Name: Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprende a analizar el transporte retrógrado de proteínas en células HeLa usando nanobodies funcionalizados. Este método permite estudiar la dinámica de membrana y la homeostasis celular con alta especificidad.

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Este trabajo fue financiado por Grant 31003A-162643 por la Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Nicole Beuret y el Biozentrum instalación del núcleo de la proyección de imagen (IMCF) para apoyo.

Los autores no tienen nada que revelar.

Nanobodies representan una clase emergente de andamios de proteína ligante con muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales: son pequeños, estables, monoméricas, puede seleccionarse para bonos de alta afinidad y falta disulfuro33,35, 44 , 45. se utilizan en un número de aplicaciones, tales como en sistemas de cultivo de células y organismos en el desarrollo de la biología4...

Tráfico retrógrado de proteínas y lípidos de la superficie celular en varios compartimientos intracelulares es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana para contrarrestar la secreción y reciclaje de componentes de maquinarias de transporte anterograde1 , 2. después de internalización vía endocytosis clathrin-dependiente - independiente o, carga de proteína y lípidos en primer lugar rellenar temprano endosomas desde donde son más bien a lo largo del sistema endo-lisosomales, reciclado a la membrana plasmática, Redirigido o dirigidas a la red trans-Golgi (TGN). Reciclaje de endosomas y la superficie de la célula al TGN es parte del ciclo funcional de una serie de receptores de transmembrana carga anterógrada, tales como los receptores de manosa-6-fosfato catión-dependiente y la independiente del catión (CDMPR y CIMPR) entrega recién sintetizado lisosomales hidrolasas desde el TGN para fines endosomas y lisosomas3,4,5, sortilina, SorLA6,7y Wntless (WLS) transporte de ligandos Wnt a la superficie de la célula 8 , 9 , 10 , 11. otras proteínas obtenidos al TGN son TGN46 y sus isoformas relacionadas12,13,14, trampas ( N- etilmaleimida sensible fusión factor accesorio receptores solubles) 15 , 16 , precursora del amiloide (APP) de la proteína18,19, anquilosis progresiva (ANK) proteína20, 17, transportadores metálicos como ATP7A/B o DMT121,22y transmembrana procesamiento de las enzimas como la carboxipeptidasa D, furin o BACE123,24,25. Aparte de estas proteínas endógenas, toxinas bacterianas y vegetales (por ejemplo, la toxina Shiga y el cólera, ricina y abrina) secuestran maquinarias transporte retrógrado para llegar a la sala de emergencia para retrotranslocation en el citosol26,27, 28,29.
Para analizar directamente tráfico retrógrado, previamente hemos desarrollado un conjunto de herramientas basadas en nanobody etiqueta y seguir las proteínas de carga de la superficie de la célula a compartimientos intracelulares30. Nanobodies representan una nueva familia de proteínas ligantes derivados homodiméricas pesada cadena-sólo anticuerpos (hcAbs) que ocurren naturalmente en camélidos y peces cartilaginosos31,32. Constituyen el dominio variable de cadena pesada (VHH) de hcAbs y tienen muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales (por ejemplo, IgGs): son monoméricas, pequeño (~ 15 kDa), altamente soluble, desprovisto de disulfuro, puede ser bacteriano expresada y seleccionado para alta afinidad de Unión33,34,35,36. Para que nuestra herramienta nanobody versátil y ampliamente aplicables, empleamos funcionalizados anti-GFP nanobodies para etiqueta de superficie y pista proteínas etiquetadas con GFP en su dominio extracelular/lumenal. Funcionalización de nanobodies con mCherry, ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) transporte retrógrado37, o secuencias de sulfatación (TS) de tirosina de las proteínas de transmembrana carga bonafide puede ser analizado ya sea fijo y vive la proyección de imagen de la célula, por microscopia electrónica, o bioquímico. Ya que la sulfatación de la tirosina mediado por Sulfotransferasas tyrosylprotein (TPST1 y TPST2) es una modificación postraduccional restringida para el trans-Golgi/TGN, directamente podemos estudiar transporte y cinética de las proteínas de interés de la superficie celular para esto 38,compartimiento de intracelular Golgi del39,40.
En este artículo de métodos, nos describe la facilidad de producción de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry y derivados) para una serie de aplicaciones para analizar el transporte retrógrado en células de mamíferos30. Nos centramos principalmente en el uso de TS nanobody sitio modificado para el análisis del tráfico intracelular de la superficie celular del compartimiento de sulfatación.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-His6</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-actina</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>disuelto en 1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>disuelto en ácido estéril 500 mM NaH2PO4 o DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevuilnic (dALA) clorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>disuelto en agua estéril</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>disuelto en agua estéril</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td> L-glutamina <td></td></tr><tr><td></td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Azufre-35 como sulfato de sodio</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>El producto contiene 5 mCi</td></tr><tr><td>Sales equilibradas de Earle's</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM solución de aminoácidos (50x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM solución vitamínica (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>El producto es distribuido por Sigma-Aldrich, pero fabricado por Roche</td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalactopiranosida (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>disuelto en agua estéril, el stock es de 1</td></tr><tr><td>M Sal disódica de carbenicilina</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>de sulfato de kanamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>disuelto en agua estéril, el caldo es de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Azul brillante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose de alto rendimiento</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Sus columnas GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>Su kit de amortiguación</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización PD10 desechables GE</td><td>Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Geles Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) sin Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Platos de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (n.º 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>disuelto en 40% DMSO 60% isopropanol, stock en 500</td></tr><tr><td>mM Triptona</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>disuelto en agua estéril, caldo de 1 M</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>disuelto en agua estéril, caldo de 1 M</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>disuelto en agua estéril, el stock es de 5 M</td></tr></tbody></table>

análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red trans-golgi en células cultivadas de nanobodies funcionalizados

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transporte de proteínas y membranas de la superficie celular hasta el Golgi y más allá es esencial para la homeostasis, la identidad de organelas y la fisiología. Para estudiar el tráfico de proteína retrógrada, recientemente hemos desarrollado herramientas basadas en nanobody versátil para analizar el transporte de la superficie celular para el aparato de Golgi, ya sea por proyección de imagen fija y vivo de la célula, por microscopia electrónica o bioquímico. Hemos diseñado nanobodies funcionalizados anti-verde proteína fluorescente (GFP), carpetas pequeñas, monoméricas, de alta afinidad de la proteína, que puede ser aplicado a líneas celulares de expresión de proteínas de membrana de interés con una parte extracelular de la GFP. Derivatizados nanobodies a los reporteros GFP específicamente se internalizan y transportado piggyback a lo largo de vías de clasificación de los reporteros. Nanobodies fueron funcionalizados con fluoróforos transporte retrógrado por microscopía de fluorescencia y proyección de imagen, con ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) para investigar la localización ultraestructural del reportero nanobody complejos de electrónica en vivo microscopia y con motivos de tirosina sulfatación (TS) para evaluar la cinética de la llegada de trans-Golgi network (TGN). En este artículo metodológico, describiremos el procedimiento general para expresar y purificar nanobodies funcionalizados para bacteriano. Ilustramos el uso poderoso de nuestra herramienta usando los nanobodies mCherry y TS modificado para analizar endocíticas absorción y llegada del TGN de proteínas de carga.

Para investigar el transporte retrógrado de la proteína a diferentes destinos intracelulares, recientemente hemos establecido una anti-GFP nanobody-herramienta para la etiqueta y siga las proteínas recombinantes de fusión de la superficie de la célula30. Aquí, demostramos la producción bacteriana de tal derivatizada nanobodies y demostrar su aplicación al estudio de absorción endocíticas por microscopía de fluorescencia y immunoblotting, así como su uso para invest...

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Este método permite la producción y aplicación de nanosí cuerpos funcionalizados y expresados bacterianos para analizar el transporte de proteínas retrógradas desde la superficie celular hasta compartimentos intercelulares. En particular, la red Trans-Golgi. La principal ventaja de esta técnica es el uso de la sulfatación. Una modificación altamente específica, compartimentada y sensible después de la traducción para evaluar la llegada del complejo de nano-cuerpo de reportero en el compartimiento DTN. Este método en combinación con otros nano-cuerpos derivados para la exploración celular de la vida y la microscopía electrónica también se puede utilizar para estudiar los procesos endolíticos de los receptores de superficie celular relacionados con la enfermedad. Nuestro repertorio de nano-cuerpos funcionalizados ha sido diseñado para estudiar el transporte retrógrado en células cultivadas. Sin embargo, estas herramientas también se pueden aplicar en organismos multicelulares. Para comenzar este procedimiento, escoja una colonia bacteriana que contenga el vector de interés de la placa e inocular un matraz que contenga 20 mililitros de medio LB complementado con antibióticos. Incubar durante la noche a los 37 años

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video muestra un método para estudiar la absorción y el transporte retrógrado de nanocuerpos funcionalizados para comprender sus vías de tráfico intracelular. Mediante la introducción de sulfato radiomarcado y la utilización de técnicas de aislamiento y detección, este método permite el estudio de la absorción endocítica y la llegada de proteínas de carga a través de la red trans-Golgi.

Monitorización de la llegada de proteínas de superficie marcadas con GFP a la red Trans-Golgi utilizando nanocuerpos funcionalizados

El tráfico de membrana implica el transporte de proteínas desde la membrana plasmática hasta el interior de la célula (es decir, endocitosis) seguido de un tráfico a los lisosomas para su degradación o a la membrana plasmática para su reciclaje. Los métodos descritos en este artículo están diseñados para estudiar la endocitosis y el reciclaje de las proteínas de la membrana plasmática.

Los ensayos de protección de L-glutatión basados en células para estudiar la endocitosis y el reciclaje de proteínas de la membrana plasmática

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.

Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares

El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.

Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

Los endosomas de reciclaje forman parte de la red tubular endosomal. Aquí presentamos un método para cuantificar la dinámica del reciclaje de endosomas utilizando GFP-STX13 como marcador de orgánulos.

El ensayo basado en microscopía para estudiar y analizar los endosomas de reciclaje utilizando el tráfico de SNARE

El transporte endocítico y retrógrado de proteínas desde la membrana plasmática a la red trans-Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana y regular la señalización. Aquí, describimos un método para obtener imágenes y cuantificar el transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana mediante microscopía de células vivas utilizando nanocuerpos anti-GFP derivados en células HeLa.

Imágenes de células vivas del transporte endocítico utilizando nanocuerpos funcionalizados en células cultivadas

Aprende a analizar el transporte retrógrado de proteínas en células HeLa usando nanobodies funcionalizados. Este método permite estudiar la dinámica de membrana y la homeostasis celular con alta especificidad.

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados (Video) | JoVE Journal

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

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