstead</td><td>Nanopure Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>sistema de filtración de agua</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Para la eliminación de disolventes y el secado de muestras</td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Para la separación de complejos de platino</td></tr><tr><td>Cis-diclorodiaminaplatino (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>pruebas in vitro</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Generosamente diseñado por el profesor John Martignetti del Hospital</td><td></td> Mount Sinai Línea celular de <td>cáncer de ovario</td></tr><tr><td>Baño de agua digital</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Para calentar medios para cultivos celulares</td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de la luz (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Para mediciones de tamaño de nanopartículas</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>línea celular de cáncer de ovario</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys (Boc)-OH 99.79%</td> <td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe Resina de alcohol 4-alcoxibencílico (0,382 meq/g),</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 HERACELL 150i</td><td>Incubadora Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa de alta presión</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Para la adición de complejos de platino en la síntesis de nanopartículas</td></tr><tr><td>Placa calefactora/agitador</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Para la agitación y el calentamiento</td></tr> <tr><td>de muestrasAnticuerpo LAMP-1 (cojugado con Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Para imágenes</td></tr><tr><td>de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical 005027</td><td></td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninhidrina 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Prueba Kaiser</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01421</td><td>Para la síntesis de complejo de platino</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Línea celular de cáncer de ovario</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Para lavado de células</td></tr><tr><td>Medio de montaje Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Prueba Kaiser</td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico Fisher</td><td>Chemical</td><td>A248-25</td><td>tinción negativa para TEM</td></tr><tr><td>Piperidina 99%</td><td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>SPPS Platino AAS estándar soultion</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug/ml para curva de calibración</td></tr><tr><td>Bromuro de propargilo 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Para la modificación alquina de la fluoresceína</td></tr><tr><td>Gabinete biológico científico</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood para cultivo celular</td></tr><tr><td>Sistema de vacío autolimpiante</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Bomba de vacío para rotavapor</td></tr><tr><td>Nitrato</td><td>de plata Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Activación de cisplatino</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Línea celular de cáncer de ovario</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Para la síntesis del complejo de platino</td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>estaño (II)Sigma Aldrich</td><td>208256</td><td>Prueba de presencia de platino</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Línea celular de cáncer de ovario</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético 99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Polvo de uranina 40%</td><td>Fisher Scientific S25328A</td><td></td><td>Para la modificación de alquinos de la fluoresceína</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorio</td><td>VS2001</td><td>Para el lavado y la condensación de nanopartículas</td></tr><tr><td>Microscopio invertido VWR</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Para la monitorización de cultivos celulares</td></tr></tbody></table>

una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.

Imagen de TEM representante de KYF-Pt-NE preparado mediante este protocolo se muestra en la figura 2A. KYF-Pt-NEs son esféricos en morfología, bien dispersa y uniforme en tamaño. El diámetro del núcleo de KYF-Pt-NEs, medido directamente en tres imágenes TEM con un mínimo de 200 medidas hecho, es 107 ± 27 nm. Diámetro hidrodinámico de KYF-Pt-NE, analizada mediante espectroscopia de luz dinámica (DLS), fue encontrado para ser 240 nm con un índice de polidispers...

Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Dada la amplia gama de secuencias de péptidos cortos, este método se puede extender a muchos otros diseños de nanopartículas. La modificación del péptido puede hacer que el sistema sea adecuado para fines de diagnóstico. Encapsular el platino anticascológico en medicamentos con agente estabilizador biodegradable de baja toxicidad es muy relevante para aplicaciones farmacéuticas.Los estudios preliminares en vivo con cáncer de ovario son prometedores y se investigarán más a fondo. Para empezar, suspende 50 miligramos de cisplatino en cuatro mililitros de agua ultrapura a 60 grados centígrados. Agregue la solución de nitrato de plata a la solución de cisplatino y revuelva la mezcla a 300 a 400 RPM durante dos horas a 60 grados centígrados en la oscuridad.Después de eso, utilice 10%en peso ácido clorhídrico para confirmar que no hay iones de plata libres en la solución. Si no se forma cloruro de plata adicional al agregar ácido clorhídrico, centrifugar la mezcla a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros.A continuación, pruebe el filtrado en busca de platino aplicando de dos a tres gotas a 10 dos cristales de cloruro. El platino está presente si la suspensión se vuelve marrón oscuro o naranja. A continuación, añadir 13,3 miligramos de hidróxido de sodio en un mililitro de agua en 94,2 miligramos de suspensión de ácido oleico en tres mililitros de agua a 60 grados centígrados.Revuelva la mezcla durante dos horas a 60 grados centígrados. Luego, apague el fuego y continúe revolviendo a temperatura ambiente durante 16 a 24 horas para obtener el producto crudo como un precipitante aceitoso, de color amarillo-marrón. Centrifugar la mezcla de reacción a 3, 220 veces la gravedad durante 10 minutos, y retire el sobrenadante.Seque los productos en un evaporador rotatorio a 25 grados centígrados. Suspenda el producto crudo en cinco mililitros de acetonitrilo mediante vórtice y recuperando el producto por centrifugación. Repita este proceso de lavado al menos dos tres veces más para obtener el conjugado puro de ácido oleico platino II como un sólido amarillo pálido.En primer lugar, remojar 5,7 gramos de L-fenilalanina protegida Fmoc funcionalizada resina Wang en 25 mililitros de dimetilformamida durante una hora. Luego, remoje la resina en 15 mililitros de 20%piperidina en DMF durante cinco minutos mientras agita a 80 RPM para des-proteger la amina. Escurrir la resina y repetir la desprotección durante 20 minutos.Lavar la resina con DMF y alcohol isopropílico después. Una vez confirmada la desprotección, añadir la L-tirosina protegida por Fmoc TBTU y DIPEA y agitar la mezcla durante 16 a 24 horas para realizar el acoplamiento. Lave la resina con DMF y alcohol isopropílico.Realice la prueba de Kaiser y continúe con la desprotección y lave como se describió anteriormente. Pareja y desprotege la lisina protegida Fmoc de la misma manera. Lave la resina con DMF, IPA, metanol, diclorometano y éter dietílico después.Deje a un lado un gramo de resina con rodamientos KYF para modificar FITC. Remoje la resina restante en 95%ácido trifluoroacético. 2.5%triisopropylsilane y 2.5% agua durante tres horas para cortar el tripéptido de la resina.Precipitar el péptido crudo con éter dietílico enfriado a 20 grados Celsius. Lavar el precipitado tres veces por centrifugación en porciones de 30 a 40 mililitros de éter dietílico frío y secarlo al vacío. A continuación, mezclar el gramo restante de resina KYF con 120,1 miligramos de ácido 6-acetohexanoico en 30 mililitros de DMF con TBTU y DIPEA.Agitar la mezcla durante 16 a 24 horas a temperatura ambiente para obtener el tripéptido modificado de axida. A continuación, combinar 253 miligramos de esta resina con 3,78 miligramos de cobre sólido (I)yoduro 71,9 miligramos de propargyl florisean y 2,24 miligramos de DIPEA. Deje que la mezcla reaccione mientras agita durante 24 horas.A continuación, lave a fondo la resina de cojinete KYF modificada de FITC. Corte el KYF modificado FITC de la resina y purifique de la misma manera que el tripéptido no modificado. Para comenzar a preparar la nanoemoulsión, disolver 10 miligramos del ácido oleico platino II conjugado en 1,5 mililitros de IPA.Dibuje esta solución en una jeringa de 5 mililitros, coloque una aguja de calibre 20 y monte la jeringa en una bomba de jeringa sobre el área de reacción. Ajuste la bomba de la jeringa a 0,1 mililitros por minuto. Para una nanoemulsión con KYF modificado por FITC, disuelva un miligramo de KYF modificado por FITC y un miligramo de KYF sin modificar en 20 mililitros de agua.Para una nanoemulsión con KYF no modificado, disolver en su lugar dos miligramos de KYF en 20 mililitros de agua. Caliente la solución KYF modificada o sin modificar de FITC a 37 grados centígrados. Asegúrese de que la solución KYF esté agitando a unas 400 RPM y de que la jeringa esté alineada con la solución.A continuación, inicie la bomba de la jeringa para comenzar a añadir el ácido oleico platino dos gotas conjugadas sabias. Una vez añadido el conjugado, reduzca la velocidad de agitación a 150 RPM y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Continúe revolviéndolo durante 16 a 24 horas.A continuación, concentre el nanoemultiión en una unidad de filtro centrífugo de 10.000 Daltons. Lave la nanoemulsión en una unidad de filtro centrífuga tres veces con cuatro porciones de mililitro de agua ultrapura. Y luego almacenarlo como una solución acuosa a cuatro grados Centígrados.El producto final es opalescente para nanopartículas KYF y fluorescentes para nanopartículas modificadas por FITC. Las gotas en una nanoemulsión preparada con KYF no modificado eran esféricas, bien dispersas y de tamaño relativamente uniforme. Basados en imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los núcleos tenían unos 107 nanómetros de diámetro.La nanoemulsión modificada por FITC, que aparece aquí en verde, podría entrar en células de varias líneas celulares de cáncer de ovario. Mientras que el diámetro hidrodinámico de ambas formulaciones aumentó durante cuatro meses de almacenamiento en agua, las dimensiones totales se conservaron. Además, no se observó ninguna opsonización de la emulsión después de un día de incubación en un 20% de suero bovino fetal.La liberación de platino de la emulsión fue más lenta a pH 7,4 con sólo el 20,8% del platino liberado después de cuatro horas. La liberación de platino se aceleró a medida que el pH disminuía. La nanoemulsión recubierta de KYF con platino redujo la viabilidad de estas líneas celulares de cáncer de ovario en un grado mucho mayor de lo que se logró con la carboplatina, el análogo clínicamente relevante.La nanoemulsión también mostró una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el cisplatino en cinco de las seis líneas celulares. La nanoemulsión recubierta con KYF indujo consistentemente una reducción comparable o mayor en la viabilidad que el ácido oleico platino II conjugado solo. Este es un método simple y eficiente para encapsular terapias hidrofóbicas dentro del andamio de nanopartículas de base de tripéptidos.Los péptidos cortos son biodegradables y tienen baja toxicidad, lo que es significativo para la medicina y la biotecnología. Realice este procedimiento bajo la campana de humos para evitar la exposición a disolventes orgánicos. El ácido oleico platino y las nanoemulsiones de platino KYF tienen propiedades contra el cáncer y, por lo tanto, deben manejarse con especial cuidado.Este método es simple en términos de baja actividad de filabilator y equipos, sin embargo se basa en la correcta aplicación de la estrategia de síntesis, y los conceptos químicos subyacentes. Nuestro método se puede extender para entregar otras moléculas de fármacos pequeños. El núcleo de nanopartículas consiste en ácido oleico y por lo tanto es adecuado para la encapsulación de agentes hidrófobos.

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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