Name: La aplicación Advanced In Vitro cultivo tecnología para estudiar la Microbiota del intestino humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprenda a cultivar la microbiota intestinal in vitro usando biorreactores que replican condiciones gastrointestinales. Este método permite estudiar la dinámica microbiana en un entorno controlado.

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La Sra. Audrey Thomas-Gahring es reconocida por sus GC/MS trabajo. También nos gustaría agradecer a Massimo Marzorati por editar el manuscrito.

<ol><li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin%2C+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li>
<li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honor+thy+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li>
<li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+normal+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li>
<li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+intestinal+fermentation%3A+association+between+food+components%2C+delivery+systems%2C+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinoxylans%2C+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).</li>
<li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms%3A+a+novel+concept%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li>
<li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).</li>
<li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microbial+community+reproducibility%2C+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li>
<li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li>
<li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li>
<li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety%2C+Depression%2C+and+the+Microbiome%3A+A+Role+for+Gut+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li>
<li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li>
<li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li>
<li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+Versus+Phylogeny%3A+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4(2018).</li>
<li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li>
<li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li>
<li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58(2015).</li>
<li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li>
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Los autores tienen intereses financieros que compiten. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.

Sistemas de cultivo in vitro se han desarrollado para estudiar la microbiota de la tripa del intestino grueso. Utilizan aparatos diseñados para simular las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, promoviendo el crecimiento de una comunidad microbiana intestinal madura para cada región del colon33. Aunque el concepto es lógico y comprensible, el funcionamiento real de sistemas de cultivo in vitro para el estudio de la microbiota intestinal requiere una precisión y una comprensión de ...

La microbiota intestinal es una comunidad de microorganismos que residen en el tracto gastrointestinal humano (GIT).  Esta comunidad alcanza la máxima concentración en el colon, que se estima para sostener 1013-1014 bacterias, de 500-1.000 especies, que viven en simbiosis con el entorno de colon1,2. La composición y funciones de la microbiota intestinal variar espacialmente a lo largo del GIT, formando comunidades específicas de la región, con la mayoría diversidad distal2,3,4,5. Para cada región anatómica, separado de las comunidades microbianas residen en el lumen y en la guarnición mucosa de6. La comunidad de lumen tiene acceso más directo a los nutrientes como sustratos atravesar el compartimiento luminal7. A pesar de esto, algunas bacterias residen preferentemente en la capa de moco, utilizando la mucina producida por las células del colon como una fuente de energía1,5,8. La diferencia en microambientes entre las fases luminales y de la mucosas resulta en divergencia y el desarrollo de comunidades específicas de fase. En conjunto, estas comunidades proporcionan funciones metabólicas, como el metabolismo de nutrientes y la producción de vitaminas y las funciones inmunológicas, como prevención de la colonización de patógenos humanos1,3, 9. la microbiota intestinal también trabaja funcionalmente en conjugación con el colon humano las células3.
Como parte importante de la GIT humana, no es sorprendente que la microbiota intestinal se conoce para contribuir a ambos host salud y enfermedad estado3,9,10,11,12. Un cambio en la población microbiana del intestino se ha asociado con varias enfermedades humanas, incluyendo trastornos del GIT como enfermedad intestinal intestinal (EII) y el síndrome intestinal del intestino (IBS), sino también otras enfermedades como la obesidad, enfermedades circulatorias y autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabolitos producidos a partir de la microbiota intestinal tienen un efecto global, llegando a lugares lejos de la tripa12,13. Por ejemplo, el eje cerebro intestinal se asocia con trastornos mentales como ansiedad y depresión14. Por lo tanto, estudiar la microbiota intestinal es importante para múltiples campos de investigación y es aplicable a muchas enfermedades, incluso los no asociados con el GIT.
Si bien es ampliamente reconocido que el estudio de la microbiota intestinal es importante, es una tarea complicada. Múltiples modelos animales están disponibles, de pequeños animales como el pez cebra, las ratas y ratones, a los más grandes como monos y cerdos15-19. Sin embargo, la aplicación de estos animales en cuanto a la microbiota del intestino humano no es sencilla, ya que estos animales tienen una única comunidad bacteriana que ha evolucionado basada en dieta y medio ambiente, y son anatómicamente distintas de los seres humanos20 , 21. el uso de sujetos humanos elimina la cuestión de la relevancia, pero presenta otro conjunto de desafíos. Estudios en humanos son costosos, lentos y son éticamente obligado11. Por otra parte, factores de confusión influyen en la microbiota intestinal en estudios en humanos, incluyendo edad o etapa de desarrollo, medio ambiente, dieta, medicamentos y factores genéticos2,4,22.  También hay restricciones en lo que puede ser probado en seres humanos, y que tipo de muestras puede ser cosechado en lo tiempos4.
Una desventaja crítica del uso de un sistema en vivo para el estudio de la microbiota intestinal es la presencia de mamíferos. La microbiota intestinal y las células humanas interactúan uno con el otro, y en una en vivo , es imposible distinguir los dos. Los metabolitos producidos por la microbiota intestinal se toman en por las células del colon, por lo que las mediciones no pueden calcularse con precisión. Por lo tanto, cualquier estudio mecanístico debe limitarse a punto final medidas11. Otra desventaja importante para estudios in vivo es la incapacidad para recoger muestras de las distintas regiones de la GIT longitudinalmente23. Esto no permite la evaluación de los cambios que pueden ocurrir en los microambientes del colon en tiempo12.  Muchos en vivo los estudios, incluyendo estudios en seres humanos, se basan en el análisis de muestras de heces para detectar cambios en la microbiota intestinal del12. Mientras que esto es informativo, no proporciona datos sobre la microbiota intestinal a través del GIT y no distingue entre las comunidades luminal y de la mucosa5,6,7,8.
De la microbiota intestinal, es necesaria la aplicación de un método en vitro para estudiar la dinámica de la comunidad bacteriana, sin la interferencia de los componentes de mamíferos. Utilizando un método en vitro permite el estricto control de condiciones ambientales10pruebas de múltiples parámetros simultáneamente y la capacidad de la muestra longitudinal y, en grandes volúmenes11. Desde un método in vitro utiliza un dispositivo mecánico y no un host, consideraciones no son necesarios para la edad, medio ambiente, dieta y genética. Estos sistemas pueden utilizarse para probar ya sea la comunidad de microbiota intestinal entera, selecciona solamente los organismos, o incluso solos cepas. Lo importante, los resultados in vitro son reproducibles, pero mantener un nivel de diversidad comparable a estudios in vivo11,22.
Dependiendo de la hipótesis en cuestión y los resultados deseados, in vitro estudios pueden realizarse de muchas maneras.  Pueden utilizar sistemas del solo-recipiente y métodos simples, como incubar las muestras con homogeneizado fecal24 o realizar culturas único lote en el transcurso de 24-48 h25. También puede lograr usando sistemas del solo-recipiente y métodos más complejos, como el uso de un sistema de chemostat para producir una comunidad microbiana intestinal estable del11. Sin embargo, el uso de un solo reactor puede simplificar la microbiota12 ya que sólo representa una sección del colon, a pesar de que el colon se compone de las regiones ascendentes, transversales y descendentes.
Para estudiar la comunidad de microbiota intestinal que se desarrolla en las diferentes regiones del colon (ascendentes, transversales y descendentes regiones), se puede emplear un sistema complejo, de múltiples etapas. En estos sistemas, se instalan varios buques para imitar las diferentes regiones del colon, por lo que la microbiota intestinal de las regiones ascendentes, transversales y descendentes se cultivan independientemente. Estos vasos están conectados, usando bombas para mover sustratos en secuencia, desde la ascensión a la transversal a las regiones de colon descendente, imitando el flujo de nutrientes a través del GIT.
El objetivo de este estudio era demostrar cómo un sistema de cultivo in vitro de 5 etapas (véase Tabla de materiales) se puede utilizar para el cultivo de la comunidad de microbiota intestinal y para demostrar la dinámica de la comunidad en términos de estabilidad y composición. En este sistema, un recipiente representa el estómago y uno representan el intestino. El colon se divide en tres regiones (ascendente, transverso, descendente), con un vaso que representa cada región26. En esta configuración experimental, dos sistemas completos se ejecutan en paralelo, con la unidad 1 que contiene portadores de mucina que representa la superficie de la mucosa y la unidad 2 que contiene no portadores de mucina. Las comunidades que se desarrolló en las fases luminales y de la mucosas de cada región se compararon entre sí y del inóculo fecal con el tiempo mediante el SCFA análisis y secuenciación de 16S rRNA gene. Los resultados presentados demuestran el tipo de comunidad, tanto en términos de composición y funcionalidad, que puede ser producido a partir de este tipo de sistema in vitro.

<table><tbody><tr><td>TWINSHIME</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Medio definido (Medio de crecimiento M-SHIME adulto con almidón)</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex tubing</td><td>cole Parmer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de drenaje de orina</td><td>Bard</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Labsorb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Muestra fecal</td><td>Openbiome</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Medio definido</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oxgall Bile</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pancreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cristalería</td><td>Ace Glass</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mucina porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de esterilización</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triple-Pure High Impact Zirconio de 0,1 mm Tubo batidor de perlas</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td>Libre de</tr><tr><td>ARNasa, libre de ADNasa, agua estéril</td><td>Roche</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>Columna NA</td></tr><tr><td>Stabilwax-DA, 30 m, 0,25 mm DI, 0,25 y micro; m</td><td>Restek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>portadores de mucina de plástico</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

la aplicación advanced in vitro cultivo tecnología para estudiar la microbiota del intestino humano

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

La microbiota del intestino humano juega un papel vital en la salud humana y enfermedad. Estudio de la microbiota intestinal usando un modelo en vivo , es difícil debido a su compleja naturaleza y su diversa asociación con componentes de mamíferos. El objetivo de este protocolo es la microbiota intestinal in vitro, que permite el estudio de la dinámica de la microbiota del intestino, sin tener que considerar la contribución del medio mamífero de la cultura. Usando en vitro tecnología de cultivo, se simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal, incluyendo parámetros tales como pH, temperatura, anaerobiosis y tiempo de tránsito. La superficie intestinal del colon se simula agregando portadores recubiertos de mucina, creando una fase mucosa y agregar otra dimensión. La microbiota intestinal se introduce al inocular con el material fecal humano. A la inoculación con esta mezcla compleja de bacterias, microbios específicos se enriquecen en las diferentes longitudinal (ascendentes, dos puntos transversales y descendentes) y transversal (luminal y mucosa) del modelo in vitro. Es crucial para permitir que el sistema alcance un estado estacionario, en el que la comunidad y los metabolitos producidos permanecen estables. Los resultados experimentales en este manuscrito demuestran cómo la comunidad de microbiota intestinal inoculados se desarrolla en una comunidad estable en el tiempo. Una vez que se alcanza el estado estacionario, el sistema puede utilizarse para analizar las interacciones bacterianas y las funciones de la comunidad o para probar los efectos de los aditivos en la microbiota intestinal, tales como alimentos, componentes de alimentos o productos farmacéuticos.

El protocolo de arriba describe configuración, inoculación y funcionamiento de un sistema in vitro de 5 etapas para el estudio de la microbiota intestinal del colon. Para generar los datos presentados a continuación, después de la extracción de DNA, secuenciación de ADN 16S rRNA marcador gene de la región de V1V2 se realizó mediante el alto rendimiento de secuenciación (por ejemplo,, MiSeq Illumina plataforma) por el centro del microbioma en el Hospital de niños de Philadelphia<s...

Aquí, presentamos un protocolo para el cultivo de la microbiota intestinal de la Colón in vitro, utilizando una serie de biorreactores que simulan las condiciones fisiológicas del tracto gastro intestinal.

La aplicación Advanced In Vitro cultivo tecnología para estudiar la Microbiota del intestino humano

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

El objetivo de este protocolo es cultivar microbiota intestinal in vitro. Permitirá el estudio de la dinámica de la microbiota sin tener que considerar la contribución de un componente moderno. Utilizando este sistema in vitro de varias etapas, contamos la comunidad de microbiotas para desarrollarse en la lumina y en la mucosa de múltiples regiones del colon se puede iniciar simultáneamente.Una demostración visual de este método es útil debido a la complejidad de este sistema in vitro. Comience llenando el colon ascendente con 500 mililitros de medio definido, el colon transversal con 800 mililitros de medio definido, y el colon descendente con 600 mililitros de medio definido. Añadir a los agriportriers de mucina a las regiones del colon en una cantidad proporcional al volumen del reactor, y utilizar el tubo de muestra y la jeringa para eliminar cualquier medio definido en exceso de cada reactor.Utilice las sondas de pH para ajustar el pH en cada reactor. Y encienda el nitrógeno en un lavado de 20 minutos. A continuación, descongele el homogeneato fecal de acuerdo con las directrices del fabricante antes de cargar una jeringa de 60 mililitros con la muestra de homogeneato fecal.A continuación, inocular cada reactor de colon a través del puerto de la muestra con una cantidad de homogeneización igual al 5% de cada volumen del reactor para el cultivo nocturno con control de pH. A la mañana siguiente, limpie la cerradura luer en el puerto de muestra de cada biorreactor con alcohol. Cuando los puertos se hayan secado, conecte la jeringa de 30 mililitros, limpiada de todo el aire, a uno de los puertos de muestra.Retire el émbolo de tres a cinco veces para asegurar una mezcla completa de los componentes del recipiente antes de aspirar 15 mililitros del supernato del cultivo del biorreactor. A continuación, transfiera la muestra luminal a un tubo Falcon estéril y colóquela sobre hielo. Para el análisis de ADN, recoja de uno a tres mililitros de líquido luminal utilizando una jeringa de cinco mililitros.Recoger el supernate de los otros biorreactores de la misma manera. Para reservar material de muestra para el análisis de ácidos grasos de cadena corta, centrífugo 15 mililitros de la muestra luminal de interés, y jeringa filtra el supernate a través de un filtro de poro de 0,2 micrómetros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para reservar material de muestra para el análisis de ADN, centrifugar un mililitro de líquido luminal y almacene el pellet a menos 80 grados Centígrados.Para la recolección de muestras de mucosas, retire los portadores de mucina preparados de un almacenamiento de cuatro grados centígrados y encienda el lavado de nitrógeno. Abra rápidamente la tapa del reactor y reemplace el 50% de los portadores de cada reactor por otros nuevos. Cuando todos los portadores hayan sido reemplazados, vuelva a sellar rápidamente la tapa y mantenga el nitrógeno al ras durante otros 20 minutos.Luego alícuota 0.25 a 0.5 gramos de agar portador de mucina en tubos individuales de dos mililitros para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius hasta la extracción de ADN. Tres veces al día el sistema se aplica automáticamente. Esto comienza con 140 mililitros de medio definido transferidos al biorreactor estomacal seguido de una incubación de una hora con control de pH.Al final de la incubación, el contenido del estómago se transfiere al intestino delgado junto con 60 mililitros de jugo pancreático. En el biorreactor del intestino delgado, el pH se ajusta automáticamente a 6,7 a 6,9, y el contenido se incuba durante 90 minutos. Durante esta incubación, el lavado de nitrógeno para cada sistema se enciende durante un total de 10 minutos.Al final de esta incubación, el contenido del intestino delgado se transfiere al colon ascendente, desde el colon ascendente hasta el colon transversal, desde el colon transversal hasta el colon descendente y desde el colon descendente hasta los desechos. En este análisis representativo de coordenadas principales, la comunidad cambió depreciadamente entre los días uno y siete. Sin embargo, desde el día 11 después de la inoculación hasta el final del experimento, las muestras ocuparon una pequeña región del espacio de análisis de coordenadas principales para ambas muestras de puntuaciones de distancia basadas en la unidad taxonómica operativa, la presencia en ausencia y la abundancia.La medición de tres aminoácidos prominentes de cadena corta revela que el ácido propiónico, el ácido butanoico y el ácido acético fluctúan desde el inicio del experimento hasta el día 15 después de la inoculación. Después del día 15, las cantidades de estos ácidos producidos en cada región del colon se mantuvieron constantes con sólo cambios mínimos hasta el final del experimento. El análisis de la comunidad estable para la fase luminal y mucosa de cada región del colon demuestra que las comunidades que se desarrollan en las regiones de colon individuales del sistema in vitro son similares a la composición del inóculo fecal.La comparación de la diversidad alfa del sistema in vitro revela un nivel de diversidad similar al del inóculo para todas las regiones, excepto las muestras luminales de la región ascendente. Demostrar que el sistema de cultivo in vitro es capaz de producir una comunidad comparable al inóculo fecal tanto en términos de composición como de diversidad. Para producir una comunidad estable de microbiota intestinal utilizando este protocolo, es fundamental asegurarse de que las soluciones se preparan con precisión y que se mantengan las condiciones aneróbicas y los parámetros de pH durante todo el experimento.Después de este procedimiento, las muestras se pueden analizar para la composición de la comunidad utilizando la secuenciación de ADN de próxima generación seguida de análisis bioinformático y para la funcionalidad mediante metabolómica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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