Name: Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprende técnicas de fagocitosis in vitro e in vivo en macrófagos alveolares de ratones para estudiar la eliminación de Pseudomonas aeruginosa. Este método permite analizar la función inmune pulmonar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo es apoyado por beca R01HL116826 a X. Zhao.

Este protocolo sigue las pautas de la institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Eastern Virginia Medical School.
1. fluorescente granos fagocitosis
<ol><li>Eutanasia el ratón (C57BL/6J, 6 semanas de edad, mujer) por CO2 asfixia según protocolos IACUC para la eutanasia ética de los animales.</li>
	<li>Coloque el ratón pique en una tabla de disección cubierta con toallas de papel. Precisar sus patas con sus extremidades spread-eagle y enganchar una cadena bajo sus dientes delanteros tirando su cabeza hacia atrás para que la tráquea quede recto y nivel.</li>
	<li>Mojar la garganta, pecho y vientre con etanol al 70% para desinfectar y evitar que la piel se pegue a las herramientas del ratón.</li>
	<li>Con fórceps regular, tire de la piel en la línea central del cuerpo y cortar con tijeras quirúrgicas para arriba de la línea central a la parte superior de la garganta.</li>
	<li>Cuidadosamente con el extremo despuntado de tijeras quirúrgicas estándar, alejar el músculo y los tejidos conectivos en la garganta y utilizar tijeras de primavera (microscissors) para exponer la tráquea.</li>
	<li>Agarrar un anillo de cartílago con las pinzas, con cuidado haga una pequeña incisión (~1.5 mm), con microscissors, en la cara del ventrículo de la tráquea e Inserte una cánula 18 G en la tráquea.</li>
	<li>Lavado cuidadosamente 3 mL de tampón fosfato salino (PBS), 1 mL a la vez. Cada vez que retire suavemente el líquido en la jeringa y el infundir de nuevo en el pulmón, 3 x en la sucesión. Después de recoger el BALF, realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia. El PBS recogido (~2.8 mL), que es el lavado broncoalveolar (BALF), la transferencia a un tubo, centrifugar a 1.000 x g durante 10 min y recoger el diábolo. Añadir 1 mL de PBS fresco al tubo y centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos lavar los residuos y recoger los alimentos peletizados macrófagos alveolares.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 2 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% inactivado le suero bovino fetal (FBS) y macrófagos alveolares primarios de la cultura en los mismos medios por 2 días en un plato de fondo de cristal a 37 ° C en un ambiente humidificado.</li>
	<li>Aspirar viejos media, lave con 1 mL de PBS y añadir 2 mL de medio fresco. Añadir granos FITC (cuentas de látex carboxilado, 2 μm de diámetro, 50 perlas/célula) e Incube por 1 h a 37 ° C en un ambiente humidificado.</li>
	<li>Lavar exhaustivamente con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) para quitar granos extracelulares. Imagen 100 células al azar y contar las células con los granos intracelulares (488 nm). Nota: fagocítico índices son el número de granos ingeridos dividido por el número de macrófagos; el porcentaje de células fagocíticas es el número de macrófagos que ingieren al menos una bola dividida por el número total de macrófagos16.<ol>
<li>Alternativamente, después de una incubación de 1 h con los granos, lavar las células con 3 mL de PBS y procesarlas para citometría de flujo para la cuantificación de la fagocitosis. Del mismo modo, proceso, AMs sin granos sin manchas de células como las células del control. Calcular el porcentaje de positividad y media intensidad de fluorescencia, utilizando software de citometría de flujo, seleccionando las opciones en el software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fagocitosis mediada por FcγR y CR
<ol><li>Para la opsonización, incubar 2 x 108 ovejas células de sangre rojas (SRBCs) con 50 μl de conejo anti-anuarios-IgM o 50 μl de conejo anti-anuarios-IgG durante 30 min a temperatura ambiente11.</li>
	<li>Incubar SRBCs IgM opsonizadora con 50 μl de suero humano C5-deficientes (C5D) durante 30 min a 37 ° C para fijar los fragmentos del complemento C3b y C3bi en SRBCs cubierto de IgM.</li>
	<li>Macrófagos murinos (células MH-S) de la semilla (10.000 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos y se incuba durante la noche para conseguir una confluencia de ~ 70%. Añadir 100 μl de 1 x 107/ml opsonizadora SRBCs en cada pocillo de las células de MH-S e incubar 1 h a 37 ° C. Lavado sin consolidar SRBCs muy rápidamente (~ 1 min) con 100 μl de tampón de lisis (ACK) de cloruro de amonio y potasio.</li>
	<li>Lyse las células con el 0,1% de SDS y añadir 50 μl de 2, 7-diaminofluorene (DAF) que contiene 6 M urea y peróxido de hidrógeno 3%. Medir la absorbancia de la formación de la hemoglobina-catalizada fluoreno azul a 620 nm.</li>
	<li>Determinar el número de SRBCs utilizando una curva estándar en los valores de absorbancia de 620 nm con un número conocido de SRBCs. Del mismo modo, proceso MH-S células incuban con nonopsonized SRBCs para usar como controles negativos.</li>
</ol>3. PRR-mediada por la fagocitosis
<ol><li>Siga los pasos 1.1-1.9 para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares primarios de ratón.</li>
	<li>Después de 2 días, eliminar los medios de comunicación lavan las células con 1 mL de PBS y agregar 500 μl de medios frescos que contienen biopartículas zymosan-A Alexa Fluor 488 conjugado (100 partículas/plato).</li>
	<li>Incubar durante 1 h a 37 ° C. Añadir 500 μl de PBS helada para detener la fagocitosis.</li>
	<li>Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados). Fijar las células con paraformaldehído al 4% por 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las células con PBS (1 mL a la vez, para un total de cinco lavados) y mantener las células en 500 μl de PBS.</li>
	<li>Imagen de las células en contraste de interferencia diferencial y un canal fluorescente en 488 nm. AMs con zymosan-A biopartículas y determinar el porcentaje de fagocitosis.</li>
</ol>4. en Vivo la fagocitosis por los macrófagos alveolares
Nota: p. aeruginosa GFP de inocular en una placa de agar nutritivo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Al día siguiente, inocular la Colonia solo a 2 mL de caldo nutritivo y crecen las bacterias a 37° C durante la noche.
<ol><li>Al día siguiente, anestesiar ratones con administración intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Confirmar la anestesia adecuada a través de una falta de respuesta a la presión del dedo del pie.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre un tablero plano con una banda elástica sobre los incisivos superiores y coloque en una posición semisentada (45°) con la superficie ventral y hacia arriba de la tribuna. Con unas pinzas curvas, parcialmente retrae la lengua. Usando un microsprayer, PCSC administrar 50 μl (5 x 106 unidades formadoras de colonias [CFU])17 de p. aeruginosa GFP en los pulmones de los ratones anestesiados.</li>
	<li>Después de 1 h de la infección, siga los pasos 1.1-1.7.</li>
	<li>Resuspender las células en PBS y Citocentrifuga ellos (1.000 x g, 1 min a temperatura ambiente) en un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Diferencialmente la mancha cytospin algunas diapositivas de los macrófagos alveolares, neutrófilos y linfocitos, según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Al azar seleccione 100 AMs cuenta AMs que contienen bacterias intracelulares y determinar el porcentaje de fagocitosis.</li>
</ol>5. en Vivo bacterias separación usando el p. aeruginosa
<ol><li>P. aeruginosa de inocular en una placa de agar de aislamiento de p. aeruginosa e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Inocular la Colonia solo 2 ml de caldo de lisogenia (LB) y crecen las bacterias a 37° C durante la noche. Calcular la UFC, utilizando la siguiente fórmula. UFC/mL = (número de colonias x factor de dilución) / volumen de la placa de cultivo. Diluir la cultura con PBS para obtener las UFC/mL deseada.</li>
	<li>En el ensayo 1, PCSC inyectar una dosis subletal de ~2.5 x 105 UFC/mL de p. aeruginosa anestesiado wild-type (WT) y TRIM72 ratonesKO , como se indica en el paso 4.2. Medir el peso corporal diariamente durante 6 días.</li>
	<li>En el ensayo 2, inyectar una segunda dosis de p. aeruginosa (5 x 105 UFC/mL) en los ratones que sobrevivieron en 1 prueba y medir el peso corporal durante 4 días.</li>
	<li>En el ensayo 3, utilizando un conjunto diferente de ratones, ratonesKO de WT y TRIM72 se inyectan con una dosis letal (3 x 107 UFC/mL) de p. aeruginosa y registrar la mortalidad dentro de 2 días de la inyección. Animales que muestren signos de estrés severo como pérdida de peso significativa, espalda jorobada, anorexia y disnea será evaluada por los veterinarios asistentes. Animales serán sacrificados inmediatamente.</li>
	<li>En la muerte o después de la eutanasia en el día 2 después de la inyección, recoger el tejido pulmonar total para la cuantificación de la carga bacteriana del pulmón en infección de pico.</li>
	<li>Para probar la carga bacteriana del pulmón, añadir 200 μL de solución salina normal a los tejidos pulmonares y homogeneizarlas, utilizando un ajuste previamente probado en un homogeneizador electrónico que interrumpe totalmente el tejido pulmonar sin romper las bacterias. Ajustar el volumen total del homogeneizado de pulmón a 1 mL y la placa de 100 μl de pulmón lisado en placas de agar de aislamiento de Pseudomonas en diluciones en serie 10 veces.</li>
	<li>Incubar las placas a 37 ° C durante 24 horas y contar las colonias bacterianas para determinar la UFC por pulmón entero.</li>
</ol>6. estadístico análisis
<ol><li>Uso del estudiante t-pruebas para determinar la significación estadística de la diferencia entre los dos grupos. Considerar una diferencia estadísticamente significativa cuando p < 0.05. Todos los datos se presentan como medios ± error estándar de la media (SEM).</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Al realizar una función de intercambio de gas, el pulmón persistente se enfrenta a alérgenos, agentes patógenos y partículas extrañas. AMs proporcionan la primera línea de defensa en virtud de su función principal, es decir, fagocitosis. AMs también coordinar con otras células a destruir los patógenos y en la resolución de la inflamación. Aquí, hemos descrito los métodos para evaluar específicamente la fagocitosis por AMs aislada del pulmón del ratón. El protocolo presentado en este manuscrito, explica un estudio detalla...

AMs son los principales fagocitos residente en los alvéolos en la etapa de descansa y uno de los principales actores de la respuesta inmune innata a través del reconocimiento y la internalización de patógenos inhalados y partículas1,2. Se ha reportado que AMs son esencial para la separación rápida de muchos patógenos pulmonares, como p. aeruginosa y Klebsiella pneumoniae3,4, por lo que una deficiencia en la fagocitosis de AM con frecuencia resulta en respiratorias infecciones, como neumonía aguda, que causan mayores tasas de mortalidad y morbilidad.
AMs también iniciar innatas respuestas inflamatorias en el pulmón mediante la producción de citoquinas y quimioquinas como TNF-α y IL-1β, que interferencia con otras células del ambiente alveolar para producir quimiocinas y reclutar inflamatorias neutrófilos, monocitos, y células inmunes adaptantes en el pulmón5. Por ejemplo, IL-1β producido por AMs ayuda a la liberación de lo neutrófilo chemokine CXCL8 de células epiteliales6. Por otra parte, el AMs contribuyen a la fagocitosis de la apoptosis de leucocitos polimorfonucleares (PMNs), fracaso del que conduce a la pérdida sostenida de enzimas intracelulares de PMNs al tejido circundante, resultando en daño tisular y la inflamación prolongada 7 , 8 , 9.
Fagocitosis por las AMs está mediada por un reconocimiento directo de patrones moleculares asociados a patógenos en la superficie de patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) de las AMs o por la Unión de patógenos opsonizadas con receptores inmunes efectoras de las AMs 10. para este último, AMs puede reconocer los objetivos opsonizadora con inmunoglobulina (IgG) a través de sus receptores de Fcγ (FcγR) o los patógenos recubiertos de fragmentos del complemento, C3b y C3bi, a través de sus receptores de complemento (CR)11. Entre los receptores del complemento, el CR de la superfamilia de las inmunoglobulinas (CRIg) se expresa selectivamente en los macrófagos de tejido12, y un reciente hallazgo destacó el papel del CRIg en fagocitosis de AM en el contexto de la pulmonía de p. aeruginosa 13.
Muchos estudios originales utilizan métodos para evaluar la fagocitosis de macrófagos para describir los mecanismos moleculares de la función de macrófagos14,15. Sin embargo, métodos como la fagocitosis in vivo requieren una cuantificación precisa de la fagocitosis. Aquí, se resume una metodología detallada para la fagocitosis in vitro e in vivo con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-cristal granos y proteína de p. aeruginosa verde fluorescente (GFP), respectivamente. Además, se explica el método de diferenciar entre PRR, CR y fagocitosis mediada por FcγR. Por último, se presenta un método para caracterizar la remoción bacteriana en ratón con respecto a p. aeruginosa neumonía.

<table><tbody><tr><td>Aguja 18-G</td><td>Nipro Medical&nbsp;</td><td>CI+1832-2C</td><td>Biología Molecular grado</td></tr><tr><td>2,7-diaminofluoreno (DAF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Biología Molecular grado</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Grado analítico</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Grado de biología celular</td></tr><tr><td>Tampón de lisis ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-biopartícula</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Biología molecular grado</td></tr><tr><td>C5 suero deficiente&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Reactivo bioquímico</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Citocentrífuga</td><td>Thermofisher Scientific A78300101</td><td>Número 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medios de cultivo celular</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Grado de biología celular</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Grado de biología celular</td></tr><tr><td>Flujo Citómetro</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Adecuado para la disección de animales de laboratorio</td></tr><tr><td>Perlas de látex carboxilado FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Grado de biología celular</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Adecuado para&nbsp; ensayos de infección celular</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de alta presión de</td> grado de biología celular <td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Adecuado para uso en animales de laboratorio</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida de</td> grado analítico <td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina Clorhidrato</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>Grado farmacéutico</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Tinciones</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Grado de Biología Celular</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Grado de Biología Molecular</td></tr><tr><td>LB</td><td>Caldo Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>Grado de Biología Molecular</td></tr><tr><td>MicroSprayer Aerosolizador Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td></td><td>Adecuado para uso en animales</td></tr><tr><td>de laboratorio Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Grado reactivo</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Grado de biología celular</td></tr><tr><td>conejo anti-SRBC-IgG&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Adecuado para inmunoensayos</td></tr><tr><td>de conejo anti-SRBC-IgM&nbsp;</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Adecuado para inmunoensayos</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Adecuado para la disección de animales de laboratorio</td></tr><tr><td>Laringoscopio para animales</td> pequeños <td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Adecuado para uso en animales de laboratorio</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Grado analítico</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte (Med)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Adecuado para la disección de animales</td></tr><tr><td>de laboratorio Tijeras de resorte (pequeñas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Adecuado para la disección de animales de laboratorio</td>, glóbulos rojos de</tr><tr><td>ovejas (SRBC) &nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>SRBCs lavados y conservados</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Biología Molecular grado</td></tr><tr><td>Xilacina&nbsp;</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>Grado farmacéutico</td></tr></tbody></table>

fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Los macrófagos alveolares (AMs) guardan el espacio alveolar del pulmón. Fagocitosis por AMs juega un papel fundamental en la defensa contra los invasores patógenos, la eliminación de células muertas o partículas extrañas y en la resolución de las respuestas inflamatorias y la remodelación tisular, procesos que son mediados por receptores distintos de la superficie de las AMs. Aquí, Divulgamos los métodos para el análisis de la función fagocítica de AMs usando estrategias experimentales y ensayos in vitro e in vivo para diferenciar entre el receptor de reconocimiento patrón-, receptor de complemento- y Fc gamma mediada por receptor fagocitosis. Finalmente, se discute un método para establecer y caracterizar un modelo de neumonía de p. aeruginosa en ratones para evaluar in vivo la eliminación bacteriana. Estos ensayos representan los métodos más comunes para evaluar las funciones de AM y también pueden utilizarse para estudiar la función de macrófagos y de remoción bacteriana en otros órganos.

Primero realizamos el experimento para analizar fagocitosis por ratón AMs primarias. A lo largo de todos los análisis, se compararon las AMs aislados de ratonesKO de WT y TRIM72. Como se muestra en la figura 1A, microscopía de fluorescencia reveló la fagocitosis de FITC-abalorios por ratón AMs primarias ocurre después de 1 h de incubación. Figura 1 B muestra el análisis de la fagocitos...

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno de nivel BSL-2. Recuerde seguir todas las prácticas de seguridad de nivel BSL-2 al manipular este organismo. Aquí demostraremos aislamiento de células primarias, fagocitosis in vitro, y análisis de vías fagocíticas, y fagocitosis in vivo y evaluación del aclaramiento bacteriano en ratones.La entrega intratraqueal exitosa requiere práctica para dominar. Asegúrese de que el microsprayer esté correctamente cargado, que la aguja esté entre los dos pliegues vocales y que la velocidad del émbolo esté controlada correctamente. Comience asegurando el ratón en la posición supina con las extremidades extendidas en una mesa de disección cubierta con toallas de papel y enganchando una cuerda debajo de los dientes delanteros para retraer la cabeza de modo que la tráquea se posicione recta y nivelada.Desinfecta el ratón con 70% de etanol y usa fórceps regulares para tirar de la piel en la línea central del cuerpo. Usa tijeras quirúrgicas para cortar la piel desde el abdomen hasta la parte superior de la garganta. Utilice el extremo romo de las tijeras quirúrgicas estándar para diseccionar cuidadosamente el músculo de la garganta y los tejidos conectivos.Abra

alveolar-macrophage-phagocytosis-and-bacteria-clearance-in-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

Fuente: Nagre, N., et al. Fagocitosis de macrófagos alveolar y eliminación bacteriana en ratones. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra la evaluación de la fagocitosis mediada por receptores del complemento utilizando glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM y complemento, seguida de su captación por macrófagos de ratón. El grado de fagocitosis se cuantifica midiendo un producto cromogénico azul formado por la oxidación catalizada por hemoglobina del diaminofluoreno.

Modelado de la fagocitosis mediada por complemento utilizando glóbulos rojos opsonizados in vitro

Toma un cultivo adherente de macrófagos murinos.Trata bien la prueba con un buffer que contiene Wnt5A, una molécula de señalización, y el control solo con buffer.Infecta con un patógeno bacteriano e incuba.En las células de prueba, Wnt5A activa una cascada de señalización que mejora la reorganización del citoesqueleto para potenciar la captación bacteriana en los fagosomas, mientras que las células de control que carecen de esta señalización internalizan menos bacterias.Lavar para eliminar...

Mejora de la eliminación bacteriana mediada por Wnt5A en macrófagos murinos

Un método para evaluar la capacidad de los macrófagos alveolares aislados de ratón para controlar el crecimiento de esporas de Aspergillus fagocitados por microscopía confocal.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Aquí describimos el modelo y el enfoque para estudiar las funciones de los macrófagos alveolares pulmonares en la metástasis del cáncer. Para demostrar el papel de estas células en la metástasis, se utilizó el modelo singénico (4T1) de cáncer de mama junto con la depleción de macrófagos alveolares con liposomas de clodronato.

El estudio de la función de los macrófagos alveolares en cáncer de mama metástasis

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.

En la evaluación Vivo de la efiytosis de macrófagos alveolares tras la exposición al ozono

Este protocolo describe el aislamiento de macrófagos intersticiales pulmonares (MI) y su transferencia adoptiva después de la estimulación de IL-33 de los alvéolos pulmonares en un modelo de ratón, lo que puede facilitar el estudio in vivo de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI).

Transferencia adoptiva de macrófagos estimulados por IL-33 en modelos de ratón inducidos por bleomicina para estudiar su efecto sobre la fibrosis pulmonar idiopática in vivo

Aprende técnicas de fagocitosis in vitro e in vivo en macrófagos alveolares de ratones para estudiar la eliminación de Pseudomonas aeruginosa. Este método permite analizar la función inmune pulmonar.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Explorar más videos