Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas
2 de febrero de 2019
El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.
La movilidad de las células cancerosas es crucial para el inicio de la metástasis. Por lo tanto, la investigación del movimiento celular y la capacidad invasiva de las células tumorales es de gran interés. Este método integrado para investigar la migración e invasión de células cancerosas, en una sola plataforma en tiempo real, proporciona una opción fácilmente reproducible y eficiente en el tiempo para estudiar la movilidad celular y la patología.
Este método puede proporcionar información sobre la invasión de células cancerosas, a través de la matriz extracelular, y se puede aplicar a otros tipos de células. Para lograr un tiempo óptimo de rayado, asegúrese de que la densidad de siembra se ha optimizado y no prolonga el período de incubación una vez que la monocapa celular ha alcanzado el 100 por ciento de confluencia. Para determinar el número óptimo de celdas sembradas para un ensayo de migración, coloque las células en un rango de densidades en triplicado en una placa de 96 paredes.
Coloque la placa en el imager de celda en vivo y seleccione los escaneos de programación de la lista de tareas en el software imager. En el panel de configuración del cajón, determine las posiciones de la placa y haga clic en Agregar recipiente para seleccionar el tipo de placa. En el panel de configuración del análisis, seleccione o edite el patrón de escaneado de acuerdo con la configuración de la placa experimental y establezca el tipo de escaneado como estándar.
Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione establecer intervalos. A continuación, establezca agregar exploraciones cada dos horas durante 24 horas y haga clic en Aplicar. Después de 24 horas, abra la configuración del cajón para permitir que se seleccione la placa experimental y haga clic en Quitar recipiente.
Seleccione de tres a seis imágenes representativas y colóquelas en una nueva colección de imágenes. Para determinar una definición de procesamiento adecuada, utilice el ajuste de segmentación, la limpieza y los filtros para aplicar una máscara de confluencia adecuada y utilice la vista previa actual all'para ver la precisión de las máscaras. Inicie el trabajo de análisis y determine una densidad celular optimizada, de acuerdo con una confluencia aproximada del 100 por ciento contra el tiempo, dentro de seis a dieciocho horas, dependiendo de cuándo comience el ensayo de migración.
A continuación, aplique la herramienta de análisis de procesamiento de confluencia a las imágenes de contraste de fase de alta definición recopiladas automáticamente para generar una curva de proliferación celular frente al tiempo. Antes de comenzar el ensayo, cubra la placa para el ensayo de invasión con 50 microlitros de gel de matriz extracelular, diluido en medio de cultivo celular helado, a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Luego, coloque el plato en una incubadora de cultivo celular durante la noche.
A la tarde siguiente, aspirar suavemente el exceso de medio, y placar las células en la densidad optimizada, en triplicado, en los pozos apropiados de la placa recubierta de matriz extracelular, y en una placa adicional sin recubrimiento de 96 pozos. A continuación, coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante la noche. A la mañana siguiente, coloque la placa de ensayo de migración sin recubrimiento en el soporte de la placa base de la herramienta de arañazos, y utilice los tacos guía para colocar cuidadosamente la parte superior del soporte en la base.
Mantenga pulsada la palanca negra mientras levanta cuidadosamente el bloque de pasador para hacer los arañazos. Los arañazos en cada pozo deben ser visibles a simple vista, así como bajo el microscopio. Luego, lave la placa una o dos veces con un medio de cultivo precalecido para eliminar las células o láminas de celda separadas.
Para el ensayo de invasión, rasque la placa recubierta como se acaba de demostrar. Después de retirar las células y láminas desprendidas, utilice una caja fría pre-refrigerada para equilibrar la placa a cuatro grados Celsius durante cinco minutos antes de aspirar cuidadosamente el medio frío. A continuación, agregue 50 microlitros de gel de matriz extracelular diluido en los pozos apropiados y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante treinta minutos.
Las burbujas son comunes cuando se trabaja con gel de matriz extracelular, pero se pueden eliminar aspirando un 70 por ciento de etanol. A continuación, agregue 100 microlitros de medio fresco y cálido, con o sin el compuesto de prueba, a los pozos apropiados de la placa de ensayo de migración o invasión, y coloque la placa en la plataforma de imágenes de células vivas. Para limpiar la herramienta de arañazos, coloque el bloque de pasador superior en recipientes individuales de lavado de 45 mililitros, que contienen un 5 por ciento de detergente uno, un porcentaje de detergente dos, agua destilada estéril o 70 por ciento de etanol durante cinco minutos por lavado antes de volver a colocar la herramienta de arañazos en su placa base, para su almacenamiento en un entorno libre de polvo.
Para obtener imágenes de los ensayos de la herida, después de permitir que la placa se equilibre durante cinco minutos, seleccione el tipo de recipiente como el plano de registro de la imagen y establezca el tipo de escaneo como herida de arañazo. Seleccione o edite el patrón de escaneo, de acuerdo con la configuración de la placa experimental, y programe 24 horas de exploración repetida cada una o dos horas durante 72 horas, o hasta que las heridas se curen como se ha demostrado. Cuando todas las heridas se hayan curado, detenga la exploración y seleccione de tres a seis imágenes representativas, que abarcan una serie de porcentajes de sonido, incluidas las imágenes justo después de que se haya hecho la herida, y el cierre de la herida en un 10 y un 50 por ciento.
Para determinar una definición de procesamiento adecuada, aplique una máscara de herida de arañazo adecuada y una máscara de confluencia como se ha demostrado, y utilice la vista previa actual all' para ver la precisión de las máscaras. A continuación, inicie el trabajo de análisis. En un ensayo de migración, el ancho de la herida es la distancia media entre las hojas de celda junto a la herida.
La confluencia de la herida es la confluencia dentro de la zona herida. La confluencia inicial ideal de la herida debe estar cerca del cero por ciento. La densidad relativa de la herida y la confluencia de la herida sugieren la velocidad de las células que ocupan el área de la herida de arañazo.
Estos datos casi se superponen en ambas líneas celulares representativas. Diferentes líneas celulares demuestran habilidades de cicatrización de heridas muy diferentes, lo que indica capacidades migratorias diferenciales entre las líneas celulares. Por ejemplo, la lamellipodia se observan en esta línea celular de adenocarcinoma mamario en el frente de migración al comienzo de la migración, mientras que esta línea celular de cáncer de mama productora de mucina 1 no mostró signos de migración celular al mismo tiempo.
Además, la densidad relativa de la herida de la línea del adenocarcinoma mamario se saturaba después de 50 horas, mientras que la densidad relativa de la herida de la línea celular de cáncer de mama productora de mucina 1 no cambió con el tiempo, subrayando el fenotipo altamente invasivo de las células del adenocarcinoma y la no invasividad de las células cancerosas mamarias productoras de mucina 1. Las células del adenocarcinoma también se comportaron de manera diferente mientras invadieron a través del gel de matriz extracelular, demostrando una morfología alargada con protuberancias líderes, y en ensayos de migración, se visualizó un bleb en el frente migratorio. Al enchapar, recuerde que si se siembran muy pocas células, el rasguño no se formará correctamente, y si se siembran demasiadas células, habrá hacinamiento.
Después de este procedimiento, se pueden agregar tratamientos de seguimiento, lo que permite adaptar este método para el cribado de pistas de alto rendimiento. Este método permite a los investigadores realizar estos ensayos en una sola plataforma, que es de alto rendimiento, y permite a los investigadores monitorear sus células en tiempo real, en lugar de en el punto final experimental. Los desinfectantes utilizados para esterilizar la herramienta de arañazos pueden ser peligrosos.
Asegúrese de recopilar y desechar las soluciones de acuerdo con el MSDS relevante y las líneas de activación regulares de su instalación.
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Descripción general
Este protocolo describe un método integrado para investigar en tiempo real la migración e invasión de células cancerosas. Ofrece un enfoque reproducible y eficiente para estudiar la movilidad celular y la morfología.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Investigación del cáncer
- Migración celular
Antecedentes
- La movilidad de las células cancerosas es esencial para la metástasis.
- Comprender el movimiento de las células tumorales es fundamental para desarrollar terapias.
- Este método puede aplicarse a diversos tipos de células.
- Se obtienen conocimientos sobre la invasión de las células cancerosas a través de la matriz extracelular.
Objetivo del estudio
- Para investigar la migración e invasión de células cancerosas.
- Para proporcionar un método eficiente en tiempo para estudiar la movilidad celular.
- Para optimizar las condiciones para ensayos de migración.
Métodos Utilizados
- Método integrado para la observación en tiempo real.
- Optimización de la densidad de siembra para ensayos de raya.
- Uso de una placa de 96 pocillos para ensayos de densidad celular.
- Monitoreo de la confluencia celular para determinar los tiempos óptimos de incubación.
Resultados principales
- Datos en tiempo real sobre la migración e invasión de células cancerosas.
- Establecimiento de condiciones óptimas para los ensayos.
- Información sobre el comportamiento de las células tumorales en un entorno controlado.
- Aplicaciones potenciales a otros tipos celulares además de las células cancerosas.
Conclusiones
- El método es reproducible y eficiente para estudiar la movilidad celular.
- Proporciona información valiosa sobre el comportamiento de las células cancerosas.
- Aplicaciones adicionales podrían mejorar la comprensión de diversos tipos celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos cuantitativos de migración e invasión son fundamentales para reducir los riesgos asociados con dianas en oncología y evaluar el potencial metastásico en modelos preclínicos. Las plataformas automatizadas de imagen en tiempo real permiten evaluar de forma reproducible y de alto rendimiento la motilidad celular, lo que fortalece la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento y la investigación traslacional. La integración del análisis en tiempo real agiliza la toma de decisiones en puntos críticos de los portafolios en oncología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de dianas relacionadas con metástasis mediante la cuantificación del movimiento celular y la invasión.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir fenotipos invasivos de los no invasivos en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Facilita la selección de carteras al proporcionar datos comparativos entre líneas celulares y condiciones de tratamiento.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara ensayos validados y reproducibles de migración e invasión para cribado posterior de compuestos.
- Normaliza las condiciones del ensayo y las salidas cuantitativas mediante módulos automatizados de imagen y análisis.
- Posibilita la preparación para cribado de alto rendimiento y la escalabilidad de la plataforma para diversos programas de oncología.
Investigación Translacional y Preclínica
- Correlaciona datos de invasión in vitro con procesos metastásicos relevantes para la enfermedad, garantizando continuidad traslacional.
- Facilita el avance ajustado al riesgo mediante la correlación del comportamiento celular con puntos finales de eficacia preclínica.
- Proporciona información mecanicista sobre los efectos del compuesto en la motilidad celular y la invasión a través de la matriz extracelular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos activos y la validación preclínica al proporcionar datos cuantitativos y estandarizados sobre migración e invasión. Los módulos automatizados de imagen y análisis garantizan la reproducibilidad y comparabilidad entre estudios.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la motilidad y la invasión celular para probar hipótesis metastásicas y aclarar la función de dianas.
- Selección: Proporciona lecturas reproducibles y de alto contenido para la evaluación de compuestos y la optimización de ensayos.
- Análisis: Ofrece métricas cuantitativas en tiempo real, como el ancho de la herida, la confluencia y la densidad relativa de la herida.
- Investigación Traducional: Relaciona los fenotipos de invasión in vitro con el potencial metastásico in vivo cuando se apoya mediante la selección del modelo.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo flexible y en una sola plataforma, adaptable a múltiples tipos celulares y diseños experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de metástasis.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y el rendimiento mediante imágenes y análisis automatizados.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir comparaciones cuantitativas robustas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos en oncología basados en datos funcionales de invasión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular, preparación de ensayos e instrumentación para imágenes de células vivas.
- Necesita acceso a plataformas de imagen automatizadas y módulos de software de análisis compatibles.
- Exige estandarización entre equipos en cuanto a densidad de siembra, tiempos de incubación y parámetros de análisis de imágenes.
- Adaptable a diversas líneas celulares y composiciones de matriz mediante la optimización del protocolo.
- Es necesario manipular y desechar cuidadosamente desinfectantes y reactivos según las normas de seguridad del laboratorio.
