Name: Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Aprende a realizar fotobiomodulación transcraneal con láser rojo en ratones para evaluar memoria espacial y niveles de ATP hipocampal. Este protocolo no invasivo mejora funciones cognitivas en modelos de envejecimiento.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de la Tabriz Universidad de ciencias médicas (concesión Nº 61019) a S.S.-E. y una donación de la publicación de LiteCure LLC, Newark, DE, USA a L.D.T. Los autores desean agradecer al Departamento de Inmunología y educación Development Center (EDC) de Tabriz Universidad de ciencias médicas por su amable asistencia.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud (NIH; Publicación no. 85-23, revisada en 1985) y aprobado por el Comité de ética regional de Tabriz Universidad de ciencias médicas.
PRECAUCIÓN: Este protocolo incluye la aplicación de instrumentos de láser de clase 3B y requerirá una formación adecuada y la adherencia a pautas de seguridad. Láseres de clase 3B pueden dañar gravemente los ojos y pueden calentar la piel. Láseres de clase 3B no se consideran un riesgo de quemaduras. Anteojos de protección deben llevarse en todo momento cuando el funcionamiento del aparato de láser.
1. experimentos de transmisión de la luz laser
Nota: Utiliza aquí tres ratones BALB/c machos de 18 meses de edad se obtuvieron de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas. Un láser mW 60 (660 nm) con una viga circular forma de 2,5 mm de diámetro se utiliza como fuente de luz. La fuente láser produce una luz circular polarizada con un perfil gaussiano de intensidad y se opera en modo de onda continua. Un medidor de potencia de fotodiodo comercial con una resolución de nW 10, un área activa de cuadrado 1 cm2 fotodiodo y un rango de respuesta espectral de 400 a 1100 nm se utiliza para medir la potencia de luz transmitida a través de las muestras.
<ol><li>
Preparación de la muestra
	<ol>
<li>Con el fin de obtener muestras frescas, profundamente anestesiar el ratón con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).</li>
		<li>Disecar la cabeza del ratón con tijeras regulares, a partir del punto situado justo encima de los hombros.</li>
		<li>Gire la cabeza para que quede el lado ventral de la mandíbula hacia arriba. Deslice tijeras disección angulada suavemente a través de la cavidad bucal hasta que se nota la resistencia de la Unión de la mandíbula. Cortar todos los músculos grandes que une el hueso de la mandíbula con el cráneo y deshacerse de ellos.</li>
		<li>Quitar los huesos palatinos, con tijeras de disección angulada.</li>
		<li>Deseche toda la carne que rodea el cráneo, usando fórceps curvado.</li>
		<li>Disecar la parte inferior del cráneo y luego tomar cuidadosamente el cerebro fuera queda de hueso del cráneo, con una espátula curvada.</li>
		<li>Fijar el tejido cerebral intacto en un gel de agarosa al 2% por lo que será conveniente para cortar el tejido. Nota: Para obtener un cráneo intacto y muestra en el cuero cabelludo, el tejido cerebral debe retirarse el lado ventral de la cabeza del animal sin ningún daño a la porción dorsal de la cabeza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento de corte de cerebro
	<ol>
<li>Extender una gota de superglue (~0.05 mL) en la superficie del bloque de montaje de vibratome.</li>
		<li>Con cuidado coloque el bloque de agarosa en el vibratome bloque de montaje para que la superficie ventral del cerebro es boca abajo y ajustar su posición.</li>
		<li>Ligeramente la patilla el vibratome a la superficie superior del bloque de agarosa y registre el valor de corte como el nivel primario.</li>
		<li>Llene el tanque de vibratome con solución salina normal helada.</li>
		<li>Ajustar los parámetros de vibratome (p. ej., el grosor de corte [1 mm], velocidad [5 de 5 en la unidad de dispositivo] y frecuencia [5 de 5 en la unidad de dispositivos]) para obtener corte satisfactorio.</li>
		<li>Cortar transversalmente el cerebro en una rebanada con un espesor de 1.000 μm. Nota: El segmento es la porción del tejido de cerebro delimitado por la superficie cortical y un plano colocado 1.000 μm inferior a la superficie cortical (el hipocampo dorsal).</li>
		<li>Añadir una gota de agua (~0.05 mL) en la superficie de vidrio óptico y poner la rebanada del cerebro en la parte superior. Luego, añadir una gota de agua en el cerebro rebanada y coloque con cuidado el segundo vidrio óptico en la parte superior. Nota: Una gota de agua debe añadirse a los límites de vidrio muestra para prevenir el secado del tejido y luz dispersión de superficies rugosas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medición de la transmisión ligera a través de los tejidos de la cabeza
	<ol>
<li>Configurar el equipo óptico, incluyendo el dispositivo láser, reflejo de espejos y medidor de alimentación. PRECAUCIÓN: Poner gafas de protección ocular antes de encender el láser.</li>
		<li>En la ausencia de una muestra en el medidor de energía, encienda el dispositivo láser y enfocar el rayo láser en el espejo que se encuentra a la distancia adecuada para guiar el rayo perpendicular al área activa del fotodiodo. Nota: Las mediciones de transmisión de luz deben realizarse en un cuarto oscuro a temperatura ambiente (23-25 ° C), dentro de 30 minutos después de que se hayan extraído los tejidos de la cabeza.</li>
		<li>Realizar mediciones en el tejido cerebral en rodajas.<ol>
<li>Coloque dos vidrios ópticos en blanco sobre la superficie del medidor de energía.</li>
			<li>Leer la potencia de luz transmitida (I0) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.</li>
			<li>Suavemente Coloque la muestra de cerebro, que está rodeada por dos vidrios ópticos, en la superficie del medidor de energía, enfocar el rayo en la zona respectiva de tejido, leer la potencia y el valor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar mediciones en el cráneo y el cuero cabelludo.<ol>
<li>Coloque un vidrio óptico en blanco sobre la superficie del medidor de energía.</li>
			<li>Leer la potencia de luz transmitida (I0) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.</li>
			<li>Ligeramente Coloque un vidrio óptico con cráneo fresco más tejido en la superficie del medidor de potencia en el cuero cabelludo, coincide con el haz de luz en la zona de vértice, leer la potencia y el valor.</li>
			<li>Con el fin de maximizar la relación señal a ruido, repita la medición de la transmisión de la luz por lo menos 3 x para todas las muestras. Nota: La zona de vértice se coloca en un rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas aproximadamente 3 mm. El espesor de los tejidos del cráneo y del cuero cabelludo se mide con un calibrador estándar.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Photobiomodulation terapia (PBMT)
Nota: Se utilizaron cuarenta y cinco ratones BALB/c machos asignados a tres grupos de 15 ratones. Los grupos estaban compuestos de ratones jóvenes-control (2 meses) que recibieron sham-PBMT, control de edad ratones (18 meses de edad) que recibieron tratamiento simulado-PBMT y ratones envejecidos-PBMT (18 meses de edad) que recibieron PBMT. El tratamiento de sham PBMT consistió en tratamiento idéntico a la PBMT grupo, pero con el láser inactivo. Ratones fueron obtenidos de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas y fueron alojados en el unidad del centro de investigación de Neurociencias (NSRC) animales a 24-25 ° C y 55% humedad relativa, con 12 h luz y fotoperíodo oscuro 12 h. Alimentos y el agua fueron proporcionados ad libitum. Todos los ratones fueron aclimatados durante al menos 1 semana antes del tratamiento.
<ol><li>
Procedimiento de tratamiento láser Nota: Un diodo láser de GaAlAs con modo de onda continua en longitud de onda de 660 nm se utilizó para el tratamiento de PBMT transcraneal. El dispositivo del laser fue funcionado en una potencia de 200 mW ± 2 y una irradiación de 6.66 W/cm2, con un tamaño de punto de 0,03 cm2. Una fluencia promedio de 99.9 J/cm2 por cada sesión se entregó a la superficie del cuero cabelludo durante 15 s de irradiación. La irradiación fue administrado 1 x día durante 2 semanas consecutivas.<ol>
<li>Llevar los ratones en sus jaulas hogar a la sala de terapia, aproximadamente 20 minutos antes de comenzar el tratamiento.</li>
		<li>Conecte un protector eléctrico a la toma de corriente.</li>
		<li>Inserte el enchufe del dispositivo de láser en un protector eléctrico.</li>
		<li>Cubrir la punta de la sonda de láser con una película de nylon transparente para evitar cualquier rasguño en la superficie.</li>
		<li>Conecte con cuidado la sonda en el canal del dispositivo láser.</li>
		<li>Encienda el dispositivo láser y esperar unos segundos para se caliente.</li>
		<li>Ajustar los parámetros de tratamiento de láser, incluyendo el modo de operación y tiempo de irradiación.</li>
		<li>En ausencia de cualquier muestra, determinar la potencia media de láser por ponerse en contacto con la punta de la sonda en la zona del medidor de energía activa en el dispositivo de láser. Registre el valor.</li>
		<li>Repita el proceso de calibración (paso 2.1.8) al menos 5 x, leer las energías incidentes desde el medidor de energía pantalla y registran los valores.</li>
		<li>Suavemente Sujete un ratón por la piel dorsal del cuello del animal en la palma de una mano e inmovilizar su cabeza. Nota: En el protocolo actual, la sonda láser se coloca sobre la zona de vértice, que es ~ 3 mm rostral a una línea trazada entre la base interna de las orejas.</li>
		<li>Coloque suavemente la punta de la sonda directamente en el cuero cabelludo en la línea media, aproximadamente de 3 mm de rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas. Nota: Sujete la sonda a un ángulo aproximado de 45° al plano del abdomen.</li>
		<li>Para evitar la irradiación directa a los ojos del animal, primero con la punta de la sonda en la cabeza y, luego, encienda el dispositivo laser.</li>
		<li>Encienda el láser y mantener estable la sonda hasta la finalización de la irradiación.</li>
		<li>Después del final de la terapia, retirar la sonda de láser de la cabeza y suavemente volver el ratón a su jaula.</li>
		<li>El dispositivo láser y desconecte la sonda del dispositivo.</li>
		<li>Limpiar la sonda de láser con un limpiador óptico apropiado.</li>
		<li>Transferencia de los ratones a un centro de animales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. comportamiento tareas
<ol><li>
Prueba de campo abierto
	<ol>
<li>Evaluar el aparato locomotor actividad de cada ratón por la distancia total recorrida durante una prueba de campo abierto, como describe previamente15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tarea de laberinto de Barnes
	<ol>
<li>
Aparato de Nota: La tarea de aprendizaje y la memoria espacial se realiza en un laberinto de Barnes16. El aparato utilizado para esta tarea de neurobehavioral consiste en una plataforma circular hecha de madera negra (95 cm de diámetro) con 20 equidistante, agujeros circulares de 5 cm de diámetro que se encuentran en la plataforma, 3 cm desde el perímetro. El aparato es elevada 50 cm del piso para evitar que el animal bajando. Una caja móvil escape plástico negro (20 x 15 cm x 5 cm) se coloca debajo del orificio de escape. Un laberinto negro se utiliza para pruebas de ratones blancos y un negro mat debe colocarse bajo el laberinto cuando se utiliza un software de sistema de seguimiento.<ol>
<li>Coloque el aparato de laberinto en el centro de una habitación tranquila con brillante iluminación cenital.</li>
			<li>Coloque un letrero de "No entrar" en el exterior de la puerta de la sala de tarea.</li>
			<li>Coloque señales visuales-espaciales en los muros perimetrales.</li>
			<li>Coloque una cámara de vídeo digital sobre la plataforma de laberinto.</li>
			<li>Limpie la superficie de la plataforma de laberinto con etanol al 70% para eliminar señales olfativas no deseados.</li>
			<li>Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama de jaula casera del animal en el interior de la caja de escape para servir como una referencia olfativa.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Sesión de adaptación
		<ol>
<li>Traer cada ratón a la tarea sala aproximadamente 30 min antes de comenzar el experimento, en orden para que el ratón de ser habituado.</li>
			<li>Quitar el ratón de su jaula y suavemente Coloque el animal en la caja de escape durante 1 minuto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Sesión de entrenamiento Nota: La sesión de entrenamiento se repite para cada ratón en 4 días consecutivos.<ol>
<li>Retire suavemente el ratón de la caja de escape.</li>
			<li>Coloque el ratón en el centro de la arena; Luego, coloque la cámara de inicio en la parte superior del ratón.</li>
			<li>Retire la cámara de inicio después de 10 s y el ratón para explorar la arena de 3 minutos.</li>
			<li>Tranquilamente hacia el área de la computadora y puesto en auriculares de cancelación de ruido.</li>
			<li>Desencadenar un estímulo auditivo negativo que consiste en un ruido blanco de aproximadamente 80 dB a nivel de la plataforma y comenzar a grabar el ratón.</li>
			<li>Apague el ruido blanco y dejar de grabar cuando el ratón entra en la caja de escape. Permite al animal permanecer inalterados en el cuadro de 1 minuto.</li>
			<li>Quite el ratón de la caja de escape y coloque en su jaula.</li>
			<li>Repita los pasos 3.4.2 por 3.4.7 4 veces por día, con intervalos de 3 minutos entre los ensayos repetidos. Nota: Entre todos los ensayos, quite cualquier orina o las heces de la superficie de la arena y limpiar el laberinto con etanol al 70%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Sesión de prueba de sonda
		<ol>
<li>Tras el último entrenamiento ensayo, 24 h después, quitar la casilla de escape de la plataforma de laberinto y repita los pasos 3.4.2 a través de 3.4.5.</li>
			<li>Después de 3 minutos, apagar el ruido blanco y deje de grabar. Quitar el ratón de la arena de laberinto y coloque en su jaula.</li>
			<li>Después de todos los animales han sido probados, limpie la plataforma del laberinto y la cámara de inicio. Apagar las luces de la habitación y quitar el letrero de "No entrar" de la puerta.</li>
			<li>Almacenar las grabaciones en vídeo de las sesiones de prueba a un disco duro externo para su posterior análisis.</li>
			<li>Configurar el programa seguimiento de video y extracto de los parámetros de interés de los vídeos grabados, incluyendo el tiempo de latencia para encontrar el agujero del objetivo durante 4 días de sesiones de entrenamiento y el tiempo gastados en el cuadrante de destino durante la sesión de prueba de sonda.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. bioquímica evaluación
<ol><li>
Niveles de ATP en el hipocampo
	<ol>
<li>Anestesiar profundamente cada ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg por gramo de peso corporal) y xilacina (10 mg por gramo de peso corporal).</li>
		<li>Decapitar al animal y quitar rápidamente el tejido cerebral del cráneo.</li>
		<li>Disecar un hipocampo y homogeneizar el tejido en el tampón de muestra helada (proporcionado por el kit) con un homogeneizador de tejidos.</li>
		<li>Inmediatamente centrifugar el homogeneizado a 2.000 x g durante 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.</li>
		<li>Evaluar los niveles de ATP hippocampal, utilizando la lectura espectrofotométrica método descripto anteriormente11.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuts+and+bolts+of+low-level+laser+%28light%29+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (2), 516-533 (2012).</li>
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<li>Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+the+head%3A+photobiomodulation+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Clinical%22%5BJournal%5D)">Shining light on the head: photobiomodulation for brain disorders.</a> BBA Clinical. 6, 113-124 (2016).</li>
<li>Karu, T. I., Pyatibrat, L. V., Kolyakov, S. F., Afanasyeva, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+measurements+of+a+cell+monolayer+relevant+to+phototherapy%3A+reduction+of+cytochrome+c+oxidase+under+near+IR+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Absorption measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c oxidase under near IR radiation.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 81 (2), 98-106 (2005).</li>
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<li>DeTaboada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+application+of+low-energy+laser+irradiation+improves+neurological+deficits+in+rats+following+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%3A+The+Official+Journal+of+the+American+Society+for+Laser+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transcranial application of low-energy laser irradiation improves neurological deficits in rats following acute stroke.</a> Lasers in Surgery and Medicine: The Official Journal of the American Society for Laser Medicine and Surgery. 38 (1), 70-73 (2006).</li>
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</ol>

Sueldo de P.C. fue apoyado por el Departamento de psiquiatría de Harvard (beca Dupont-Warren y Premio de Livingston), por el cerebro y la Fundación de investigación del comportamiento (NARSAD Young investigador Award) y por el Fototer Inc. irrestricto beca. La donación de medicamentos provenientes de TEVA. Reembolso de viajes vino de Pharmacia-Upjohn. P.C. ha recibido honorarios de consulta de Janssen investigación y desarrollo. P.C. ha presentado varias patentes relacionadas con el uso de la luz infrarroja en psiquiatría. PhotoMedex, Inc. suministra cuatro dispositivos para un estudio clínico. P.C. ha recibido fondos sin restricción de Litecure Inc. para llevar a cabo un estudio sobre fotobiomodulación transcraneal para el tratamiento de trastornos depresivos mayores y llevar a cabo un estudio en sujetos sanos. P.C. cofundó una empresa (Niraxx luz terapéutica) se centró en el desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento basado en luz infrarroja; también es consultor para la misma empresa. P.C. recibió fondos de Ciencias cerebrales para llevar a cabo un estudio sobre photobiomodulation de transcranial para el trastorno de ansiedad generalizada. Otros autores no tienen conflictos de interés divulgar.

Se describe un protocolo para la realización de un procedimiento PBMT transcraneal en ratones. Este protocolo está dirigido específicamente a los laboratorios de neurociencia que realizan investigación fotobiomodulación en roedores. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado a otros animales de laboratorio que se utilizan con frecuencia en el campo de la neurociencia, como mono, conejo, perro o gato.
En la actualidad hay creciente interés en la investigación de transcranial PBMT con LEDs y...

PBMT, o terapia de luz láser de bajo nivel (LLLT), es un término general que se refiere a los métodos terapéuticos basados en la estimulación de tejidos biológicos de energía de la luz de los láseres o diodos emisores de luz (LEDs). Casi todos los tratamientos PBMT se aplican con rojo a la luz de infrarrojo cercano (NIR) en longitudes de onda de 600 a 1100 nm, una potencia de salida desde 1 hasta 500 mW y un fluence de < 1 a > 20 J/cm2 (ver Chung et al.1).
Transcranial PBMT es un método de suministro de luz no invasiva que se lleva a cabo por la irradiación de la cabeza utilizando una fuente de luz externa (láser o LED)2. Para aplicaciones de animal, este método incluye contacto o sin contacto de la sonda láser o LED en la cabeza del animal. Dependiendo de la región terapéutica de interés, puede colocarse una sonda suave sobre toda la cabeza (para cubrir todas las áreas del cerebro) o sobre una parte específica de la cabeza, como la región prefrontal, frontal o parietal. La transmisión parcial de luz roja/NIR por el cuero cabelludo, el cráneo y la duramadre puede alcanzar el nivel de la superficie cortical y proporcionar una cantidad de energía fotónica suficiente para producir beneficios terapéuticos. Posteriormente, el fluence luz entregado a nivel cortical se propaga en la materia gris y blanca del cerebro hasta alcanzar las estructuras profundas del cerebro3.
Luz en las bandas espectrales en el rojo a far-red región (600-680 nm) y la región NIR temprano (800-870 nm) se corresponde con el espectro de absorción del citocromo c oxidasa, la enzima terminal de la cadena respiratoria mitocondrial4. Se presume que PBMT en el espectro rojo/NIR provoca photodissociation de óxido nítrico (NO) de la citocromo c oxidasa, dando por resultado aumentos en el transporte de electrones mitocondrial y, en última instancia, aumento de la generación de ATP5. Con respecto a aplicaciones neuronales, los beneficios potenciales de la neurostimulatory de cerebro PBMT usando irradiación de transcranial métodos se han divulgado en una variedad de estudios preclínicos, incluyendo roedores modelos de Lesion traumatica cerebral6 accidente cerebrovascular agudo7,8de la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP)9, depresión10y envejecimiento11.
Envejecimiento del cerebro se considera una condición neurofisiológica que negativamente afecta algunas funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria12. Las mitocondrias son los orgánulos primarios responsables de la producción de ATP y bioenergética neuronal. La disfunción mitocondrial se sabe para ser asociada a déficits relacionados con la edad en áreas del cerebro que están vinculadas a la memoria de la navegación espacial, tales como el hipocampo13. Porque el tratamiento craneal con rojo/NIR luz principalmente los actos por la modulación de la bioenergética mitocondrial, suficiente dosis de luz entregada al hipocampo pueden resultar en la mejora de la memoria espacial de los resultados14.
El protocolo actual pretende demostrar el procedimiento PBMT transcraneal en ratones, con bajos niveles de luz roja. Describen las mediciones de transmisión de la luz láser requiere a través de los tejidos de la cabeza de ratones envejecidos. Además, laberinto de Barnes, como un aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y tarea de la memoria e hipocampales niveles de ATP, como un índice de bioenergética, se utilizan para la evaluación de los efectos del tratamiento en animales.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan</td><td>#1608234-01</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Alfasan</td><td>#1608238-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>#A4679</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Quickstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>#MA752-707</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio óptico</td><td>Marca de vela</td><td>#7102</td><td></td></tr><tr><td>Potencia medidor</td><td>Thor labs</td><td>#PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Detector de fotodiodos</td><td>Thor labs</td><td>#S121C</td><td></td></tr><tr><td>Calibrador</td><td>Pittsburgh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser GaAlAs</td><td>Thor Photomedicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etho Vision Centrífuga</td><td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Froilabo</td><td>#SW14R</td><td></td></tr><tr><td>orejeras</td><td>Blue Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Visionlite</td><td>#VCS2-E742H</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador Sterio</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Hamonteb</td><td>#665.128321</td><td></td></tr><tr><td>Barnes maze</td><td>Costom-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP kit de ensayo Sigma</td><td></td><td>#MAK190</td><td></td></tr><tr><td>Elisa lector</td><td>Conciencia#Stat</td> <td>Fax 2100</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de transcranial photobiomodulation terapia en ratones

A Protocol for Transcranial Photobiomodulation Therapy in Mice

Fotobiomodulación transcraneal es un enfoque terapéutico no invasivo innovador potencial para mejorar la bioenergética cerebral, función del cerebro en una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y mejorar la memoria en deterioro cognitivo relacionados con la edad y enfermedades neurodegenerativas. Se describe un protocolo de laboratorio para transcraneal photobiomodulation terapia (PBMT) en ratones. De ratones BALB/c (18 meses) se tratan con un 660 nm láser transcranially, una vez al día durante 2 semanas. Datos de transmitancia láser muestran que aproximadamente el 1% de la luz incidente de rojo en el cuero cabelludo alcanza una profundidad de 1 mm de la superficie cortical, penetrando el hipocampo dorsal. Los resultados del tratamiento se evaluaron mediante dos métodos: un Barnes laberinto de prueba, que es un dependiente de hipocampo espacial memoria y el aprendizaje tarea evaluación, y medición hipocampales niveles de ATP, que se utiliza como un índice de bioenergética. Los resultados de la tarea de Barnes muestran una mejora de la memoria espacial en ratones tratados con láser envejecidos en comparación con controles pareados por edad. Análisis bioquímico después de tratamiento con láser puede indicar aumento de los niveles de ATP hippocampal. Postulamos que la mejora de rendimiento de memoria es potencialmente debido a una mejora en el metabolismo de energía hipocampo inducida por el tratamiento de láser rojo. Las observaciones en los ratones podrían extenderse a otros modelos animales ya que este protocolo potencialmente podría ser adaptado a otras especies usadas con frecuencia en Neurociencia traslacional, como mono, conejo, perro o gato. Photobiomodulation transcraneal es una modalidad segura y rentable que puede ser un enfoque terapéutico prometedor en deterioro cognitivo relacionados con la edad.

Análisis estadísticos
El análisis estadístico de datos obtenidos de las sesiones de entrenamiento de Barnes se analizó mediante ANOVA de dos vías; la otras pruebas conductuales y análisis de niveles de ATP hipocampales entre los grupos se llevaron a cabo por ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Todos los datos se expresan como medios ± el error estándar de la media (SEM), excepto los dat...

Photobiomodulation terapia es una innovadora modalidad no invasiva para el tratamiento de una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y también puede mejorar la función cerebral saludable. Este protocolo incluye a una guía paso a paso a realizar photobiomodulation de cerebro en ratones por entrega luz transcranial, que puede ser adaptada para su uso en otros roedores de laboratorio.

Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones

Transcranial photobiomodulation is a potential innovative noninvasive therapeutic approach for improving brain bioenergetics, brain function in a wide ...

El objetivo general del siguiente protocolo experimental, es realizar una terapia de fotobiomodulación transcraneal utilizando bajos niveles de láser rojo en ratones. Esto se logra mediante el contacto directo de la sonda láser en la cabeza del ratón. Como primer paso, con el fin de evaluar la transmisión de la luz láser, disecciona cuidadosamente el tejido cerebral fuera del cráneo.Y luego medir el poder de la luz transmitida a través del cráneo más el cuero cabelludo y una rebanada milimétrica del tejido cerebral. En la sección de terapia, póngase en contacto con la punta de la sonda láser directamente en el cuero cabelludo en el bregma. Esta tarea de laberinto de Barnes evalúa esta función de aprendizaje espacial y memoria.Posteriormente, los niveles de ATP hipocampal se determinan mediante el método espectrofotométrico. Los datos de transmisión láser muestran que aproximadamente el 1% de la luz antecedente en la superficie del cuero cabelludo alcanzó un milímetro de profundidad desde la superficie cortical. Los resultados de la tarea de laberinto de Barnes muestran una mejora de la memoria espacial en los ratones envejecidos después de dos semanas del tratamiento con láser rojo transcraneal.Además, los resultados sugieren un aumento de los niveles de ATP hipocampal en los ratones envejecidos tratados con láser. La fotobiomodulación transcraneal es un enfoque terapéutico no invasivo para el tratamiento de una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y para mejorar la función cerebral saludable. De hecho, se cree que la terapia de fotobiomodulación causa fotodisociación del óxido nítrico del citocromo c oxidasa en las mitocondrias.Estos a su vez aumentan el transporte de electrones mitrocondriales, lo que en última instancia conduce a un aumento en la producción de ATP. Este método es un enfoque de suministro de luz seguro y rentable que se realiza mediante la radiación de la cabeza utilizando fuentes de luz externas, incluidos láseres y diodos emisores de luz. Casi todos los procedimientos de fotobiomodulación transcraneal se aplican con luz roja a casi infrarroja a una longitud de onda de 600 a 1100 nanómetros, una potencia que oscila entre uno y 500 milivatios, y la fluencia que va de uno a 20 julios por centímetro cuadrado.En un ratón profundamente anestesiado, disecciona cuidadosamente el tejido cerebral fuera del cráneo. En primer lugar, fijar el tejido cerebral intacto en un gel de agarosa y preparar todos los materiales necesarios, incluyendo cloruro de sodio y pegamento. A continuación, extienda una fina capa de pegamento en la superficie del bloque de montaje del vibratomo.Fije cuidadosamente el bloque de agarosa y ajuste su posición. Haga coincidir ligeramente la hoja vibratomo con la superficie superior del bloque y registre el valor del contador. Llene el tanque de vibratomo con solución salina normal helada.Ajuste la velocidad y la frecuencia de vibración del vibratomo y cambie el contador al valor adecuado para obtener un grosor de rebanada de un milímetro. Encienda el vibratome y presione el botón de inicio y corte el cerebro transversalmente en una rebanada con un grosor de un milímetro. En primer lugar, agregue una gota de agua en la superficie de vidrio óptico.Luego, pon la rebanada de cerebro en el vaso. Agregue la gota de agua y coloque cuidadosamente el segundo vidrio óptico. Tenga en cuenta que se debe añadir una gota de agua a los límites de la muestra y el vidrio con el fin de evitar el secado de tejido y también la dispersión de la luz de las superficies rugosas.Transfiera muestras al laboratorio óptico. Configure los dispositivos ópticos y encienda el medidor de potencia. Use gafas de protección ocular antes de empezar a operar con el dispositivo láser.Encienda el láser y haga que el haz se centre en el espejo para guiar el haz hacia el área activa del fotodiodo. En primer lugar, coloque dos gafas ópticas en blanco en la superficie del medidor de potencia y lea la potencia de luz transmitida desde la pantalla. Retire los anteojos en blanco y coloque suavemente la muestra del cerebro en la superficie del medidor de potencia, y enfoque el haz en el área respectiva del tejido, y lea la potencia transmitida.Esta vez, coloque un vidrio óptico en blanco en la superficie del medidor de potencia y lea la potencia de luz transmitida. Luego, retire el vidrio en blanco y coloque ligeramente un vidrio óptico con cráneo fresco y tejido de cuero cabelludo en la superficie del medidor de potencia. Enfoque el haz en el bregma y lea la potencia transmitida.Por último, apague el dispositivo láser y el medidor de potencia. La sección de terapia del protocolo actual incluye la aplicación de los instrumentos láser de clase 3B y esto requiere pautas de entrenamiento y seguridad adecuadas. Con el fin de adaptar los animales al nuevo entorno, llevar ratones de sus jaulas de origen a la sala de terapia aproximadamente 20 minutos antes de comenzar el tratamiento.En primer lugar, inserte el enchufe del dispositivo láser en un protector eléctrico. Cubra la punta de la sonda láser con una película de nylon transparente para evitar cualquier rasguño en la superficie de la sonda. Conecte cuidadosamente la sonda láser al canal del dispositivo.Use gafas de protección ocular antes de empezar a operar con el dispositivo láser. Encienda el dispositivo láser y espere unos segundos para su calentamiento. Después de observar el letrero Laser Ready en el panel del dispositivo, ajuste los parámetros de tratamiento, incluido el tiempo de irradiación y el modo de funcionamiento.Antes de iniciar el tratamiento, determine la potencia media del láser poniéndose en contacto con la punta de la sonda con el área activa del medidor de potencia en el dispositivo. En el protocolo actual, la sonda láser se coloca en la zona del bregma, que es aproximadamente tres milímetros rostral a una línea dibujada entre la base anterior de las orejas. Con el fin de evitar la radiación directa a los ojos del animal, en primer lugar, coloque la punta de la sonda láser en la cabeza, luego, encienda el láser y sostenga la sonda de forma estable hasta la finalización de la irradiación.A continuación, apague el dispositivo láser y desconecte la sonda del dispositivo. Al final del procedimiento, limpie la sonda láser con un limpiador óptico adecuado. La tarea de aprendizaje espacial y memoria se realiza en un laberinto de Barnes.En primer lugar, coloque el signo no introducir en el exterior de la puerta de la sala de tareas. Adjunte señales espaciales visuales a los muros perimetrales. Coloque una cámara de vídeo sobre la plataforma del laberinto.Limpie la superficie de la plataforma del laberinto con 70%etanol para eliminar las señales olfativas no deseadas. Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama de la jaula de la casa del animal en la caja de escape para servir como una señal olfativa. Antes de comenzar la tarea, coloque cada ratón en la nueva jaula y transfiera la jaula a la sala de laberinto de Barnes.Para habituar, deje que el animal permanezca en la habitación durante 30 minutos antes de la tarea. Luego, retire el ratón de su jaula y coloque suavemente el animal en la caja de escape, y deje que permanezca allí durante un minuto. Después de un minuto, retire suavemente el ratón de la caja de escape, coloque el animal en el centro de la arena y coloque la cámara de arranque en él.Después de un período de diez segundos, levante la cámara de salida y permita que el animal explore la arena durante tres minutos. Muévete tranquilamente al área de la computadora, usa orejeras y activa un estímulo auditivo negativo que consiste en un ruido blanco fuerte. A continuación, comience a grabar en vídeo y observe el comportamiento del animal en el monitor de la computadora.Tenga en cuenta que se debe utilizar un laberinto negro para probar ratones blancos. Además, se debe colocar una estera negra debajo del laberinto en el software del sistema de seguimiento de casos debe ser utilizado. Configure el programa de software de seguimiento de vídeo y extraiga los parámetros de interés de los vídeos grabados.Para una evaluación bioquímica, diseccionar los tejidos del hipocampo, homogeneizarlos en un tampón de muestra, centrifugarlos y luego evaluar sus niveles de ATP utilizando el método espectrofotométrico. La transmisión de luz láser de 660 nanómetros a través del cráneo más el cuero cabelludo de los ratones envejecidos fue de aproximadamente 16%También, el valor de alrededor del 10% se midió como una transmisión láser a través de una rebanada de un milímetro de tejido cerebral envejecido. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el registro de la actividad motora en la prueba de campo abierto entre todos los grupos experimentales.Los datos de la tarea del laberinto de Barnes mostraron que los tiempos de latencia de los animales de control envejecidos son obviamente más largos que los del grupo de control joven en el tercer y cuarto día de la sesión de entrenamiento. Sin embargo, el tratamiento con láser rojo redujo significativamente el tiempo de latencia en el cuarto día. En la sesión de prueba de apoyo, los animales de control envejecidos pasan tiempos significativamente más cortos en el cuadrante objetivo en comparación con los animales de control jóvenes.Sin embargo, los ratones envejecidos tratados con láser pasaron tiempos significativamente más largos en los cuadrantes objetivo en comparación con los ratones de control envejecidos. Los datos de bioenergética del hipocampo revelan una disminución en los niveles de ATP en los animales de control envejecidos. Por otro lado, el tratamiento con láser rojo aumenta significativamente el contenido medio de ATP en el hipocampo de los ratones envejecidos.Describimos el protocolo para la realización de laboratorios de un procedimiento de terapia de fotobiomudulación transcraneal en ratones. Nuestro protocolo se puede adaptar a cualquier otro animal de laboratorio que se utiliza con frecuencia en el campo de la neurociencia traslacional, como conejo, perro, mono, etc. Según nuestra investigación, los bajos niveles de luz roja pueden recuperar la disfunción del hipocampo en el cerebro envejecido al aumentar la producción de ATP, que se refleja en una función de memoria espacial mejorada.En este método, en función de qué regiones cerebrales se realizan por patología, se requieren varios parámetros físicos y de tratamiento, incluyendo el tiempo de irradiación, el intervalo de tratamiento, la luminosidad aplicada y la fluidez, para ajustarse de manera óptima para lograr mejores resultados. La terapia de fotobiomodulación transcraneal se propone como un enfoque prometedor para mejorar el metabolismo cerebral y la mejora cognitiva que podría ser una estrategia potencial para el deterioro cognitivo relacionado con la edad y enfermedades neurodegenerativas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Zhang, L., et al. La luz infrarroja cercana (NIr) aumenta la expresión de un marcador de la función mitocondrial en el epitelio sensorial vestibular del ratón. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el proceso de aplicación de luz NIr en el cuero cabelludo de un ratón afeitado para activar las neuronas vestibulares y estimular la producción de superóxido dismutasa-1 (SOD-1), apoyando la función neuronal. El procedimiento destaca la terapia NIr como una estrategia neuroprotectora.

Modulación de la señalización neuronal sensorial en un modelo de ratón utilizando luz infrarroja cercana

Fuente: Kodani, S., et.al. Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante el monitoreo de estados de sueño / vigilia en ratones. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la manipulación optogenética de los circuitos neuronales involucrados en la transición del sueño a la vigilia en ratones. El procedimiento consiste en implantar quirúrgicamente una fibra óptica y electrodos en el cerebro y los músculos para permitir la estimulación de la luz y el registro electrofisiológico. Al...

Manipulación optogenética de circuitos neuronales para la transición del sueño a la vigilia en ratones

Este video muestra el procedimiento para generar un accidente cerebrovascular fototrombótico en un modelo de ratón mediante la iluminación láser de un cráneo intacto después de la administración de un tinte fotosensible.

Modelado de accidente cerebrovascular fototrombótico en modelo de ratón: una técnica de iluminación láser a través del cráneo de ratón después de la administración de un tinte fotosensible para inducir fototrombosis

Photothrombosis es una técnica rápida, mínimamente invasivo para la inducción de infarto pequeño y bien delimitado en áreas de interés de una manera altamente reproducible. Es especialmente adecuado para el estudio de las respuestas celulares y moleculares que subyacen a la plasticidad cerebral en ratones transgénicos.

Isquemia photothrombotic: Un modelo de lesión cortical fotoquímico mínimamente invasiva y reproducible de Estudios Carrera Ratón

La disfunción mitocondrial es una característica de la senescencia celular. En este trabajo se utiliza el tratamiento no invasivo de infrarrojo cercano (NIR) para mejorar la función mitocondrial en el ratón epitelio sensorial vestibular envejecimiento.

Infrarrojo Cercano (NIR) Luz aumenta la expresión de un marcador de la función mitocondrial en el ratón vestibular sensorial Epitelio

Estimulación por corriente directa transcraneal (tDCS) es una técnica terapéutica que se propone para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas. Un modelo animal es esencial para la comprensión de las alteraciones biológicas específicas evocadas por pinza. Este protocolo describe un modelo de ratón de pinza que usa un electrodo implantado crónico.

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Este protocolo presenta un conjunto de experimentos adoptados para la evaluación de péptidos anticancerígenos fotoconmutables, que pueden ser utilizados en el cribado preclínico de dichos compuestos. Esto incluye la evaluación de citotoxicidad en cultivos celulares 2D y 3D, la evaluación de la eficiencia de fotoisomerización ex vivo (tejido modelo) y la eficacia in vivo .

Evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer

Este estudio presenta la tecnología no invasiva y portátil de fotobiomodulación transcraneal bajo control electroencefalográfico para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas (por ejemplo, beta amiloide soluble) del cerebro de ratones machos BALB/c envejecidos y no anestesiados durante el sueño profundo natural.

Fotobiomodulación bajo controles electroencefalográficos del sueño para la estimulación de la eliminación linfática de toxinas del cerebro de ratón

El protocolo incluye la fabricación de transductores, la notificación de parámetros, el procedimiento quirúrgico y el registro de señales para todo el flujo de trabajo operativo de neuromodulación de ultrasonido focalizado concurrente y registro de fotometría de fibra en ratones que se mueven libremente.

Neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre

Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la terapia hipertérmica dirigida en modelos de tumores sólidos. El enfoque aprovecha la conversión fototérmica de la luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro inyectadas intratumoralmente para inducir un calentamiento localizado dentro del microambiente tumoral.

Inducción de hipertermia leve dirigida en modelos tumorales murinos mediante conversión fototérmica de luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro intratumorales

Utilizando un enfoque totalmente óptico, se induce un accidente cerebrovascular isquémico mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal de Ca2+ utilizando un biosensor fluorescente en el núcleo de accidente cerebrovascular emergente de un ratón despierto y que se comporta.

Fototrombosis y fotometría de fibra simultáneas para inducir y monitorear el accidente cerebrovascular isquémico en ratones que se comportan

Aprende a realizar fotobiomodulación transcraneal con láser rojo en ratones para evaluar memoria espacial y niveles de ATP hipocampal. Este protocolo no invasivo mejora funciones cognitivas en modelos de envejecimiento.

Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones

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