Name: Evaluación de la proyección de imagen de resonancia magnética de los tumores vesicales murina inducida por carcinógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Aprende a evaluar tumores vesicales en ratones mediante resonancia magnética usando el carcinógeno BBN. Este protocolo permite imaginar el tamaño y extensión del tumor con alta calidad diagnóstica y mínimo estrés para los animales.

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J. J. M. está financiado por el mérito de la administración de salud de veteranos conceder BX0033692-01. J. J. M. también es apoyado por el P. John Hanson Foundation for Cancer Research de la Universidad Robert H. Lurie integral cáncer centro de noroeste. Agradecemos el centro traslacional la proyección de imagen para proporcionar la adquisición de MRI y de procesamiento. Fuentes de financiamiento no tuvieron ningún papel por escrito del manuscrito o la decisión de enviar para su publicación.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Northwestern.
1. inducción de tumores con BBN
<ol><li>Obtener ratones C57/BL6 machos, cada uno por lo menos 6 semanas. Nota: Ratones machos desarrollan cáncer de vejiga más rápida y consistentemente de ratones femeninos14,15.</li>
	<li>Añadir N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) amina (BBN) en una dosis de 0.05% a agua potable. Guardarlo en un recipiente opaco y se dan ad libitum como agua potable a ratones16. Nota: Almacenar la solución BBN en un contenedor transparente se degradará el carcinógeno17.</li>
	<li>Cambie el agua BBN 0,05% dos veces por semana.</li>
	<li>Seguimiento de los animales mediante la inspección de signos de distrés asociado a tumores de la vejiga incluyen hematuria, firme vejiga y masas. Inspeccione los ratones dos veces por semana o de acuerdo con las pautas locales de IACUC.</li>
	<li>Esperar que los tumores entre 16 y 24 semanas de exposición18.</li>
</ol>2. configuración MRI
<ol><li>Realizar una inyección subcutánea de solución salina estéril (0,1 – 0,2 mL usando una jeringa de aguja y 1 mL de 25-27 G) 10 minutos antes de la resonancia magnética para facilitar el llenado de la vejiga.</li>
	<li>Anestesiar cada ratón con una mezcla de gas de 100% O2 y el isoflurane (2%-4% según sea necesario). Verificar un adecuado plano de anestesia por el reflejo de retirada (pellizco del dedo del pie) antes de continuar la prueba. Aplique ungüento oftálmico estéril a los animales.</li>
	<li>Transferir el ratón al imagen titular equipado con una ojiva para la administración de isoflurano inhalado (0,5% – 3%).</li>
	<li>Controlar la temperatura corporal y respiración utilizando una sonda rectal de la temperatura conectada a la computadora de registro fisiológico. Nota: La temperatura Normal del cuerpo (36-37 ° C) se mantiene mediante el recirculación circuito de agua caliente incorporado el titular Señor animal. Temperatura es medida a través de un sensor rectal y registrada en el equipo de monitoreo fisiológico con dedicado software de monitoreo fisiológico. El mismo sistema se utiliza para registrar las señales de respiración y electrocardiograma mide a través de una almohada neumática bajo la caja torácica y a través de electrodos de electrocardiograma 3 derivaciones. La señal de respiración también se utiliza para accionar adquisición de MRI y la reducción de artefactos asociados con el movimiento de la respiración.</li>
</ol>3. adquisición de imágenes de MRI
<ol><li>Utilizar una bobina de cuadratura del cuerpo para la excitación.</li>
	<li>Coloque una bobina del receptor de 4 canales en la parte inferior del abdomen del ratón está escaneando para habilitar la detección optimizada de las señales de la región de interés.</li>
	<li>Iniciar ajustes automáticos a través del software de imagen integrado para adquirir un sistema triaxial de imágenes del cuerpo entero del ratón. Sistema de imágenes de esta referencia, identificar la región de interés (en este caso, la región de la vejiga).</li>
	<li>Adquirir tres conjuntos de imágenes ortogonales en rodajas a lo largo de los planos axiales, coronales y sagitales, utilizando marcos de referencia radiológicos.</li>
	<li>Utilizar el true FISP (incluida como una de las características en el software integrado de la proyección de imagen) de la secuencia de imágenes con los siguientes parámetros de Señor: TR = 900 mseg, TE = 2 ms, FA = 70, promedios de 14. Nota: Este conjunto de parámetros permite la proyección de imagen rápida con alta calidad diagnóstico, incluyendo la ponderación T1/T2 en < 10 min por ratón.</li>
	<li>Grosor de rebanada y resolución espacial está determinada por parámetros geométricos seleccionados por el usuario a través de la interfaz gráfica de la plataforma de proyección de imagen integradora. Esto resulta en una serie de sectores a través de la vejiga entera de 0,5 mm de espesor con una resolución en el plano de 0.148 mm.</li>
</ol>4. D. Análisis de imagen
<ol><li>Identificar el conjunto de láminas de 0,5 mm de espesor y resolución en el plano de 0.148 mm que cubre la vejiga entera.</li>
	<li>Exportar a software de análisis de imagen médico seleccionando la carpeta con las imágenes correspondientes en el formato de análisis.</li>
	<li>Seleccione "vista axial representativo" en el centro de la vejiga para el análisis cuantitativo por desplazarse a través de las imágenes generadas y la identificación de un segmento en el punto medio de la vejiga, que permite la visualización de la pared de la vejiga y el lumen. Nota: El segmento del centro debe ser el elegido con el diámetro más grande.</li>
	<li>Delinear con cuidado la región de interés (ROI) manualmente trazando los límites alrededor del borde externo de la vejiga (BLAhacia fuera) y alrededor de la luz interna (BLAen) de la vejiga (vea las figuras esquemáticas y representativas en la figura 2) en la vista axial representativa seleccionada.</li>
	<li>Restar la luz interna del borde exterior para calcular la superficie de la pared de la vejiga. BLApared = BLAhacia fuera - BLAen Nota: Se espera que la superficie de una vejiga de control sin tumor sea menor que con un tumor de vejiga.</li>
</ol>5. eutanasia y disección de la vejiga
<ol><li>Después de 20 semanas de la exposición BBN, eutanasia los ratones utilizando procedimientos normalizados de acuerdo con las pautas locales de IACUC.</li>
	<li>Limpiar la zona de incisión con etanol al 70%, entonces Sujete y levante la piel de la pared abdominal con el fórceps.</li>
	<li>Hacer una incisión de línea media de la sínfisis púbica para el proceso del xiphoid.</li>
	<li>Bruscamente haga una incisión en la cavidad peritoneal sujetando con pinzas y incisión con tijeras.</li>
	<li>Identificar la vejiga, que se encuentra en el abdomen inferior de línea media.</li>
	<li>Identificar y cortar el ligamento umbilical mediano conectar la cúpula de la vejiga al ombligo y la pared abdominal.</li>
	<li>Agarre la cúpula de la vejiga con pinzas countertraction y disecar la vejiga de las estructuras, incluyendo las vesículas seminales, recto y grasa circundantes.</li>
	<li>Identificar los uréteres en la vejiga y corte con unas tijeras cerca de la vejiga.</li>
	<li>La vejiga de elevación cefálica, cortó la uretra con unas tijeras y quitar la vejiga.</li>
	<li>Inmediatamente pesar la vejiga después de lavado con PBS.</li>
</ol>6. histologic examinación del tejido de la vejiga
<ol><li>Fijar el tejido de la vejiga en 10% formalina tamponada neutra durante 36-48 h a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incrustar el tejido en bloques de parafina, cortar las diapositivas para el examen posterior y las diapositivas con hematoxilina y eosina para la examinación microscópica de la mancha como se describió anteriormente19,20.</li>
	<li>Realizar un examen microscópico de la vejiga de ratón en baja (2.5 x y 10 x) y aumentos de alto (20 x y 40 x), examen de las lesiones macroscópicas, hiperplasia, carcinoma en situ, papilomas, tumores papilares y neoplasias invasoras19 , 21.</li>
</ol>

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<li>Patel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transabdominal+micro-ultrasound+imaging+of+bladder+cancer+in+a+mouse+model%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study.</a> Urology. 75 (4), 799-804 (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Precisa proyección de imagen de modelos de tumores es necesario para la adecuada estadificación de la eutanasia y aleatorización animal antes de la iniciación del tratamiento experimental. Utilizando el procedimiento presentado aquí, demostramos metodología para (1) generar tumores de la vejiga usando el carcinógeno BBN y (2) estratificar la carga tumoral de vejiga mediante el uso de derivados de MR. Señor un área medida (BLApared) se correlaciona significativamente con ex vivo el peso de la vejiga y ...

Cáncer de vejiga es el cáncer más común en quinto lugar general, responsable de aproximadamente 80.000 nuevos casos y 16.000 muertes en los Estados Unidos en 20171. Luego de 30 años sin avances significativos en el tratamiento sistémico del cáncer de vejiga2, reciente control anti-PD-1 y anti-PD-L1 inhibidor ensayos han demostrado respuestas interesantes y durables de vez en cuando en pacientes con avanzado uroteliales carcinoma3,4,5. Sin embargo, sólo aproximadamente el 20% de los pacientes muestran una respuesta objetiva a estos tratamientos, y se necesitan más estudios para ampliar el uso efectivo de la inmunoterapia en pacientes con cáncer de vejiga.
Modelos de cáncer vesical murino son críticos en la evaluación preclínica de nuevos tratamientos6,7. Para controlar el tamaño del tumor cuando se asignaron al azar a ratones con diferentes tratamientos, carga tumoral debe ser evaluado y controlado entre grupos de tratamiento. Estudios previos han usado ultrasonido o bioluminiscencia para evaluar orthotopic celular basada en línea de vejiga cáncer modelos8,9,10,11. Sin embargo, ambas técnicas presentan varias desventajas. Las medidas de ultrasonido pueden ser influenciadas por las habilidades del operador y carecen de características tridimensionales y alta resolución espacial. Bioluminescence métodos sólo pueden proporcionar una evaluación semi-cuantitativa de las células tumorales y no permiten la visualización de la morfología y anatomía de la vejiga. Además, bioluminiscencia puede ser utilizado con modelos basados en la línea de celulares, que expresan genes bioluminiscentes en ratones sin pelo o ratones con batas blancas.
La proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), por el contrario, ofrece una flexibilidad única en la adquisición de imágenes de alta resolución anatómicas, exhibiendo una amplia gama de contraste de tejido que permite la visualización precisa y evaluación cuantitativa de la carga tumoral sin la necesidad de expresar propiedades bioluminiscentes. Imágenes son más fácilmente reproducibles con las tuberías de análisis apropiado y garantizan la visualización 3-d de la vejiga. Las mayores limitaciones de la RMN son la longitud de tiempo necesario para un examen y asociados altos costos que limitan el análisis de alto rendimiento. Sin embargo, varios estudios han demostrado que el Señor secuencias pueden proporcionar imágenes diagnósticas de alta calidad que pueden utilizarse para detectar con eficacia y seguimiento de tumores de vejiga basado en la línea de la célula; así, se puede utilizar para análisis de alto rendimiento9,12.
Aquí, describimos un método no invasivo basado en el Señor para confiablemente y eficientemente caracterizar los tumores de vejiga inducida por carcinógenos en ratones. Para lograr esto, utilizamos una proyección de imagen rápida con estado estacionario precesión Señor técnica (true FISP), garantizando sesiones breves análisis sin dejar de ofrecer alta calidad y alta resolución espacial (~ 100 micras) para la detección y medición de la vejiga tumores13. Además, para confirmar la exactitud de este análisis no invasivo de MRI, se describe la correlación entre parámetros derivados del MRI y ex vivo el peso de la vejiga así como estadio tumoral patológico confirmado.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Ratones</td></tr><tr><td>N-butil-N-(4-hidroxibutil)nitrosamina carcinógeno (BBN)</td><td>TCI American</td><td>B0938</td><td>Carcinógeno</td></tr><tr><td>0.9% solución salina normal</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-488-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal HealthCare</td><td>60307-120-25</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>7Tesla ClinScan MRI</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>Dedicado a Imágenes de Pequeños Animales MRI</td></tr><tr><td>Syngo</td><td>Siemens</td><td>NA</td><td>MR Software de Imágenes Integradas</td></tr><tr><td>Modelo 1030 Monitoreo & Sistema de compuerta</td><td>Small Animal Instruments, Inc. (SAII)</td><td>NA</td><td>Monitoreo fisiológico de animales pequeños</td></tr><tr><td>Formalina, tamponado neutro,</td> <td>fijador</td><td>de HT501128</td> 10%<td>Sigma</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1093844</td><td>Agente de tinción histológica</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245651</td><td>Agente de tinción histológica</td></tr><tr><td>Jim7</td><td>Xinapse Systems</td><td>NA</td><td>Software de análisis de imágenes médicas</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v7.04</td><td>Graphpad</td><td>NA</td><td>Software de graficación</td></tr><tr><td>R v3.4.2</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>Software estadístico</td></tr><tr><td>Paquete R pROC v1.10.0.</td><td>El proyecto R para la computación estadística</td><td>NA</td><td>Análisis ROC</td></tr></tbody></table>

evaluación de la proyección de imagen de resonancia magnética de los tumores vesicales murina inducida por carcinógenos

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Modelos de tumor vesical murino son críticos para la evaluación de nuevas opciones terapéuticas. Los tumores de vejiga inducidos con el carcinógeno nitrosaminas (BBN) de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) son ventajosos sobre los modelos basados en la línea celular porque replican muy de cerca los perfiles genómicos de tumores humanos, y, a diferencia de modelos celulares y xenoinjertos, proporcionan un buena oportunidad para el estudio de las inmunoterapias. Sin embargo, la generación del tumor de vejiga es heterogénea; por lo tanto, es necesaria una evaluación precisa de la carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental. Se describe aquí es un modelo de ratón BBN y protocolo para evaluar la vejiga cáncer tumor carga en vivo mediante una secuencia rápida y fiable de resonancia magnética (Sr.) (true FISP). Este método es simple y confiable porque, a diferencia del ultrasonido, Señor es independiente del operador y permite el tratamiento de la imagen después de la adquisición directa y la revisión. Utilizando las imágenes axiales de la vejiga, análisis de regiones de interés a lo largo de la pared vesical y tumor permiten el cálculo de área de pared y el tumor de vejiga. Esta medida se correlaciona con ex vivo el peso de la vejiga (rs= 0,37, p = 0,009) y etapa del tumor (p = 0.0003). En conclusión, BBN genera tumores heterogéneos que son ideales para la evaluación de las inmunoterapias, y MRI puede rápida y confiablemente evaluar carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental.

Utilizando el protocolo descrito (figura 1), los tumores de vejiga fueron inducidos en ratones machos C57/B6. MRI fue realizado en 16 semanas, y los ratones fueron sacrificados a las 20 semanas. Se registraron ex vivo vejiga pesos (BW) para cada ratón. Diapositivas se tiñeron con hematoxilina y eosina, todas las diapositivas de histología se revisaron y etapa del tumor.
Para analizar la car...

Los tumores de vejiga murino son inducidos con el carcinógeno nitrosaminas de N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generación de tumor de vejiga es heterogénea; por lo tanto, es necesaria una evaluación precisa de la carga tumoral antes de la aleatorización al tratamiento experimental. Aquí presentamos un protocolo MRI rápido y confiable para evaluar el escenario y tamaño del tumor.

Evaluación de la proyección de imagen de resonancia magnética de los tumores vesicales murina inducida por carcinógenos

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Esta metodología se puede utilizar para generar reproductores de tumores de vejiga utilizando el carcinógeno de LA BBN y para obtener imágenes del tamaño y la extensión de la carga del tumor de la vejiga a través de la RMN. Esta técnica utiliza un enfoque de imagen rápida independiente del operador con tiempos de adquisición cortos con una alta calidad de diagnóstico para llevar a cabo ensayos de alto rendimiento de ratones en etapas intermedias del desarrollo tumoral. Para inducir la formación de tumores de cáncer de vejiga, agregue 0.05%BBN a un recipiente de agua potable opaco y proporcione el agua a 6 semanas de edad C57 negro seis ratones ad libitum.Luego monitoree a los animales dos veces a la semana en busca de signos de angustia asociados con tumores de vejiga de acuerdo con las pautas locales de la CIAIC. 16 a 24 semanas después de la exposición, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 25 a 27 con 100 a 200 microlitros de solución salina estéril e inyecte la solución salina por vía subcutánea en un animal tratado con BBN. Después de 10 minutos, transfiera el ratón al soporte de imagen de una imagen de resonancia magnética e inserte una sonda de temperatura rectal conectada a la computadora de grabación fisiológica para monitorear la temperatura corporal del animal.A continuación, coloque una bobina receptora de cuadratura de 4 canales sobre la parte inferior del abdomen del ratón e inicie ajustes automáticos en el software de imágenes integrado para adquirir un conjunto triaxial de imágenes de todo el cuerpo del ratón. A partir de este conjunto de imágenes de referencia, identifique la región de interés y adquiera tres conjuntos de imágenes en rodajas ortogonales a lo largo de los planos axial, coronal y sagital. Usando la verdadera imagen rápida con secuencia de imágenes de progresión de estado estable, establezca el TR en 900 milisegundos, el TE en dos milisegundos y la FA en 70, 14 promedios.A continuación, seleccione los parámetros geométricos adecuados dentro del software de la plataforma de imágenes para obtener una serie de rebanadas a través de toda la vejiga de 0,5 mililitros de espesor y una resolución en plano de 0,148 milímetros. Una vez obtenidas todas las imágenes, exporte el conjunto de rebanadas que cubren toda la vejiga a un programa de software de análisis de imágenes médicas adecuado y desplácese por las imágenes generadas para localizar una rebanada en el punto medio de la vejiga que permite la visualización de la pared de la vejiga y el lumen para seleccionar la vista axial representativa en el centro de la vejiga para el análisis cuantitativo. A continuación, trace los límites alrededor del borde exterior y el lumen interno de la vejiga para delinear cuidadosamente la región de interés dentro de la vista axial representativa seleccionada y restar el lumen interno del borde exterior para calcular el área de superficie de la pared de la vejiga.20 semanas después de la exposición a BBN, limpie el área de incisión con 70% de etanol y use fórceps para levantar la piel de la pared abdominal. Haga una incisión de línea media desde la sínfisis púbica hasta el proceso de xifoide y agarre el peritoneo para permitir una incisión aguda de la cavidad peritoneal. Identifique la vejiga en la mitad del abdomen inferior de la línea media, utilizando fórceps para agarrar la cúpula de la vejiga.Disecciona la vejiga lejos de las estructuras circundantes, incluidas las vesículas seminales, el recto y la grasa. Corte el ligamento umbilical medio que conecta la cúpula de la vejiga con el umbilicus y la pared abdominal. Cortar los uréteres cerca de la vejiga y levantar la vejiga cefalada, cortar la uretra para extraer la vejiga.Luego enjuague la vejiga extirpada con PBS e inmediatamente pese el tejido en un equilibrio. Aquí, se muestran imágenes rápidas verdaderas representativas con imágenes de resonancia magnética de progresión en estado estacionario de reconstrucciones tridimensionales de la pared de la vejiga e imágenes patológicas de un ratón con un tumor grande y de un ratón de control sin tumor. El grosor de la pared de la vejiga, tal como se deriva de la resonancia magnética, se correlaciona semanalmente con las mediciones de peso de la vejiga obtenidas ex-vivo.El examen del grosor de la pared de la vejiga derivado de la RMN y los datos de peso de vejiga obtenidos ex-vivo también demuestran una asociación con la etapa tumoral, así como una asociación al estratificar la patología por cáncer de vejiga invasivo no muscular y cáncer de vejiga invasivo muscular. Tenga en cuenta que lo mejor es adquirir las imágenes en ratones cuando tienen la vejiga llena. Después de la rmn de rmenes de los tumores de vejiga, los ratones se pueden dividir en cohortes con características tumorales similares, según corresponda.Esta técnica permite a los investigadores explorar nuevas inmunoterapias y otros tratamientos para mejorar los resultados para nuestros pacientes. Es importante recordar que el BBN es un carcinógeno y que siempre se debe tomar la precaución adecuada al manipular este compuesto.

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