Name: Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Descubre cómo evaluar el efecto del anticuerpo Anti-c-fms en la osteoclastogénesis usando cultivos de médula ósea murina con RANKL o TNF-alfa. Este método permite generar osteoclastos puros para estudiar enfermedades óseas inflamatorias.

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Este trabajo fue apoyado en parte por un KAKENHI JSPS becado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (no. 16K 11776 H. K., no. 17K 17306 a K. S., no. 16K 20637 a k. k K., no. 16K 20636 a M. S., no. 18K 09862 I. m.).

Se realizaron todos los procedimientos animales y cuidado de los animales según el estatuto y el Reglamento de la Universidad de Tohoku.
1. manejo y disección de miembro posterior murino
<ol><li>Antes de la disección, llene un plato con unos 50 mL de α-MEM dependiendo del tamaño del recipiente y coloque en hielo. Esto servirá como un recipiente hasta que se completa la disección de todos los huesos. Para este y posteriores experimentos, usar α-MEM con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL.</li>
	<li>Eutanasia el ratón C57Bl/6J por la inhalación de una sobredosis de 5% de isoflurano.</li>
	<li>Fijar el ratón en una posición supina con pernos perforados a través de las palmas y pies y rocíe completamente con etanol al 70%.</li>
	<li>Hacer una incisión en la piel con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas a la altura de la cadera y extienda hasta los pies, exponiendo los músculos.</li>
	<li>Cortar el tendón adjuntando el músculo cuádriceps y el tendón adjuntando el músculo del tendón de la corva al hueso. Retire los músculos exponiendo las articulaciones cadera y rodilla. Localizar estos tendones facilitará la liberación de ambos músculos de sus accesorios sin dejar etiquetas blandas. No corte en el hueso.</li>
	<li>Colocar la tijera entre la cabeza del fémur y el espacio común y corte en liberar el fémur pero manteniendo intacto el hueso. Esto permitirá la separación de los huesos sin el riesgo de exposición de la médula ósea.</li>
	<li>Del mismo modo corte los músculos a la tibia. Cortar la tibia de su fijación en la articulación del tobillo manteniendo el hueso intacto para evitar la contaminación.</li>
	<li>Raspe cualquier tejido blando restante de fémur y la tibia utilizando las tijeras cuchillas y kimwipe y colocar en una placa con α-MEM colocado en hielo.</li>
</ol>2. aislamiento de médula trasera murino
<ol><li>Llene una jeringa de aguja de 30 G con α-MEM.</li>
	<li>Desconecte la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla.</li>
	<li>Corte los extremos de los huesos largos de ambos lados con unas tijeras.</li>
	<li>Mantener el hueso del eje con unas pinzas, inserte la aguja en el espacio de la médula del hueso y enjuague lentamente el contenido de la médula en una placa de cultivo de 6 cm. El hueso aparece blanco, indicando que la extracción de todo el contenido de médula ósea. Repita para todos los huesos.</li>
	<li>Tensión de la médula ósea extraer usando un colador de célula 40 μm nylon en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM, centrifugar a 300 x g durante 5 min lavado de repetición para un total de 2 veces.</li>
	<li>
Resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM y realizar un conteo usando un hemocitómetro como sigue:
	<ol>
<li>Hacer una dilución de 1:1 de la suspensión celular añadiendo 10 μL de la suspensión celular a 10 μL de tripano 0.4% azul en un tubo de 1,5 mL y pipetear una vez.</li>
		<li>Cubra la cámara del hemocitómetro con un tobogán y transferir la suspensión de tinte para el hemocitómetro. Es importante no sobrellene o llene la cámara y permite la suspensión llenar la cámara por capilaridad.</li>
		<li>Lugar el hemocitómetro sobre una platina del microscopio. Con el objetivo de 10 x, se centran en la Plaza del centro. Contar todas las células por 3 líneas. Para asegurarse de que las células no son contadas dos veces, contar las esquinas superiores y derecha de cada plaza. Las células muertas aparecerá azul oscuro, éstos quedan excluidos de la cuenta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dependiendo de la aplicación aguas abajo de la semilla las células en un recipiente apropiado de la cultura. Para este experimento particular, siga en la sección 3.</li>
</ol>3. generación de BMM
<ol><li>Semilla 1 x 107 células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 días.</li>
	<li>Después de 3 días, eliminar el medio de cultivo, lavar las células vigorosamente con 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) dos veces para eliminar las células no adherentes, añadir 5 mL de temperatura ambiente 0.02% tripsina-EDTA en PBS e incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 5 minutos.</li>
	<li>Separar las células mediante pipeteo cuidadoso. Asegúrese de que las células han sido separadas mediante la observación de la cultura bajo un microscopio (las células deben aparecer redondeadas y flotantes en los medios de comunicación). Si las células permanecen adjuntas, repita Pipetear cuidadosamente para separarlos. Cuando las células han sido separadas, añadir 5 mL de α-MEM para inactivar la reacción.</li>
	<li>Recoger las células en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g por 5 min, descartar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM.</li>
	<li>Realizar un conteo como se describió anteriormente en el paso 2.7.1.</li>
	<li>Semilla 1 x 106 células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 días.</li>
</ol>4. generación de osteoclastos de BMM como precursores de los osteoclastos
<ol><li>Después de 3 días, la cosecha las células adjuntas que representan BMM como precursores de los osteoclastos, siguiendo pasos 3.2-3.7.</li>
	<li>BMM semilla en 5 x 104 células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir RANKL para una concentración final de 50 ng/mL o TNF-α a una concentración final de 100 ng/mL. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C, 5% CO2 4 días. Cambiar los medios de comunicación diariamente durante 4 días.</li>
</ol>5. tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP)
<ol><li>Después de 4 días de incubación, aspirar suavemente el medio de cultivo de cada pozo. Lavar bien una vez con 200 μL de PBS 1 x de temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 200 μL de formalina al 10% a cada pocillo para la fijación e incubar 1 h a temperatura ambiente. Aspire el formol y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.</li>
	<li>Añada 200 μL de 0,2% Tritón X-100 en PBS a cada bien de permeabilización e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspire el Triton X-100 y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de tinción de trampa a cada pocillo. Visualizar la mancha bajo el microscopio. Tardará de 10 a 30 min de la mancha desarrollar correctamente.</li>
	<li>Aspirar la mancha y lavar cada pozo con agua desionizada 3 veces y seque al aire. Mantener a temperatura ambiente para utilizar en más de observación.</li>
</ol>6. proliferación ensayo
<ol><li>BMM semilla como precursores de osteoclastos en 5 x 103 células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 3 días sin cambio de medio.</li>
	<li>Después de 3 días, se lavan las células con PBS 1 x. Añada 100 μL de α-MEM en cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 10 μL de solución kit de conteo celular, incubar a 37 ° C, 5% CO2 h 2 y determinar la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, investigamos el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducida por RANKL, formación de osteoclastos inducida por el TNF-α y proliferación de precursores de osteoclastos inducida por el M-CSF. Se encontró que la cantidad efectiva de anticuerpos anti-c-fms para la inhibición de la osteoclastogénesis entre formación de osteoclastos inducida por RANKL, TNF-α inducida por osteoclastos formación y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos es diferente.
<p class="j...

Los osteoclastos son células altamente especializadas, y se diferencian de las células madre hematopoyéticas a través de la fusión de varios precursores de osteoclastos. Son esenciales para la remodelación de hueso sano y contribuyen a la resorción del hueso patológico asociada con enfermedades osteolíticas inflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad periodontal1.
Osteoclastogénesis y osteoclastos función es mediada por dos factores clave; macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando de factor nuclear kappa B (RANKL). M-CSF y RANKL son importantes para la diferenciación de los osteoclastos2. Otro factor que se ha demostrado para inducir la formación de osteoclastos de macrófagos de médula ósea in vitro es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α mediada por osteoclastos formación ha demostrado ser crítica para osteólisis en enfermedades óseas destructivas como artritis reumatoide6,7de la enfermedad periodontal y osteoporosis postmenopáusica8.
C-fms es el receptor de membrana de M-CSF y media su acción. El papel de c-fms está bien documentado en la literatura como se ha demostrado que la administración de un anticuerpo contra c-fms (anticuerpo anti-c-fms) totalmente detenido osteoclastogénesis en un modelo de artritis así como en TNF-α inducida por erosiones del hueso mientras que osteoclastogénesis distante de la articulación inflamada estaba aún robusto9. Administración de anticuerpos anti-c-fms inhibe los osteoclastos formación y hueso la resorción inducida por lipopolisacárido (LPS) en ratón calvariae10 así como en la periodontitis inducida por LPS modelo11. Además, anticuerpos anti-c-fms inhiben resorción de la raíz provocada por el estrés mecánico durante de movimiento dental ortodóncico12, así como el movimiento dental ortodóncico y la resorción ósea asociada de movimiento ortodóntico del diente13.
M-CSF se ha divulgado para tener otras funciones que son esenciales para la respuesta inmune del huésped. La ausencia de M-CSF en ratones op/op con neumonía bacteriana conduce al aumento de la carga bacteriana y diseminación bacteriana al hígado con necrosis hepática14. Por lo tanto, M-CSF es importante para la respuesta inmunológica en la protección contra la infección.
Este estudio demuestra el efecto de anticuerpos anti-c-fms en el M-CSF y RANKL o TNF-α inducida por la formación de osteoclastos in vitro y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos. Este protocolo demuestra el aislamiento de células de médula ósea murina de los huesos largos y los pasos para generar los macrófagos de la médula (BMM) que son considerados como precursores de los osteoclastos para inducir la diferenciación de BMM en osteoclastos multinuclear por dos métodos; RANKL o TNF-α. El protocolo también compara la detención de osteoclastogénesis en ambos métodos usando el anticuerpo anti-c-fms.
El proceso por el cual médula es extraída y utiliza posteriormente para generar precursores de osteoclastos es confiable en la producción de grandes cantidades de cultivos de osteoclastos pura que pueden ser utilizados en múltiples aplicaciones posteriores como las pruebas de drogas. El uso de RANKL o TNF-α para inducir osteoclastogénesis en este protocolo distingue osteoclastogénesis como un proceso fisiológico (RANKL) de osteoclastogénesis como un proceso patológico (TNF-α), que a su vez proporciona dos procedimientos alternativos para guiar la decisión de que uno es superior en cuanto a los reactivos a utilizar en aplicaciones posteriores. Este protocolo también proporciona un método por el cual podemos determinar una concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms que pueden utilizar con seguridad para estudios posteriores en la resorción ósea y enfermedades osteolíticas.

<table><tbody><tr>Anticuerpo <td></td><td></td><td>anti-c-Fms</td><td>AFS98, un anticuerpo monoclonal, antimurino, c-Fms (IgG2a) de rata,</td></tr> <tr><td>TNF-y alfa;</td><td></td><td></td><td>TNF-&alpha murino recombinante preparado en nuestro laboratorio. TNF-y alfa; Fragmento de ADNc clonado por RT-PCR y clonado en un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para generar una proteína de fusión GST. GST-TNF-y alfa; se expresó en células BL21 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). Las células se lisaron en condiciones no desnaturalizantes y GST-TNF-&alpha; se purificó sobre una columna de glutatión-sefarosa. El GST fue escindido por PreScission Protease (Amersham Biosciences) por el fabricante' y fue eliminado por una columna de glutatión-Sepharose.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Liendo sRANK murino recombinante, Fuente: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>humano recombinante. 1/10 vol de CMG14&ndash; Sobrenadante de cultivo de 12 líneas celulares a 5x106&nbsp; células en una placa de cultivo en suspensión de 10 cm.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>con L-Glutamina y rojo fenol</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Suero fetal bovino</td></tr> Plato de cultivo de origen francés <tr><td></td><td>Corning Plato estilo</td><td></td><td>100 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Plato de 96 pocillos</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta de superficie</td></tr><tr><td>Kit de recuento de células-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japón, Kawasaki, Japón</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colador de celdas</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu; m</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td> de nailon <td>Corning</td><td></td><td>50 mL Tapón</td></tr><tr><td>CentriStar Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polioxietileno (10) Éter de octilfenilo</td></tr></tbody></table>

efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Remodelamiento óseo es un proceso complejo e implica períodos de deposición y reabsorción. La resorción ósea es un proceso por el cual hueso se descompone por osteoclastos en respuesta a diversos estímulos. Precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos multinuclear en respuesta a la colonia de macrófagos estimulando la factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL). En condiciones patológicas, el perfil de citoquinas es diferente y consiste en una mezcla de citoquinas inflamatorias. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) es una de las citoquinas más importantes ya que se encuentra en grandes cantidades en áreas involucradas con el osteolysis inflamatorio. El propósito de este protocolo es proporcionar un método por el cual médula ósea murina es aislada para generar osteoclastos a través de la inducción con el M-CSF y RANKL o TNF-α que se inhibirá posteriormente al aumentar la dosis de anticuerpo anti-c-fms, el receptor por M-CSF. Este experimento pone de relieve el valor terapéutico de los anticuerpos anti-c-fms en enfermedades de la resorción ósea inflamatoria.

El propósito de este protocolo es evaluar el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos en presencia de RANKL o TNF-α y determinar el efecto de M-CSF sobre la proliferación de precursores de osteoclastos. En este protocolo, hemos proporcionado un proceso confiable por el cual se generan grandes cantidades de cultivos puros de los osteoclastos. También hemos proporcionado una manera para probar la concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms para inhibir la formac...

Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Este experimento destaca el valor terapéutico del anticuerpo Anti-c-fms en enfermedades de la alteración ósea inflamatoria, como la artritis reumatoide y la periodontitis. El proceso por el cual se extrae la médula ósea y se utiliza para generar precursores osteoclastos, produce grandes cantidades de osteoclastos puros, que se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores. Este protocolo proporciona dos métodos alternativos de osteoclastogénesis, ya sea utilizando el ligando RANKL o TNF alfa.Además de eso, este método proporciona información sobre el efecto del anticuerpo Anti-c-fms en la osteoclastogénesis. La demostración visual de este procedimiento familiariza al investigador con el proceso de disección y obtención de células de médula ósea en grandes cantidades. Para comenzar a llenar una placa que servirá como un contenedor de recogida con aproximadamente 50 mililitros de MEM alfa, dependiendo del tamaño del recipiente, y colocarlo en hielo.Utilice alfileres para perforar a través de las palmas y los pies de un ratón eutanizado para fijarlo en posición supina, y rocíe a fondo con 70% de etanol. Usa tijeras y pinzas quirúrgicas estériles para hacer una incisión cutánea a nivel de la cadera y extenderla hasta los pies, exponiendo los músculos. Localice y corte el tendón que une el músculo del cuádriceps.Pelar el músculo y cortarlo a la altura de la cadera. A continuación, localice el tendón que une el músculo isquiotibial al hueso. Pelar los músculos que exponen el hueso, y liberar el isquiotibial de su apego, asegurándose de no cortar en el hueso.Coloque las tijeras entre la cabeza del fémur y el espacio de la articulación. Cortar en él liberando el fémur, pero manteniendo el hueso intacto, lo que permitirá el desprendimiento de los huesos sin riesgo de exponer la médula ósea. Corta los músculos unidos a la tibia de una manera similar.A continuación, cortar la tibia libre de su fijación en la articulación del tobillo, manteniendo el hueso intacto para evitar la contaminación. Utilice las cuchillas de tijera y las toallitas de laboratorio para raspar cualquier tejido blando restante del fémur y la tibia y colocarlos en la placa preparada con meM alfa colocado en el hielo. La disección debe llevarse a cabo cuidadosamente para minimizar la contaminación.Es por eso que la eliminación exhaustiva de tejidos blandos y la localización ósea son cruciales. Llene una jeringa de aguja de calibre 30 con MEM alfa. Desconecta la tibia y el fémur lejos de la articulación de la rodilla, y corta los extremos del hueso largo de ambos lados usando tijeras.Use pinzas para sujetar el hueso del eje. Inserte la aguja en el espacio de la médula hasta el hueso y enjuague lentamente el contenido de la médula en un plato de cultivo de seis centímetros y repita para todos los huesos. El hueso se volverá blanco, lo que indica la extracción de todo el contenido de médula ósea.Utilice un colador de células de nylon de 40 micrómetros para colar el extracto de médula ósea en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.Para lavar, agregue cinco mililitros de MEM alfa al pellet. Pipetear las células para separarlas, centrífuirlas y repetir el lavado un total de dos veces. Después de contar estas células aisladas, como se describe en el manuscrito, siembra 10 millones de células por cada 10 mililitros, en un plato de cultivo de 10 centímetros, y agrega M-CSF a las células.Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante tres días. Retire el medio después de tres días, y lave las células dos veces vigorosamente con 10 mililitros de PBS para eliminar las células no adherentes. Añadir cinco mililitros de temperatura ambiente 0.02%trypsin-EDTA y PBS, e incubar a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono durante cinco minutos.Pipetear a fondo las células para separarlas. Observe el cultivo bajo un microscopio para asegurarse de que las células se han desprendido y aparecen redondeadas y flotantes en los medios. Cuando las células se hayan desprendido, inactivar la reacción añadiendo cinco mililitros del MEM alfa.Recoger las células en un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, lavar con cinco mililitros de MEM alfa, y centrifugar de nuevo a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de MEM alfa.Siembra 1 millón de células por cada 10 mililitros en un plato de cultivo de 10 centímetros, y añade M-CSF. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante tres días. Cosecha las células adheridas, que representan los MMM como precursores osteoclastos después de tres días, como se hizo anteriormente durante la generación de MMM.Siembra los MDM a 50.000 células por cada 200 micro litros de MEM alfa en una placa de 96 pozos por pozo. A cada pozo, añadir estímulos deseados. Y luego añadir M-CSF para una concentración final de 100 nanogramos por mililitro.Añadir anticuerpo Anti-c-fms a cada pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados, 5% dióxido de carbono durante cuatro días, mientras cambia de medio cada dos días durante cuatro días. Y luego proceder con la tinción y los ensayos, como se describe en el manuscrito.Se evaluó la formación de osteoclastos en el cultivo tratado con M-CSF y RANKL, con anticuerpos Anti-c-fms. Con 101.000 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, se observó una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control. Mientras que, con uno de cada 10 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, no hubo una disminución significativa.Luego, se evaluó la formación de osteoclastos en el cultivo alfa tratado M-CSF y TNF, con anticuerpos Anti-c-fms. Con 10, 100, 1.000 nanogramos por mililitro de anticuerpos anti-c-fms, se observó una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control, sin una disminución significativa en un nanogratro por mililitro. Y el cultivo M-CSF con 1, 10, 100 nanogramos por mililitro Anti-c-fms anticuerpo, no hubo una disminución significativa en el número de precursores osteoclastos en comparación con el control.Sin embargo, a 1.000 nanogramos por mililitro, hubo una disminución significativa en el número de precursores osteoclastos, lo que indica que se necesita una concentración de hasta 1.000 nanogramos por mililitro para inhibir significativamente la proliferación de precursores osteoclastos. Asegúrese de liberar los enlaces mientras mantiene el hueso intacto, lo que minimizará la posibilidad de contaminación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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