Name: Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a construir y usar un fotobiorreactor de columna de burbuja para cultivar microalgas verdes. Este método económico permite analizar lípidos neutros y tasas de crecimiento en bioenergía.

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Apoyo para esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional de alimentos de USDA y agricultura Portilla proyecto ALA0HIGGINS y las oficinas de la Universidad de Auburn de preboste, el Vicepresidente para la investigación y la escuela de ingeniería de Samuel Ginn. También fue apoyado por la NSF concede CBET-1438211.

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<li>Higgins, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal-bacterial+synergy+in+treatment+of+winery+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clean+Water%22%5BJournal%5D)">Algal-bacterial synergy in treatment of winery wastewater.</a> Nature Clean Water. 1 (6), (2017).</li>
<li>Higgins, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+thiamine+metabolites+and+spent+medium+from+Chlorella+sorokiniana+on+metabolism+in+the+green+algae+Auxenochlorella+prototheciodes%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of thiamine metabolites and spent medium from Chlorella sorokiniana on metabolism in the green algae Auxenochlorella prototheciodes.</a> Algal Research. 33, 197-208 (2018).</li>
<li>Lépinay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+insight+on+interactions+between+bacteria+and+the+marine+diatom+Haslea+ostrearia%3A+Algal+growth+and+metabolomic+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">First insight on interactions between bacteria and the marine diatom Haslea ostrearia: Algal growth and metabolomic fingerprinting.</a> Algal Research. 31, 395-405 (2018).</li>
<li>Franchino, M., Comino, E., Bona, F., Riggio, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+three+microalgae+strains+and+nutrient+removal+from+an+agro-zootechnical+digestate%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Growth of three microalgae strains and nutrient removal from an agro-zootechnical digestate.</a> Chemosphere. 92 (6), 738-744 (2013).</li>
<li>Choix, F. J., Lopez-Cisneros, C. G., Mendez-Acosta, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azospirillum+brasilense+Increases+CO2+Fixation+on+Microalgae+Scenedesmus+obliquus%2C+Chlorella+vulgaris%2C+and+Chlamydomonas+reinhardtii+Cultured+on+High+CO2+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Azospirillum brasilense Increases CO2 Fixation on Microalgae Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris, and Chlamydomonas reinhardtii Cultured on High CO2 Concentrations.</a> Microbial Ecology. 76 (2), 430-442 (2018).</li>
<li>Higgins, B., VanderGheynst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Escherichia+coli+on+mixotrophic+growth+of+Chlorella+minutissima+and+production+of+biofuel+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Escherichia coli on mixotrophic growth of Chlorella minutissima and production of biofuel precursors.</a> PLoS One. 9 (5), e96807(2014).</li>
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<li>de-Bashan, L. E., Trejo, A., Huss, V. A. R., Hernandez, J. -P., Bashan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorella+sorokiniana+UTEX+2805%2C+a+heat+and+intense%2C+sunlight-tolerant+microalga+with+potential+for+removing+ammonium+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Chlorella sorokiniana UTEX 2805, a heat and intense, sunlight-tolerant microalga with potential for removing ammonium from wastewater.</a> Bioresource Technology. 99 (11), 4980-4989 (2008).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La consideración más importante al cultivo de algas es un entendimiento de las necesidades específicas del organismo o grupo de organismos. Las algas en el sistema de cultivo aquí descrito puede utilizarse para una amplia gama de las algas pero los específicos factores abióticos (temperatura, media, pH, intensidad de luz, nivel de CO2 , tasa de aireación) de la cultura deben ajustarse a las necesidades del organismo. Tenga en cuenta los parámetros aquí descritos fueron utilizados para el cultivo de Chlorel...

El uso de microalgas en ingeniería y biotecnología ha atraído gran interés en los últimos años. Microalgas se están estudiando para el uso en aguas residuales tratamiento1,2,3,4, biocombustibles producción5,6,7,8y el producción de nutracéuticos y otros productos de alto valor9,10. Las algas también se están modificando genéticamente a mayores tasas en un esfuerzo por mejorar su idoneidad para aplicaciones ingeniería específica11,12 En consecuencia, hay gran interés en la experimentación con organismos industrialmente relevantes en entornos controlados. El propósito de este método es para comunicar un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en un entorno de laboratorio controlado y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. Mejorar el crecimiento de las tasas y el contenido de lípido neutral de microalgas han sido identificados como dos cuellos de botella claves hacia la comercialización de biocombustibles de algas13.
Una amplia gama de enfoques se han utilizado a las algas de la cultura para los propósitos experimentales. En general, estos enfoques se pueden dividir entre cultivo al aire libre a gran escala y pequeña escala cultivo interior. Cultivo al aire libre en estanques abiertos y en fotobiorreactores es apropiado para la experimentación a la intensificación de procesos que ya han sido probados a escala de laboratorio (por ejemplo, para probar a escala de una nueva cepa de alta de lípidos de algas)14. Sin embargo, el cultivo en pequeña escala interior es apropiado al desarrollo de cepas de algas nuevos o mejorados o realizar experimentos dirigidos a comprender los mecanismos biológicos. En estos últimos casos, es necesaria un alto grado de control experimental para provocar cambios sutiles en el comportamiento biológico. Para ello, cultivos axénicos a menudo se requieren para reducir al mínimo los complejos factores bióticos asociados con otros organismos (e.g. bacterias, otras algas) que inevitablemente crecen en sistemas al aire libre a gran escala. Incluso al estudiar las interacciones entre algas y otros organismos, hemos encontrado que el uso de condiciones experimentales altamente controladas es útil al examinar el intercambio molecular entre los organismos15,16,17.
Dentro de la categoría de cultivo de algas interiores en pequeña escala, se han utilizado una variedad de enfoques. Quizás el método más común es crecer algas en matraces de Erlenmeyer sobre una mesa coctelera debajo de un banco de luz18,19. Intercambio de oxígeno y CO2 lleva a cabo por difusión pasiva a través de un tapón de espuma en la parte superior del frasco. Algunos investigadores han mejorado este montaje una aireación activa de los matraces20. Otro método es cultivar algas en botellas, mezcladas por barra de agitación y aireación activa. A pesar de su sencillez, hemos encontrado que el uso de frascos y botellas a menudo conduce a resultados inconsistentes entre los distintos recipientes biológicos. Probablemente esto es debido a los efectos de la posición - posiciones reciben diferentes cantidades de luz, que también afectan las temperaturas del interior del reactor. Rotación diaria de reactores a nuevas posiciones puede ayudar pero no solucionar el problema porque ciertas etapas de crecimiento de las algas (por ejemplo, temprano exponencial) son más sensibles a efectos posicionales que otros (p. ej., fase de registro).
En el lado opuesto del espectro de la sofisticación tecnológica son fotobiorreactores comercial totalmente controlado. Estos sistemas continuamente monitorea y regula las condiciones en el reactor para optimizar el crecimiento de algas. Tienen iluminación programable, control de temperatura en tiempo real y control del pH. Por desgracia, son caros y por lo general cuestan varios miles de dólares por el reactor. Más revistas científicas y de ingeniería requieren replicación biológica de resultados, lo que requeriría la compra de varios Biorreactores. Aquí os presentamos un sistema de reactor de columna de burbujas que une la brecha entre el simple (matraz) y sofisticado (biorreactor totalmente controlado) se acerca para el cultivo de algas de escala de laboratorio. Columnas de burbujas utilizan burbujas de gas de levantamiento para facilitar el intercambio de gases y mezcla del reactor. Este enfoque proporciona cierto grado de control sobre la iluminación y la temperatura pero lo hace de una manera rentable. Por otra parte, hemos encontrado este sistema para producir resultados muy consistentes entre los distintos recipientes biológicos, reduciendo el número de repeticiones biológicos necesarios para obtener resultados estadísticamente significativos en comparación con el método de frasco o botella. También hemos utilizado este sistema para cultivar con éxito mezclas de algas y bacterias21. Además de cultivo de algas, describiremos un procedimiento para medir el contenido de lípidos neutros en las algas cultivadas. Este último método ha sido publicado en otro lugar22, pero incluimos aquí el procedimiento para proporcionar instrucciones paso a paso sobre cómo utilizar con éxito.

<table><tbody><tr><td>Suministros para la instalación de fotobiorreactores de transporte aéreo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L Botellas de Pyrex</td><td>Corning</td><td>16157-191</td><td>Para reactores de botella, humidificadores</td></tr><tr><td>Abrazadera de manguera de 1/2"</td><td>Home Depot</td><td>UC953A</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>1/4" luer hembra a lengüeta</td><td>Nordson biomédico Nordson</td><td>FTLL360-6005</td><td>1/4" ID, PP</td></tr><tr><td>Tubo de PVC autoclavable de 1/4" de diámetro interior, 3/8" de diámetro</td><td>exterior Thermo-Nalgene</td><td>63013-244</td><td>50'1</td></tr><tr><td>/4" en juntas tóricas</td><td>Grainger</td><td>1REC5</td><td>#010 Junta tórica de silicona de dureza media, 0,239" de diámetro interior, 0,379" de diámetro exterior</td></tr><tr><td>1/8" Luer a lengüeta hembra</td><td>Nordson biomedical</td><td>FTLL230-6005</td><td></td></tr><tr><td>1/8" ID, 1/4" OD Tubo de PVC esterilizable en autoclave</td><td>Thermo-Nalgene</td><td>63013-608</td><td>250'1</td></tr><tr><td>/8" macho giratorio luer a lengüeta</td><td>Nordson biomedical</td><td>MLRL013-6005</td><td></td></tr> 1<tr><td>/8" lengüeta multipuerto</td><td>Nordson biomedical</td><td>4PLL230-6005</td><td>1/8" lengüeta</td></tr> <tr>multipuerto<td>1/8" NPT a lengüeta</td><td>Nordson biomedical</td><td>18230-6005</td><td>1/8" 200 series lengüeta</td></tr> 1<tr><td>/8" montaje en panel luer</td><td>Nordson biomedical Nordson</td><td>MLRLB230-6005 1</td><td>/8", PP</td></tr><tr><td>10 galones pecera</td> Walmart <td></td><td></td><td>802262 Puede contener hasta 8 biorreactores dependiendo del diseño</td></tr><tr><td>Medidor de flujo de 100-1000 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-13-SSV</td><td>Para reactores de botella</td></tr><tr><td>de 2 pies banco de luz fluorescente</td><td>Agrobrite</td><td>FLT24 T5</td><td></td></tr><tr><td>200-2500 ccm caudalímetro</td><td>Dwyer</td><td>RMA-14-SSV</td><td>Para la regulación del aire aguas arriba del humidificador</td></tr><tr><td>250 mL Botellas Pyrex</td><td>Corning</td><td>16157-136</td><td>Para la mezcla de gases después del humidificador</td></tr><tr><td>Caudalímetro de 50-500 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-12-SSV</td><td>Para reactores tubulares de hibridación</td></tr><tr><td>Caudalímetro de 5-50 ccm</td><td>Dwyer</td><td>RMA-151-SSV</td><td>Para el control del caudal de CO2 Filtros</td>de</tr><tr><td>aire 0.2 y micro; m</td><td>Whatman/ Fisher</td><td>09-745-1A</td><td>Polyvent, 28 mm, 0,2 y micro; m, PTFE, paquete de 50</td></tr><tr><td>válvulas de retención</td><td>VWR</td><td>89094-714</td><td></td></tr><tr><td>Tapas Corning para botellas de pyrex</td><td>VWR</td><td>89000-233</td><td>10 tapas GL45</td></tr><tr><td>Tapón luer hembra</td><td>Nordson biomedical Nordson</td><td>FTLLP-6005</td><td>Tubo</td></tr><tr>de<td>hibridación</td> PP estable hembra <td>Corning</td><td>32645-030</td><td>35x300 mm, paquete de 2</td></tr><tr><td>Temporizador de luz</td><td>Walmart</td><td>556393626</td><td></td></tr><tr><td>Tuercas de seguridad</td><td>Nordson biomedical Nordson</td><td>LNS-3</td><td>1/4", nylon rojo</td></tr><tr><td>Agitador magnético de perfil bajo</td><td>VWR</td><td>10153-690</td><td>Agitador magnético de perfil bajo</td></tr><tr><td>Tapa de luer macho</td><td>Nordson biomedical Nordson</td><td>LP4-6005</td><td>Tapón macho PP</td></tr><tr><td>Anillo de bloqueo Luer giratorio</td><td>Nordson biomedical Nordson FSLLR-6005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barras de agitación -</td><td>largas VWR</td><td>58949-040</td><td>38,1 mm, para reactores de botella</td></tr><tr><td>Barras de agitación - medianas</td><td>VWR</td><td>58949-034</td><td>25 mm, para tubos de hidridación</td></tr><tr><td><fuerte>Suministros y reactivos para el cultivo de algas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 y micro; m filtros</td><td>VWR</td><td>28145-491</td><td>13 mm, PTFE, para filtrar medios gastados de muestreo diario de cultivo</td></tr><tr><td>jeringas de 1 mL</td><td>Air-tite</td><td>89215-216</td><td>Para filtrar medios gastados de muestreo diario de cultivo</td></tr> tubos de <tr><td>1,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Estériles (o equivalentes)</td></tr><tr><td>10 mL Pipetas serológicas</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-482</td><td>Estériles (o equivalentes)</td></tr><tr><td>100 mm placas</td><td>VWR</td><td>25384-342 placas de</td><td>Petri apilables de 100x15 mm, estériles</td></tr><tr><td>tubos de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-276</td><td>Estéril (o equivalente), polipropileno</td></tr><tr><td>2 mL Puntas de pipeta serológicas</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-584</td><td>Estériles (o equivalentes)</td></tr><tr><td>Tubos de 2 mL</td><td>VWR</td><td>87003-298</td><td>Tubos estériles (o equivalentes)</td></tr><tr><td>de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-348</td><td>Polipropileno estéril (o equivalente)</td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89089-578</td><td>Poliestireno con tapa, fondo plano</td></tr><tr><td>Asas de inocculación</td><td>VWR</td><td>80094-478</td><td>Estéril (o equivalente)</td></tr><tr><td>Tanque y regulador de dióxido de carbono líquido</td><td>Airgas</td><td>CD-50</td><td></td></tr><tr><td>Suministros y reactivos para la extracción de lípidos y el ensayo de lípidos neutros</ Tubos ></td><td></td><td></td><td></td></tr> perlas fuertes <tr>de <td>2 ml</td><td>VWR</td><td>10158-556 Tubo de</td><td>polipropileno con tapa</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-774</td><td>Polipropileno, fondo plano</td></tr><tr><td>Lejía Walmart</td><td></td><td>550646751</td><td>Solo use lejía regular, no lejía de limpieza</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>BDH</td><td>BDH1109-4LG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>BDH</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>Rojo Nilo</td><td>VWR</td><td>TCN0659-5G</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>BDH</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aceite vegetal</td><td>Walmart</td><td>9276383</td><td>Cualquier aceite vegetal debe funcionar siempre que sea fresco</td></tr><tr><td>Perlas de circonio/sílice (0,5 mm de diámetro)</td><td>Productos Biospec</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Mettler-Toledo</td><td>XS205DU</td><td>Capaz de una precisión de al menos 4 decimales</td></tr><tr><td>Homogeneizador de perlas</td><td>Omni</td><td>19-040E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Thermo</td><td>Heraeus Fresco 21 con rotor 24x2</td><td>Incluye capaz de manejar tubos de 1,5 y 2 mL</td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco</td><td>VWR</td><td>75838-282</td><td>Incluye bloque seco para una microplaca</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7670520</td><td>Sistema de liofilización de 2,5 L</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa grande</td><td>Thermo</td><td>Heraeus Megafuge 16R Tissue</td><td>Incluye rotores capaces de manejar botellas de 400 mL, tubos de 50 mL y tubos de 15 mL Lector de</td></tr><tr><td>microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2</td><td>Capaz de leer absorbancia y fluorescencia</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

Hay gran interés en el estudio de las microalgas para aplicaciones de ingeniería tales como la producción de biocombustibles, productos de alto valor y para el tratamiento de residuos. Medida más nuevos esfuerzos de investigación a escala de laboratorio, hay una necesidad de métodos rentables para el cultivo de microalgas de forma reproducible. Aquí, nos comunicamos un enfoque efectivo para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores de escala de laboratorio y para medir el crecimiento y contenido de lípido neutral de algas. También se incluyen instrucciones sobre cómo configurar el sistema de fotobiorreactor. Aunque los organismos ejemplo son especies de Chlorella y Auxenochlorella, se puede adaptar este sistema para cultivar una amplia gama de microalgas, incluyendo co-cultivos de algas con las especies de algas no. Culturas comunes se cultivan primero en botellas para producir inóculo para el sistema del fotobiorreactor. Inóculo de algas se concentra y transferido a fotobiorreactores para el cultivo en lotes. Las muestras se recogen diariamente de las lecturas de densidad óptica. Al final de la cultura de la hornada, las células se cosechan por centrífuga, lavado y liofilizado para obtener una concentración de peso seco final. La concentración de peso seco final se utiliza para crear una correlación entre la densidad óptica y la concentración de peso seco. Un método modificado de Folch se utiliza posteriormente para extraer los lípidos totales de la biomasa liofilizada y el extracto es analizado por su contenido de lípido neutral usando un análisis de la microplaca. Este ensayo ha sido publicado anteriormente pero pasos de protocolo se incluyeron aquí para destacar los pasos críticos en el procedimiento donde se producen frecuentemente errores. El sistema de biorreactor descrito aquí llena un nicho entre cultivo frasco simple y biorreactores comerciales totalmente controlado. Incluso con sólo 3-4 biológicos repeticiones por tratamiento, nuestro acercamiento al cultivo de algas conduce a desviaciones de estándar ajustadas en los ensayos de crecimiento y de los lípidos.

Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de algas densidad óptica OD 550 nm (Figura 4A). La densidad óptica y peso seco de concentración pueden ser datos correlacionados (Figura 4B). Esto se logra mediante el primer cálculo de la concentración de algas de peso seco final después del paso de liofilización. A continuación, puede correlacionarse la densidad óptica de la dilución serial de cultura (realizado en el últim...

Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Este protocolo proporciona instrucciones para la construcción y el uso de un sistema de fotobiorreactor de columna de burbujas para cultivar microalgas, y debe ser de interés para cualquier persona que estudie biocombustibles de algel, tratamiento de aguas residuales o biología de algel. Hemos encontrado el sistema de reactores spire para producir resultados de alta reputación. El sistema de reactores también es personalizable a una amplia gama de algas y cuesta mucho menos que muchas ofertas comerciales.Demostrando el procedimiento estará Qichen Wang, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar la configuración de los fotobiorreactores de columna de burbujas, construya un conjunto de tapas ventiladas a partir de las tapas de plástico de las botellas de vidrio de un litro y tubos de hibridación como se describe en el protocolo de texto. Deslice un anillo O de 1/4 de pulgada sobre las bandas de rodadura de un accesorio de señuelo de montaje en panel de 1/8 de pulgada, y deslícelo en el orificio de 1/4 pulgada perforado en la tapa.Deslice un segundo 1/4 de pulgada sobre los hilos para que la tapa se emparete entre los dos anillos O. A continuación, deslice una tuerca de fijación sobre los hilos y apriétela para fijar el señuelo de montaje del panel en su lugar. Ahora encaje para fijar los anillos en el señuelo masculino expuesto, proyectando desde la tapa.Repita este procedimiento para cada orificio de la tapa. Para las tapas que se utilizarán en la columna de burbujas y los reactores de botella, conecte el señuelo hembra de 1/8 de pulgada a los accesorios de púas a 1 piezas de 1/2 pulgada de tubo de PVC ID de 1/8 de pulgada. Fije estos a cada uno de los accesorios de señuelo macho expuestos en la tapa.Conecte una válvula de retención al extremo libre de una de las piezas de 1/8 de pulgada. A continuación, conecte un señuelo macho a la colocación de la púa a la segunda pieza de tubo de 1/8 de pulgada que se proyecta desde la tapa. Haga clic en el anillo de bloqueo giratorio en su lugar y fije un filtro de aire de 0,2 micras a esto.Ensamblaje Compleat del sistema de entrega de aire, tanques de pescado, placas de agitación, y las luces como descried el protocolo de texto. Concentrar el stock de microalgas asentadas retirando el sobrenadante utilizando una bomba de vacío. Deje menos de 100 mililitros de medio en cada botella, pero evite eliminar las algas asentadas.Suspenda y transfiera la lodo de algas a tubos estériles de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar 1.000 veces G durante cinco minutos para concentrar aún más las algas. En el gabinete de bioseguridad, retire suficiente sobrenadante para lograr un volumen total de aproximadamente 80 mililitros de concentrados de algas para 12 fotobiorreactores.Evite aspirar el pellet. Transfiera el concentrado de algas a un recipiente de esterilización. Ahora, agregue seis mililitros de lodos de algas en cada fotobiorreactor con una pipeta serológica esterilizada de 10 mililitros.Gire los biorreactores para mezclar las algas en el medio. Dibuje una muestra de dos mililitros de cada biorreactor utilizando una pipeta serológica y transfiera a un tubo de dos mililitros. Recoja una muestra de dos mililitros cada 24 horas para monitorear el progreso del cultivo.Compruebe la muestra en busca de ph utilizando tiras reactivas y ajuste el reactor según sea necesario. Apriete las tapas del biorreactor y coloque todos los biorreactores en el baño de agua de la pecera. Ajuste la aireación, el dióxido de carbono y la iluminación a los niveles adecuados para la especie.Gire la posición del biorreactor cada día después del muestreo. Aplicar 200 microlitros de cada muestra de cultivo triplicado a pozos de una microplaca de 96 pozos. A continuación, mida la densidad óptica a 550 nanómetros y 680 nanómetros.Mida un volumen fijo de cultivo de algas de cada biorreactor con un cilindro de posgrado y transfiera en botellas de centrífuga. Centrifugar la cultura 4, 696 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante al aspirarlo cuidadosamente.Transfiera los pellets a tubos etiquetados de 50 mililitros. Enjuague las botellas centrífugas con agua destilada y transfiera el contenido a los tubos de 50 mililitros. Asegúrese de que el volumen total no supere los 45 mililitros.Después de lavar los pellets de algas como se describe en el protocolo de texto, deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 7,5 mililitros de agua destilada a cada tubo de 50 mililitros. Ahora, vórtice los tubos de 50 mililitros y transfiera los lodos de algas a tubos prepesados de 15 mililitros.Enjuague los tubos de 50 mililitros con agua destilada adicional y transfiera el líquido a los tubos de 15 mililitros manteniendo el volumen total en esos tubos a menos de 12 mililitros. Después de centrifugar los tubos de 15 mililitros y desechar el sobrenadante como antes, congele los tubos con pellets a menos 80 grados centígrados durante al menos 30 minutos en preparación para el secado por congelación. Añadir 1,5 mililitros de disolvente folch a cada tubo de dos mililitros que contenga 20 miligramos de algas secas congeladas.Vierta aproximadamente 0,5 mililitros de perlas de sílice de zirconia en cada tubo hasta que el nivel de líquido alcance dos mililitros. Homogeneizar las muestras de algas en un molino de cuentas durante 20 segundos a una velocidad de 6,5 metros por segundo. Transfiera los tubos a hielos durante 30 segundos para enfriar las muestras.Luego, repita cinco veces más para extraer completamente los lípidos. Filtrar el homogeneizar a través de una jeringa de cinco mililitros que contiene un disco de malla de alambre de acero inoxidable para estirar las perlas, recogiendo el filtrado en un tubo de 15 mililitros. Lavar las perlas con 1,5 mililitros de disolvente folch, empujando el líquido con el siring según sea necesario.Repita este lavado 2 veces más y recoja todo el filtrado en el tubo de 15 mililitros, produciendo un volumen final de aproximadamente seis mililitros. Añadir 1,2 mililitros de solución de cloruro de sodio al 0,9% al extracto de folch en el tubo de 15 mililitros, y vórtice para mezclar bien. Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 6.000 veces G durante cinco minutos.Registre el volumen inferior de la fase de cloroformo al 0,1 mililitro más cercano utilizando líneas en el lado del tubo de 15 mililitros. A continuación, transfiera la fase inferior a una vil de vidrio utilizando una pipeta de pasto de vidrio. Para realizar el ensayo de lípidos neutros, diluir los extractos de lípidos y el aceite vegetal estándar tres veces con metanol.Por cada comprimido, la muestra añade 80 microlitros a una microplaca de polipropileno de 96 pocótanos en cuadrúplica. Para el disolvente en blanco, aplique 80 microlitros de disolvente folch en cuadrúplica. Para las normas, agregue 10, 30, 60, 90 y 120 microlitros del estándar de aceite vegetal diluido también en cuadrúplica.Coloque la microplaca en la campana de humos en un calentador de bloque seco precalentado a 55 grados Celsius durante 20 a 30 minutos hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Retire la microplaca del bloque de calefacción y déjela enfriar a temperatura ambiente. Luego, agregue 30 microlitros de alcohol isopropílico a cada pozo y mezcle en pipeteando arriba y abajo.Asegúrese de que todos los canales de pipeta están mezclando la solución y resuspendiendo los lípidos, produciendo un líquido verde homogéneo. Ahora, agregue 200 microlitros de un microgramo por mililitro una solución roja del nilo a cada pozo, y entumece hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, agregue 20 microlitros de 50% de solución de lejía a cada pozo, y entumegue hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar bien.Deje la placa para incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lea la florescencia en las muestras cada cinco a 10 minutos a 530 nanómetros de excitación, emisión de 575 nanómetros, con cortes automáticos establecidos en 570 nanómetros hasta que la señal de las muestras de algas se estabilice. Este procedimiento produce un curso de tiempo de datos de densidad óptica de algel a 550 nanómetros OD.Los cultivos de control se cultivaron en un nuevo anate NH4 medio. El tratamiento uno, es co-cultivos auxenochlorella protothecoides y azospirillum brasiliense cultivados en medio NH4 innato fresco. El tratamiento dos, es un A.Protothecoides azinic cultivado en medio innato NH4 complementado con 50 miligramos por mililitro IAA, que inhibió completamente el crecimiento de algas.Tratamiento tres, es azinic A.Protothecoides, cultivado en medio gastado de A.Brasilienes. Las curvas de crecimiento muestran cultivos de auxenochlorella protothecoides entran en crecimiento logarítmico tardío a las 120 horas. Aquí se muestran curvas de corelación entre la densidad óptica a 550 nanómetros y la concentración final de peso seco, utilizando un ajuste polinomio de segundo orden.Por último, la coloración se puede aplicar a los datos de densidad óptica del curso de tiempo para obtener una curva de crecimiento de peso seco. Los mismos tratamientos se utilizan aquí, excepto que la clorella sorokiniana se cultiva en lugar de auxenochlorella protothecoides. Por porcentaje de lípido neutro de peso seco obtenido en el ensayo de lípidos neutros se correlaciona bien con el contenido de glicerol de tríos en una placa de cromatografía de capa delgada correspondiente.A diferencia de A.Protothecoides, el tratamiento con IAA no inhibió el crecimiento de C.Sorkiniana. Después de la extracción de lípidos de las algas, el palet celular restante se puede analizar para su contenido de almidón y pared celular, proporcionando una imagen más detallada de los productos de almacenamiento de energía dentro de la célula. Los métodos descritos aquí han permitido nuevos descubrimientos en el campo de los biocombustibles de algel y el tratamiento de aguas residuales.Específicamente, Este sistema se ha utilizado para entender mejor cómo las bacterias influyen en el crecimiento de algel.

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Investigación

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Entorno

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