Observación en tiempo real de la reacción de intercambio de filamento de ADN mediada por Rad51
13 de febrero de 2019
Se desarrollaron fluorescencia resonancia energética basada en la transferencia en tiempo real observación sistemas de la DNA del filamento reacción de intercambio mediada por Rad51. Utilizando los protocolos aquí presentados, que son capaces de detectar la formación de intermedios de reacción y su conversión en productos, mientras que analizar también la cinética enzimática de la reacción.
Este método puede ayudar a descifrar los pasos en el intercambio de hilos de ADN y revela las funciones de moléculas de diferentes proteínas implicadas en la combinación durante la reparación. Con esta técnica podemos monitorear el intercambio de hilos de ADN en tiempo real sin ninguna interrupción de la reacción y utilizar el quirófano para determinar la cinética de cada paso de reacción. Con algunos ajustes menores, esta técnica se puede aplicar para estudiar las actividades de proteínas de recombinación purificadas derivadas de otras especies, como mamíferos y plantas.
Demostrando el procedimiento estará Kentaro Ito, un Correos Doc de mi laboratorio. Para comenzar, prepare el búfer de reacción A de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, agregue 36 nanomole 16FA-oligonucleótido al tampón para el ensayo de emparejamiento de ADN.
Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir la proteína RAD-51 a una concentración final de 1,5 micro moles a la mezcla e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Añadir la proteína SWI5-SFR1 a una concentración final de 0,15 micro moles a la mezcla, e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.
Transfiera 1,5 mililitros de la mezcla en una cubeta de cuarzo de 1,0 por 1,0 cm que contenga un agitador magnético. Inserte la cubeta en un espectrofluorómetro y proceda a ajustar el controlador de temperatura y el agitador magnético. Registre el cambio en la emisión de fluorescencia FAM a 525 nanómetros tras la excitación a 493 nanómetros a intervalos de un segundo durante 100 segundos.
Finalmente, con una jeringa, inyecte ADN de doble cadena etiquetado por ROX a una concentración final de 36 nano moles en la cubeta. Registre el cambio en la emisión de fluorescencia en intervalos de un segundo durante 30 minutos. Para comparar los espectros de fluorescencia entre los sustratos y los productos finales, inserte cada cubeta que contenga los 16 FA-oligonucleótidos con o sin RAD-51 en un espectrofluorómetro e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos.
A continuación, registre la emisión de fluorescencia FAM en 500 a 600 nano metros tras la excitación a 493 nanómetros. Para probar el efecto de RAD-51 en los espectros de fluorescencia, añada RAD-51 a una concentración final de 1,5 micropoos. Y incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Por último, registre los espectros de fluorescencia de 500 a 600 nanómetros tras la excitación a 493 nanómetros. La máxima eficiencia FRET se obtiene midiendo la reducción máxima de la intensidad de fluorescencia cuando todo el sustrato de ADN de una sola cadena se convierte en ADN de doble cadena en el ensayo de emparejamiento. O midiendo el aumento máximo en la intensidad cuando todo el sustrato de ADN de doble cadena se convierte en ADN de una sola cadena en el ensayo de desplazamiento.
En ambos ensayos, la adición de proteína RAD-51 no afectó a la emisión de fluorescencia de FAM, ni a su eficiencia de enfriamiento por las rocas. Los efectos de las reacciones espontáneas entre los DNAs del sustrato y el posterior blanqueo fotográfico son pequeños. Como lo demuestran los cambios insignificantes en la emisión de FAM sin RAD-51, en comparación con los cambios sustanciales observados con RAD-51.
La adición del complejo SWI5-SFR1 estimula fuertemente la actividad de emparejamiento de RAD-51. La reacción de emparejamiento se simula utilizando un modelo de tres pasos, que consiste en la formación del primer intermedio de tres hilos, la transición al segundo intermedio, y la liberación del ADN de una sola cadena y la formación del dúplex hetero. Una comparación del modelo de tres pasos con un modelo de dos pasos indica que el modelo de tres pasos es un mejor ajuste para simular el emparejamiento de ADN, sin o con el complejo SWI5-SFR1.
La constante de equilibrio calculada de cada paso de reacción, con o sin SWI5-SFR1, muestra que el complejo SWI5-SFR1 no estimula la formación del primer intermedio de tres hilos, pero estimula fuertemente la transición entre los dos intermedios de tres hilos y la liberación de ADN SS. Es esencial verificar que cada lote de proteína purificada esté libre de contaminación por nucleasas y helicas.
Descripción general
Este artículo presenta un método para la observación en tiempo real de reacciones de intercambio de hebras de ADN mediadas por Rad51 mediante transferencia de resonancia de energía por fluorescencia. La técnica permite la detección de intermediarios de reacción y el análisis de la cinética enzimática sin interrumpir la reacción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Biología molecular
- Genética
Antecedentes
- El intercambio de hebras de ADN es un proceso crucial en la reparación del ADN.
- Rad51 desempeña un papel significativo en la recombinación homóloga.
- Comprender la cinética de esta reacción puede proporcionar información sobre los mecanismos de reparación del ADN.
- Las técnicas de monitoreo en tiempo real mejoran el estudio de estos complejos procesos bioquímicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un sistema para observar el intercambio de hebras de ADN en tiempo real.
- Analizar los roles de diferentes proteínas en la reacción.
- Determinar la cinética de cada paso en el proceso de intercambio de hebras de ADN.
Métodos Utilizados
- Preparación del tampón de reacción y los oligonucleótidos para ensayos de apareamiento de ADN.
- Incubación de las proteínas RAD-51 y SWI5-SFR1 con sustratos de ADN.
- Uso de un espectrofluorómetro para monitorear los cambios de fluorescencia.
- Análisis de intermediarios y productos de la reacción mediante mediciones de emisión de fluorescencia.
Resultados Principales
- La adición de SWI5-SFR1 estimula significativamente la actividad de apareamiento de RAD-51.
- Un modelo de tres pasos se ajusta mejor a la simulación del apareamiento de ADN en comparación con un modelo de dos pasos.
- El estudio proporciona datos cuantitativos sobre la cinética del intercambio de cadenas de ADN.
- Las mediciones de fluorescencia indicaron efectos mínimos de reacciones espontáneas.
Conclusiones
- El método desarrollado permite un análisis cinético detallado del intercambio de hebras de ADN.
- SWI5-SFR1 mejora la eficiencia de RAD-51 en el apareamiento de ADN.
- Esta técnica puede adaptarse para estudiar proteínas de recombinación de diversas especies.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La observación en tiempo real del intercambio de hebras de ADN mediado por Rad51 proporciona un marco cuantitativo para evaluar la función de las proteínas de recombinación, apoyando la validación de dianas en las vías de reparación del ADN. El ensayo basado en FRET permite reducir el riesgo cinético de hipótesis mecanicistas al resolver intermediarios transitorios, aportando información para la identificación de compuestos líder en moduladores de la recombinación homóloga. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular la actividad proteica con resultados funcionales de reparación del ADN.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el intercambio de hebras mediado por Rad51 para validar dianas terapéuticas en las vías de reparación del ADN.
- Valor operativo: Resuelve la formación y maduración de intermediarios de ADN de tres hebras, aclarando el mecanismo de acción de proteínas accesorias como Swi5-Sfr1.
- Valor predictivo: Apoya la modelización cinética de tres pasos que mejora la confianza en las predicciones de interacción con la diana y modulación de la vía.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia para medir la cinética de intercambio de cadenas bajo distintas condiciones proteicas.
- Valor operativo: Establece un formato de ensayo homogéneo, basado en solución, compatible con detección espectrofluorométrica para el cribado de compuestos.
- Preparación del ensayo: Permite el monitoreo en tiempo real sin interrumpir la reacción, facilitando análisis de respuesta a dosis y de curso temporal para la validación de compuestos activos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Facilita la comparación entre especies de la actividad de las proteínas de recombinación, apoyando la extrapolación desde sistemas modelo hasta los homólogos humanos.
- Reducción mecanicista de riesgos: Distingue los efectos de las proteínas accesorias en etapas específicas de la reacción, reduciendo la ambigüedad en la alineación de biomarcadores basados en mecanismos.
- Continuidad preclínica: Proporciona un método estandarizado para evaluar la conservación funcional de los reguladores de Rad51 entre especies, orientando la selección de dianas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde el perfilado cinético de las proteínas de reparación del ADN orienta las decisiones de avance o interrupción antes de la inversión preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de cómo Swi5-Sfr1 estimula la maduración del intermediario y la liberación de ADN de cadena sencilla en el intercambio de hebras mediado por Rad51.
- Tamizaje: Proporciona señales de FRET reproducibles y en tiempo real que permiten comparar los efectos de inhibidores o activadores sobre la cinética de la reacción.
- Análisis: Ofrece constantes de velocidad y constantes de equilibrio resueltas por etapa, que permiten la comparación cuantitativa de variantes proteicas o condiciones.
- Investigación Traducional: Permite evaluar la conservación evolutiva mediante la aplicación del ensayo a proteínas de recombinación de mamíferos y plantas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para caracterizar la actividad recombinasa, reduciendo así el desarrollo redundante de ensayos en distintos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al resolver intermediarios transitorios y definir los pasos limitantes de la velocidad.
- Valor operativo: Proporciona datos cinéticos estandarizados y reproducibles mediante el monitoreo en tiempo real de fluorescencia en un formato basado en cubetas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al cuantificar cómo las proteínas accesorias modulan pasos específicos del intercambio de cadenas, reduciendo la incertidumbre mecanicista.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos en la reparación del ADN basándose en perfiles cinéticos cuantitativos y datos de conservación evolutiva.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en purificación de proteínas, espectroscopía de fluorescencia y análisis de datos cinéticos.
- Depende del acceso a un espectrofluorómetro con control de temperatura, agitación magnética y capacidad de inyección con jeringa.
- Necesita una preparación estandarizada de proteínas para excluir contaminantes de nucleasa y helicasa que podrían dificultar la interpretación de la reacción.
- Requiere la optimización del marcaje y concentración de oligonucleótidos para cada especie diana, a fin de garantizar señales FRET detectables.
- Limitado a sistemas in vitro; no captura los efectos del contexto de cromatina o nuclear presentes in vivo.
