Montaje de lanzaderas moleculares Powered by reversible conectado Kinesins
26 de enero de 2019
Presentamos un protocolo para construir lanzaderas moleculares, donde proteínas motoras quinesina adherido superficie propulsan microtúbulos teñir-etiquetados. Las interacciones débiles de los kinesins con la superficie permite su adhesión reversible a él. Esto crea un sistema de escala nanométrica que exhibe el dinámico montaje y desmontaje de sus componentes sin perder su funcionalidad.
Este protocolo es significativo porque abre la puerta a una mayor investigación en el diseño de sistemas biológicos a nanoescala que están en equilibrio dinámico. Esta técnica llena parte de la brecha entre las estructuras diseñadas y naturales porque permite el estudio de lo que podríamos llamar, la autorreparación'o el reemplazo dinámico de componentes moleculares. El consejo más importante para probar esta técnica por primera vez es asegurarse de que el experimentador está siguiendo todos los protocolos de seguridad.
En primer lugar, prepare las soluciones de stock como se describe en el protocolo de texto. Pipetear 21,8 microlitros de BRB80 Buffer en un pequeño tubo de micro centrífuga. Añadir 1 microlitro de la solución de material de cloruro de magnesio, 1 microlitro de la solución de material GTP y 1,2 microlitros de la solución de stock DMSO para terminar de preparar el tampón de crecimiento de microtúbulos.
Para comenzar la polimerización de microtúbulos, agregue 6,25 microlitros de tampón de crecimiento de microtúbulos directamente en una alícuota de 20 microgramos de tubulina liofilizada;etiquetada para excitarse a 647 nanómetros. Vórtice a 40 RPS durante 5 segundos. Enfríe la alícuota sobre hielo durante 5 minutos.
Luego, incubar a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Para iniciar la estabilización de microtúbulos, añada 5 microlitros de la solución de paclitaxel alícuota a 490 microlitros de tampón BRB80. Vortex la solución a 30 RPS durante 10 segundos.
Una vez que haya terminados los 45 minutos de incubación de los microtúbulos, añadir 5 microlitros de esa solución a la mezcla BRB80, y paclitaxel, para crear la solución MT100. En primer lugar, añada 9,0 microlitros de la solución de caseína alícuota alícuo a 291 microlitros de tampón BRB80. Pipetear 83 microlitros de la solución de caseína BRB80 en un nuevo tubo de micro centrífuga de 6 mililitros.
Añadir 1 microlitro de D-glucosa, glucosa oxidasa, catalasa, TDT, fosfato de creatina y fosfoquinasa. A continuación, agregue 1 microlitrotro de la solución de ATP a la solución de motilidad. Flick, o vórtice la alícuota para distribuir homogéneamente los productos químicos.
A continuación, añadir 1 microlitro de solución de kinesina preparada a la solución de motilidad, de modo que la concentración final sea de 20 nanomolares. Agregue 10 microlitros de la solución MT100 a la solución de motilidad. Para las celdas de flujo, utilice un cubreobjetos grande y un cubreobjetos pequeño.
Enjuague todos los cubreobjetos dos veces con etanol y dos veces con agua ultrapura. Sonicar los cubreobjetos lavados en agua ultrapura durante 5 minutos. A continuación, seque los cubreobjetos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados.
Utilice un limpiador de ozono UV para tratar un lado de cada cubreplo durante 15 minutos a temperatura ambiente y en condiciones atmosféricas normales. Usando pinzas, voltee cada cubreobjetos y use el ozono UV para tratar el lado no tratado también. Sonicar los cubreobjetos tratados en agua ultrapura durante 5 minutos.
Luego, séquelos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados. A continuación, no haga equipo de protección como se describe en el protocolo de texto. Sumerja cada cubreobjetos en solución salina durante 15 segundos.
Lave los cubreobjetos dos veces en tolueno y tres veces en metanol. Utilice nitrógeno presurizado para secar los cubreobjetos. Una vez que los cubreobjetos estén secos, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara de 2 centímetros por 2,5 centímetros.
Corte esta pieza por la mitad verticalmente en dos tiras de 1 centímetro por 2,5 centímetros. Coloque el cubreobjetos grande en un delicado limpiaparabrisas y pegue las tiras de cinta en él, a lo largo de los bordes para crear un área de 1 centímetro por 2,5 centímetros entre las piezas de cinta. Pegue el cubreobjetos pequeño en la parte superior de las tiras de cinta para terminar el conjunto de celdas de flujo.
En primer lugar, fluya aproximadamente 20 microlitros de la solución PEG-PPG-PEG en la celda de flujo ensamblada. Deje que la solución absorba en la superficie durante 5 minutos, luego, intercambie esta solución con 20 microlitros de tampón BRB80 tres veces fluyendo el búfer. Flujo 20 microlitros de la solución de motilidad en la celda de flujo.
Después de esto, selle los bordes de la celda de flujo con grasa para evitar la evaporación si el experimento planificado es más de una hora. Realice la toma de imágenes utilizando una microscopía de florescencia interna total de tipo objetivo. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo.
A continuación, coloque la celda de flujo en la plataforma del microscopio. Y subir el objetivo hasta que haya contacto entre el aceite en el objetivo y la celda de flujo. Utilice el sistema de cubierta de enclavamiento del microscopio para bloquear el escape de toda la luz láser.
A continuación, encienda el láser y concéntrese en la superficie inferior de la celda de flujo utilizando un láser de 642 nanómetros para crear imágenes de los microtúbulos, y un láser de 488 nanómetros para crear imágenes de los motores de kinesina GFP. Graba las imágenes o vídeos de interés. Las imágenes se pueden grabar mientras haya motilidad en la celda de flujo.
En este estudio, se presenta un sistema activo de nanoescala, que se automonta bloques de construcción débilmente vinculantes para construir su propia vía. Mediante la microscopía de timón, los microtúbulos deslizantes se visualizan por separado de los motores de kinesina. Los microtúbulos son visibles al excitar con un láser de 647 nanómetros.
Y la kinesina GFP son visibles cuando se excita con un láser de 488 nanómetros. El tiempo entre la excitación y la luz roja y verde fue de menos de un segundo. Como se puede ver, los microtúbulos deslizantes acumulan motores de kinesina a partir de la solución y los depositan en la superficie.
Los motores de kinesina permanecen a raíz de los microtúbulos durante un corto período de tiempo antes de volver a la solución. Es muy importante tener la concentración correcta de reactivos en el antifado de la solución de motilidad, de lo contrario, el blanqueo fotográfico haría que el experimento fallara. Esta técnica allana el camino para un uso más eficiente de los motores proteicos en sistemas de ingeniería a nanoescala.
Por lo tanto, permite el diseño y estudio de nanoestructuras más complejas.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo para la construcción de transbordadores moleculares utilizando proteínas motoras de quinesina para propulsar microtúbulos marcados con colorante. El sistema permite el ensamblaje y desensamblaje dinámicos manteniendo la funcionalidad.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- biofísica
- nanotecnología
- biología celular
Antecedentes
- Los transportadores moleculares son esenciales para comprender los sistemas biológicos a escala nanométrica.
- Los motores de quitina facilitan el movimiento de los microtúbulos en los procesos celulares.
- El equilibrio dinámico en sistemas a escala nanométrica puede dar lugar a propiedades de autorreparación.
- Los protocolos de seguridad son cruciales para realizar experimentos que involucren estos componentes.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para estudiar sistemas a escala nanométrica en equilibrio dinámico.
- Reducir la brecha entre estructuras biológicas naturales e ingenierizadas.
- Explorar la autoensamblaje y la motilidad de microtúbulos impulsados por motores de quinesina.
Métodos Utilizados
- Preparación de tampón para el crecimiento de microtúbulos y soluciones de estabilización.
- Ensamblaje de celdas de flujo utilizando cubreobjetos tratados.
- Adquisición de imágenes mediante microscopía de fluorescencia por reflexión interna total.
- Grabación de la motilidad de microtúbulos y motores de quinesina.
Resultados principales
- Se logró imaginar los microtúbulos y se observó que acumulaban motores de quinesina.
- El sistema demostró ensamblaje y desensamblaje dinámicos de los componentes.
- Las concentraciones correctas de los reactivos fueron fundamentales para prevenir el blanqueo fotográfico.
- La técnica permite el diseño de nanoestructuras más complejas.
Conclusiones
- Este protocolo facilita el estudio de sistemas a nanoescala con propiedades dinámicas.
- Mejora la comprensión de las interacciones moleculares en sistemas diseñados.
- Los hallazgos allanan el camino para futuras investigaciones en nanotecnología y biofísica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el estudio de sistemas dinámicos a escala nanométrica en los que componentes moleculares se autoensamblan y desensamblan en equilibrio, ofreciendo un modelo para la reducción de riesgos mecanicistas en la validación temprana de dianas. Al imitar el transporte biológico mediante proteínas motoras unidas reversiblemente, este sistema brinda confianza predictiva en ensayos de cribado que requieren movilidad sostenible y reproducible. El sistema proporciona una plataforma relevante para enfermedades para evaluar los efectos de compuestos sobre la dinámica del citoesqueleto sin inmovilización permanente.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de la función de las proteínas motoras y de la dinámica de interacción con los microtúbulos en condiciones cercanas a las fisiológicas.
- Valor operativo: Posibilita el ensamblaje reversible y renovable de complejos activos para ciclos repetidos de pruebas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una medición cuantitativa del deslizamiento de microtúbulos y la reclutación de motores mediante microscopía TIRF.
- Valor operativo: Permite la detección en tiempo real, basada en etiquetas, de proteínas de carga y de motores en el mismo ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela mecanismos de transporte del citoesqueleto relevantes para las vías de enfermedades neurodegenerativas y proliferativas.
- Valor operativo: Permite evaluar los cambios inducidos por compuestos en la motilidad y en la cinética de desprendimiento de los motores moleculares.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que se prioriza la interacción con el blanco y las mediciones funcionales antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis sobre interacciones motor-carga y modulación de vías.
- Selección: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles de la motilidad, esenciales para la validación de resultados positivos.
- Análisis: Permite correlacionar el tiempo de residencia del motor en la superficie con la velocidad del microtúbulo y la longitud del recorrido.
- Investigación Traducional: Se conecta con modelos preclínicos de defectos en el transporte axonal mediante lecturas funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular para probar diversas proteínas motoras o compuestos asociados a microtúbulos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al desacoplar la unión del motor de la fijación permanente a la superficie.
- Valor operativo: Asegura la estabilidad del ensayo mediante el reabastecimiento continuo de motores activos desde la solución.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales dinámicos basados en el equilibrio.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas implicadas en vías de transporte intracelular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la purificación de proteínas, manipulación de microtúbulos y microscopía TIRF.
- Depende del acceso a microscopios de fluorescencia con excitación dual por láser y control ambiental.
- Necesita pasivación superficial estandarizada y ensamblaje de celdas de flujo para minimizar la unión no específica.
- Implica la optimización de las concentraciones de motores y microtúbulos para mantener un equilibrio dinámico.
- Limitado por los riesgos de fotoblanqueo si los reactantes antifotoblanqueo no están formulados con precisión.
