Name: Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprende hibridación in situ en embriones de Astyanax mexicanus para visualizar expresión génica con mínimo fondo. Este protocolo simplificado facilita estudios de biología del desarrollo y neurociencia.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de bruto para comentarios de este manuscrito. Queremos reconocer a cuatro estudiantes de secundaria que utilizan este protocolo durante las pasantías de verano en 2017 y 2018, incluyendo Christine Cao, Michael Warden, Aki Li y David Nwankwo. HL fue apoyado por una beca de madre de Biología UC durante el verano de 2017. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Science Foundation (DEB-1457630 a la JBG) y el institutos nacionales de Dental e investigación craneofacial (NIH; DE025033 a la JBG).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Cincinnati (Protocolo nº 10-01-21-01).
1. fijación
<ol><li>Número deseado de Astyanax mexicanus embriones de un tanque de cría de aislar y fijar ~ 50 embriones a la vez. Si los embriones son grandes y viejos, puede ser necesario fijar 25 a la vez para asegurar incluso la fijación.</li>
	<li>Dependiendo de la edad del embrión, utilizar el método aprobado por el IACUC de anestesia. Para embriones mayores con un sistema de los nervios, sacrificar embriones por sobredosis de anestésico. Por lo tanto, coloque los embriones en una solución de ~ 1% Metanosulfonato (tamponado a pH 7.4) para minimizar el dolor y las molestias para el organismo.</li>
	<li>Una vez que los embriones son insensibles al tacto, sistema de agua que contiene Metanosulfonato y se añade ~ 1 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Retirar la solución de PBS y añadir 1 mL de 4% paraformaldehido (PFA). Fijar los embriones durante la noche a 4 ° C. PRECAUCIÓN: El PFA es peligroso (es decir, es inflamable y es una piel y pulmón irritante), manipúlelas con cuidado.</li>
</ol>2. deshidratación
<ol><li>Para deshidratar los embriones, quite la solución fijadora y enjuague con 1 mL de PBS. Coloque los frascos que contienen el embrión en un ángulo (entre 30° y 45°), en un agitador de plataforma durante el enjuague. Seguir lavar los embriones dos veces, 5 minutos por lavado.</li>
	<li>Si los embriones todavía tienen un corion, coloque todos los 50 embriones 100 mm x 25 mm placa de Petri y aislarlos cuidadosamente de las chorions con dos juegos de pinzas de relojero (p. ej., #5 pinzas) bajo un microscopio. Nota: Durante los pasos descritos a continuación y para el resto del Protocolo, retire con cuidado todo el líquido del paso anterior usando limpia, pipetas de Pasteur de vidrio antes de agregar la solución de la siguiente</li>
	<li>Deshidratar los embriones en una serie de lavados cada vez más concentradas de metanol (MeOH) se describe a continuación. Las diluciones se basan en un volumen total de 1 mL con 500 μl de solución en cada frasco de vidrio de 4 mL. Realizar todos los pasos de deshidratación a temperatura ambiente (RT) en el agitador de plataforma.<ol>
<li>Retire con cuidado la solución de PBS. Añadir una solución al 25% MeOH (250 μl de MeOH) + 750 μl de PBS. Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución al 25% MeOH. Agregar una solución de 50% MeOH (500 μl de MeOH) + 500 μl de PBS. Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución al 50% MeOH. Agregar una solución de MeOH 75% (750 μl de MeOH) + 250 μl de PBS. Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución de MeOH 75%. Añadir una 100% MeOH solución (1 mL de MeOH). Suavemente agite en una coctelera de plataforma por 5 min, repetir este paso 3 veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En este punto, almacenar embriones deshidratados, según sea necesario, en los frascos de cristal a-20 ° C (largo plazo). Por otra parte, proceder directamente a día 1 del protocolo.</li>
</ol>3. día 1: rehidratación
<ol><li>Obtener embriones deshidratados de congelador de-20 ° C (o proceden directamente de paso 2.5).</li>
	<li>Clasificar los embriones utilizando una pipeta Pasteur. Uno puede clasificar en base a morfotipo (es decir, cueva o superficie), y el número de genes evaluados en cada experimento. Hay generalmente no más de 12 embriones por frasco una vez ordenados. Para mantener la organización, utilice cinta de color lab para designar los frascos y pipetas para cada gen. Embriones se quedarán en el mismo frasco en todo el conjunto del protocolo. Nota: Lugar la punta de la pipeta Pasteur en 100% EtOH a esterilizar entre usa.</li>
	<li>Establecer un baño a 70 ° C para ser utilizado en un paso posterior. Con cuidado, extraer el MeOH en viales de embriones clasificados y reemplazar con 500 μl de nuevo 100% MeOH. Lavado brevemente (~ 1 min) en el agitador de plataforma.</li>
	<li>Rehidratar los embriones en un aumento de la concentración de 1 x PBS con Tween 20 (PBT, ver más abajo) en el agitador de plataforma. Las diluciones se basan en un volumen de dilución final de 1 mL con 500 μL en cada frasco.<ol>
<li>Añadir una solución al 25% PBT (250 μl de PBT, 750 μl de MeOH). Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución al 25% PBT. Añadir una solución al 50% PBT (500 μl de PBT, 500 μl de MeOH). Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución PBT 50%. Agregar una solución de 75% de la PBT (750 μl de PBT, 250 μl de MeOH). Sacuda suavemente en un agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución PBT de 75%. Agregar una solución PBT 100% (1 mL de PBT). Suavemente agite en una coctelera de plataforma por 5 min, repetir este paso 3 veces.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. día 1: Digestión y fijación
<ol><li>Preparar una solución de K (PK) de proteinasa añadiendo 1 μl de PK (20 mg/mL) y 2 mL de PBT.</li>
	<li>En previsión de realizar los siguientes pasos, obtener alícuotas congeladas de búferes de hibridación (Hyb - y Hyb +; ver archivo suplementario 2 y 3 de archivo suplementario) y PFA de almacenamiento-20 ° C.<ol>
<li>Permiten PFA descongelar a TA.</li>
		<li>Colocar alícuotas de Hyb - y Hyb + giratorio 70 º C baño María. Coloque todos los reactivos y los frascos dentro de una pequeña "Junta" con un fondo de malla, dentro del aparato de baño de agua flotante. Esto permite simple adición y eliminación de tubos y viales desde el baño de agua de 70 ° C rotación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suavemente Agregar solución de PK para los frascos de embriones garantizando todos los tejidos están completamente cubiertos con la solución. Digerir los embriones por ~ 12 min en solución de trabajo de PK en el agitador de plataforma. Nota: Se puede variar la longitud de la digestión por el investigador para asegurar resultados óptimos.</li>
	<li>Extraer suavemente la solución PK y brevemente de la inundación el frasco con PBT para diluir cualquier PK restantes</li>
	<li>Extraer la solución PBT y reemplazar con 500 μl de PBT nuevo. Deje que la solución de enjuague en el agitador de plataforma durante 5 minutos.</li>
	<li>Extraer PBT y reemplazar con 500 μl de descongelado 4% PFA. Permitir que los embriones destinados a incubar durante 20 minutos en el agitador de plataforma a TA.</li>
	<li>Extraer el 4% del PFA y brevemente de la inundación el frasco con PBT para diluir cualquier PFA restantes. Extraer el PBT y reemplazar con 500 μl de PBT fresco. Permite embriones enjuagar durante 5 minutos en el agitador de plataforma. Repetir este paso 4 veces más.</li>
</ol>5. día 1: Prehybridization
<ol><li>Lugar 500 μl de solución de Hyb precalentada en el frasco. Coloque con cuidado el frasco en la 70 ° C agua baño (dentro de las juntas) sin agitación, durante 5 minutos.</li>
	<li>Extraer la solución Hyb y frasco con 500 μl de precalentado Hyb + solución de inundaciones. Coloque el frasco en el baño de agua de 70 ° C con agitación (40 rpm). Incubar durante cada 4 horas o toda la noche. Nota: Un 4 h de incubación dará un protocolo completo in situ que tendrá una duración de 4 días en total. Aquí, este paso se presenta como una incubación durante la noche, que dará como resultado un protocolo de duración 5 días en total.</li>
</ol>6. día 2: hibridación
<ol><li>Colocar una alícuota de Hyb + del congelador de-20 ° C en el baño de agua caliente moviendo durante 5 minutos.</li>
	<li>Extraer el Hyb + del frasco y vuelva a colocar con 500 μl de Hyb precalentada. A esta solución, cuidadosamente añadir 2 μl de sonda de RNA a cada frasco. Agitar suavemente el frasco para asegurar una distribución uniforme de la sonda.</li>
	<li>Incubar durante una noche Hyb + (con sonda agregada) solución en el baño de agua caliente de 70 ° C y agitación a 40 rpm. Nota: Uno puede volver a utilizar solución de Hyb + (con sonda). Para esto, tomar Hyb + con sonda de la primera ejecución desde el congelador de-20 ° C y lugar en un baño de agua caliente durante 5 minutos reemplazar Hyb + desde el día 1 de protocolo con Hyb + con sonda permite incubar durante la noche en baño de agua caliente.</li>
</ol>7. día 3: Preparación de la solución
<ol><li>Preparar los tubos de microcentrífuga etiquetados Hyb + con la sonda de RNA "gen de interés". Preparar la serie de diluciones que se utilizarán durante el día 3.<ol>
<li>6 tubos separados, preparar la siguiente serie de diluciones de Hyb - y citrato salino de sodio (SSC, 0 a 100%) en un volumen de 1 mL y un lugar en los 70 ° C agitando baño de agua: tubo de 1 del = 100% Hyb-(1 mL de Hyb-): 2 = 25% de tubo 2 x SSC (250 μl de 2 x SSC, 750 μl de Hyb-); Tubo 3 = 50% 2 x SSC (500 μl de 2 x SSC, 500 μl de Hyb-); Tubo 4 = 75% 2 x SSC (750 μl de 2 x SSC, 250 μl de Hyb-); Tubo 5 = 100% 2 x SSC (1 mL de 2 x SSC); Tubo 6 = 100% 0,2 x SSC (2 mL de 0,2 x SSC). Nota: Estar alerta de la concentración de SSC, como cambia de 2 x 0.2 x.</li>
		<li>4 separar los tubos, preparar la siguiente serie de diluciones de PBT y SSC en un volumen de 1 mL y colocar en RT: tubo 1 = 25% PBT (250 μl de PBT, 750 μl de 0.2 x SSC); Tubo 2 = 50% PBT (500 μl de PBT, 500 μl de 0,2 x SSC); Tubo 3 = 75% PBT (750 μl de PBT, 250 μl de 0,2 x SSC); Tubo 4 = 100% PBT (1mL de PBT).</li>
		<li>Preparar un tubo con 2 mL de tampón ácido maleico que contiene solución de Tween 20 (MABT) de trabajo.</li>
		<li>Preparar dos tubos cónicos de 15 mL de solución de bloqueo. En cada tubo, agregue 0.2 g de reactivo de bloqueo a 10 mL de MABT (ver 4 archivos suplementarios). Coloca ambos tubos en un mezclador oscilante (o agitador de plataforma) hasta totalmente disuelto en la solución (hasta 3 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. día 3: Retiro de la sonda
<ol><li>Extraer Hyb + (con sonda) solución con un pipeta Pasteur de vidrio y colóquelo en un estéril, etiquetados tubo de microcentrífuga. Conservar este tubo en el congelador de-20 ° C para su uso futuro (si es acertado sondeo etiquetado).</li>
	<li>Cuidadosamente Añadir 500 μl de las SSC/Hyb-diluciones calientes (indicado abajo). Incubar en cada una de las siguientes soluciones para 10 min en el baño de 70 ° C.<ol>
<li>Incubar secuencialmente con 100% Hyb-(1 mL de Hyb-), 25% 2 x SSC (250 μl de 2 x SSC, 750 μl de Hyb-), 50% 2 x SSC (500 μl de 2 x SSC, 500 μl de Hyb-), 75% 2 x SSC (750 μl de 2 x SSC, 250 μl de Hyb-), 100% 2 x SSC (1 mL de 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 mL de 0.2 x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tras el último paso, incubar en cada una de las siguientes soluciones para 10 minutos cada uno. Todas las incubaciones siguientes llevará a cabo en RT en el agitador de plataforma: 25% PBT (250 μl de PBT, 750 μl de 0.2 x SSC), 50% PBT (500 μl de PBT, 500 μl de 0.2 x SSC), 75% PBT (750 μl de PBT, 250 μl de 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 mL de PBT).</li>
	<li>Después de una incubación de 10 minutos, retirar el 100% PBT y agregar 500 μl de MABT en cada frasco. Repita este paso dos veces durante 5 minutos.</li>
</ol>9. día 3: bloqueo de
<ol><li>Retire MABT cada vial e inundaciones con solución premezclada bloqueo de uno de los tubos (preparados en el paso 7.1.4). Coloque el frasco en un mezclador oscilante ~ 4 h a TA.</li>
	<li>Añadir 2 μl de Anti-DIG-AP Fab fragmentos al segundo frasco de 10 mL de solución (preparada en el paso 7.1.4) y brevemente de vórtice de bloqueo.</li>
	<li>Llenar cada frasco casi en su totalidad con bloqueo solución ~ 5 mL y coloque en el mezclador oscilante durante la noche en un refrigerador a 4 ° C.</li>
</ol>10. día 4: MABT enjuagues
<ol><li>Preparar un frasco común de 10% de suero normal de cabra (NGS) en MABT (añadir 100 μl de NGS a 900 μl de MABT).</li>
	<li>Extraer la solución de bloqueo en cada frasco y agregar 500 μl de mezcla NGS/MABT en cada frasco. Permitir que los embriones destinados a incubar durante 25 min a temperatura ambiente en el agitador de plataforma.</li>
	<li>Vuelva a colocar la mezcla NGS/MABT con 500 μl del 100% MABT. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en el agitador de plataforma. Realizar este enjuague 11 veces más durante el día cada 30 minutos.</li>
	<li>Llene el frasco con 100% MABT y el lugar en un mezclador oscilante durante la noche en un refrigerador o vestidor cámara a 4 º C.</li>
</ol>11. día 5: Visualización de la sonda
<ol><li>Preparar una alícuota de 50 mL de tampón de fosfatasa alcalina (AP) (ver 5 de archivo suplementario). Combinar los siguientes en un tubo cónico de 50 mL, envuelto en papel de aluminio para limitar la exposición a la luz: 5 mL de 1 M Tris (pH 9.5), 5 mL de 50 mM de MgCl2, 5 mL de 1% Tween 20, 5 mL de 1 M NaCl, 30 mL de ddH2O.</li>
	<li>MABT de quitar y reemplazar con 1 mL de tampón de AP (tubo envuelto en papel de aluminio). Que lavar durante 5 minutos. Hacer esto dos veces para asegurar el retiro completo del MABT.</li>
	<li>Elimine el AP de tampón y reemplazar con 1 mL de tampón de AP con 3,5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) y 4.5 μL de nitro azul de tetrazolio (NBT). Reemplazar con tampón/NBT/BCIP recién preparado de la AP una vez cada hora hasta que la reacción es completa. Seguir de cerca, comprobar cada 15 minutos, para permitir la reacción de coloración que tendrá lugar hasta conseguir el nivel deseado de la coloración. Precipitado se empieza a formar, reemplazar la solución cuanto antes.</li>
	<li>Detener la reacción de coloración de enjuague los embriones en fresco 100% buffer de AP (sin NBT/BCIP) para 5 minutos continuar enjuagues en PBT hasta que se alcancen niveles óptimos de señal (con cantidades mínimas de tinción de fondo). Continuar a enjuagar las muestras con el aumento de las diluciones de PBT en tampón de AP como sigue: 25% PBT (250 μL de PBT, 750 μL de tampón de AP), enjuague durante 5 minutos; 50% PBT (500 μL de PBT, 500 μL de tampón de AP), enjuague durante 5 minutos; 75% PBT (750 μL de PBT, 250 μL de tampón de AP), enjuague durante 5 minutos.</li>
	<li>Enjuague los embriones en ~ 5 mL de PBT en mezclador oscilante hasta que desea tinción de fondo mínima se alcanza el 100%. Interruptor hacia fuera con PBT fresca varias veces. Esto puede tomar hasta varios días.</li>
	<li>Cuando enjuague es completados, lave los embriones en 500 μL de PBS estéril en un agitador de plataforma. Realizar este enjuague dos veces durante 5 minutos. Después lava de la PBS, después fijar las muestras en 500 μL de 4% PFA por 1 h a temperatura ambiente en un agitador de plataforma. Alternativamente, fijar un día para otro en 1 mL de 4% PFA en el refrigerador a 4 ° C.</li>
	<li>Vuelva a colocar el fijador fresco, PBS estéril. Realizar este enjuague por lo menos dos veces por 5 min lugar los embriones en ~ 4 mL de PBS estéril 100% y almacenar a largo plazo a 4 ° C.</li>
</ol>12. proyección de imagen de
<ol><li>Hacer una placa de imagen en una placa Petri con agarosa al 3% y Tampón TAE. Nota: Las cantidades dependen de cuantas placas se necesitan. Las placas pueden reutilizarse varias veces. Se recomienda que un molde rectangular de poca profundidad se coloca en la caja Petri, mientras que el gel es refrigeración con el fin de crear una depresión para contener los embriones en la placa.</li>
	<li>Coloque los embriones en la placa en el PBS. Nota: Es mejor verter suavemente los embriones en la placa en el lugar de pipeteo sacarlos porque se ha encontrado que se pegue en el interior de las pipetas de plástico.</li>
	<li>Uso de la microscopia ligera con el fin de visualizar cada embrión. Utilizar una sonda Roma para maniobrar los embriones hasta la posición deseada.</li>
	<li>Tomar una imagen cuando el embrión está en la posición deseada. Tenga en cuenta que es importante tomar imágenes de embriones dentro de un par de semanas de tinción completa para evitar la potencial degradación de la mancha.</li>
</ol>

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<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a la vulnerabilidad del ARN a la degradación, uno de los pasos más importantes en el protocolo refiere a la síntesis estéril de la sonda de RNA. Sin embargo, si una sonda se genera con cuidado y proporciona buenos resultados, pueden ser reutilizado en posteriores reacciones de tinción. Un segundo paso crucial es la cuidadosa producción de todos los reactivos utilizados en el protocolo. Puesto que este protocolo trata de varios días y muchos pequeños pasos, es esencial que todos los reactivos son exactamente produc...

Hibridación in situ es un método común para la tinción de tejidos fijos para visualizar patrones de expresión de gen1. Esta técnica se ha realizado durante años en otros tradicionales2 y sistemas no tradicionales3 modelo para una variedad de estudios biológicos. Sin embargo, varios pasos y los reactivos son necesarios para realizar exitosamente este procedimiento. Para los investigadores que nunca han realizado esta técnica, iniciando el proceso puede ser intimidante debido a los muchos pasos necesarios. Además, la larga naturaleza de este procedimiento se presta a errores técnicos, que pueden ser difícil solucionar problemas.
El objetivo general de este artículo es presentar un método simple y sencillo que se puede representar esta técnica de hibridación accesible a un público más amplio. Para reducir la introducción de errores, presentamos un enfoque sencillo que produce alta calidad gene expresión manchas y reduce al mínimo la señal de fondo no específicas. Este procedimiento es similar a otros enfoques desarrollados en los sistemas de modelo tradicional, como Danio rerio4. Aquí, nuestro objetivo es facilitar la aplicación cuidadosa de cada paso usando una lista descargable (1 archivo suplementario), para promover el cuidado de aplicación del protocolo. La justificación para hacer esto es para facilitar la organización a través de los muchos pasos implicados en este procedimiento. Este artículo es apropiado para los investigadores interesados en realizar la hibridación in situ de montaje en conjunto en el desarrollo de embriones, pero aún no han realizado el procedimiento. La ventaja del enfoque elegido por los investigadores de Astyanax es que ha sido probado y comprobado en cavefish y morfos de peces de superficie, facilitando así el análisis comparativo de la expresión. El método presentado puede utilizarse por los investigadores en estudios sobre Astyanax y otros sistemas.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serológica de 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtración de 1000 mL</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>Cónica de 15 mL</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 25 mL</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtración de 250 mL</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 5 mL</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cónico</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unidad de filtración</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentos</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td> 1 <td>g</td></tr><tr><td>Solución de bloqueo</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de ARN DIG (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 galón</td></tr><tr><td>Formamida Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Viales de vidrio para tragos VWR</td><td></td><td>66011-041</td><td>1</td></tr><tr><td>Dr Pipetas de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio-cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Agua de grado molecular (libre de ARNasa)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT Sustrato en polvo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutante</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinasa K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Pipetas de plástico</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Baño de agua agitadora 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Agitador analógico estándar</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Levadura tRNA</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

En los últimos años, se ha publicado un genoma de proyecto para el cavefish mexicano ciego (Astyanax mexicanus), revelando las identidades de la secuencia de miles de genes. Investigaciones anteriores en este sistema de modelo emergente capitalizan completo genoma las investigaciones que han identificado numerosos loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados con diversos fenotipos asociados de cueva. Sin embargo, la capacidad de conectarse a genes de interés a la base hereditaria para cambio fenotípico sigue siendo un desafío significativo. Una técnica que puede facilitar la comprensión del papel del desarrollo en evolución troglomórphico es todo montaje hibridación in situ. Esta técnica puede implementarse directamente comparar la expresión génica entre las formas de vivienda de la cueva y la superficie, nominar a candidato genes subyacentes QTL establecido, identificar los genes de interés de los estudios de secuenciación de próxima generación, o desarrollar otros enfoques basados en el descubrimiento. En este informe, presentamos un protocolo simple, apoyado por una lista flexible, que puede ser ampliamente adaptada para su uso más allá del sistema de estudio presentados. Se espera que este protocolo puede servir como un recurso amplio para la comunidad de Astyanax y más allá.

En este informe, nos ofrece un enfoque sencillo para realizar etiquetado de embrionario Astyanax muestras para análisis de expresión génica de alta calidad. Esta técnica puede realizarse en cuatro o cinco días, y cada paso principal en el procedimiento se representa en un diagrama de flujo con códigos de color (figura 1). Una vez completado, embriones teñidos deben abrigar una etiqueta cromática púrpura oscurezca en tejidos que expresan el gen de int...

Este protocolo permite la visualización de la expresión génica en embrionario Astyanax cavefish. Este enfoque ha sido desarrollado con el objetivo de maximizar la señal de la expresión del gene, minimizando tinción de fondo inespecífica.

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In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Nuestro protocolo in situ es significativo porque proporciona una forma sencilla de visualizar patrones de expresión génica con una tinción de fondo mínima. Esta técnica hace que un protocolo complicado y largo sea relativamente fácil de realizar. Las sugerencias de configuración de sobremesa y las listas de comprobación proporcionadas hacen que este protocolo sea aún más fácil de realizar correctamente y reproducir.Si bien las técnicas que se muestran aquí son específicas de Astyanax mexicanus, es probable que se adapten a otros sistemas de individuos de tamaño comparable con pequeños ajustes al protocolo. En primer lugar, utilice cinta de laboratorio de color para designar viales y pipetas para cada gen. Usando una pipeta Pasteur, clasifú los embriones.Por lo general, no hay más de 12 embriones por vial, una vez clasificados. A continuación, establezca un baño de agua agitado a 70 grados centígrados. Extraiga cuidadosamente el metanol en los viales de embriones clasificados, y reemplácelo con 500 microlitros de metanol fresco 100%.Lave los embriones brevemente durante aproximadamente un minuto en una coctelera de plataforma. Después de esto, rehidratar los embriones en una concentración creciente de 1x PBS con Tween 20 en un agitador de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, coloque una pequeña junta con un fondo de malla en el baño de agua giratorio que se ha precalentado a 70 grados centígrados.Coloque alícuotas de búfer de hibridación menos e buffer de hibridación más en la junta. Añadir suavemente una solución de PK preparada a los viales de embriones para asegurar que todos los tejidos estén completamente cubiertos de solución. Transfiera los viales a una coctelera de plataforma y déjelos digerir en la solución de trabajo de proteinasa K durante aproximadamente 12 minutos.Después de esto, extraiga suavemente la solución PK e inunde brevemente el vial con PBT para diluir el PK restante. Sustituya la solución PBT por 500 microlitros de PBT fresco y deje que la solución enjuague en la coctelera de plataforma durante cinco minutos. A continuación, sustituya la solución PBT por 500 microlitros de descongelado 4%PFA. Deje que los embriones se incuban en el agitador de plataforma a temperatura ambiente durante 20 minutos.Para comenzar la pre-hibridación, añada 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado menos solución a los viales que contienen embriones. Coloque cuidadosamente los viales en la junta en el baño de agua a 70 grados centígrados sin agitar durante cinco minutos. A continuación, extraiga el tampón de hibridación menos solución e inunde los viales con 500 microlitros de tampón de hibridación preadnciado más solución.Vuelva a colocar los viales en la junta en el baño de agua e incubar con agitación durante cuatro horas o durante la noche. Para comenzar la hibridación, extraiga el búfer de hibridación más de los viales y sustitúyalo por 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado fresco más. Agregue cuidadosamente dos microlitros de sonda de ARN a cada vial y gire suavemente para asegurar una distribución uniforme de la sonda.Incubar en el baño de agua a 70 grados centígrados durante la noche mientras se agita a 40 RPM. Para empezar, prepare tubos de microcentrífuga etiquetados como tampón de hibridación más con el gen de la sonda de ARN de interés como se describe en el protocolo de texto. Establezca dos tubos cónicos de 15 mililitros y añada 0,2 gramos de reactivo de bloqueo y 10 mililitros de MABT.Coloque ambos tubos en un mezclador nutating hasta que el reactivo se disuelva completamente en la solución. Con una pipeta Pasteur de vidrio, extraiga el tampón de hibridación más y la solución de sonda y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado estéril. Guarde este tubo en el congelador a menos 20 grados centígrados para su uso futuro.Agregue cuidadosamente 500 microlitros del citrato de sodio salino caliente y el tampón de hibridación menos diluciones. Incubar en soluciones secuenciales durante 10 minutos cada una en el baño de agua agitada, y luego a temperatura ambiente en una coctelera de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Después de la última incubación, sustituya el 100% PBT de cada vial por 500 microlitros de MABT.Repita este proceso dos veces durante cinco minutos cada uno. En primer lugar, retire el MABT de cada vial e inunde con una solución de bloqueo premezclada de uno de los tubos cónicos de 15 mililitros. Coloque ambos viales en el mezclador nutating durante cuatro horas a temperatura ambiente.Añadir dos microlitros de los fragmentos de anticuerpos al segundo tubo de solución de bloqueo preparada y vórtice brevemente. A continuación, llene cada vial casi por completo con solución de bloqueo y colóquelos en un mezclador nutrido durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Para comenzar, prepare un vial de 10%NGS en MABT.Sustituya la solución de bloqueo de cada vial por 500 microlitros de esta solución NGS. Incubar a temperatura ambiente en la coctelera de plataforma durante 25 minutos. Después de esto, reemplace la mezcla NGS con 500 microlitros de 100%MABT.Incubar en la coctelera de plataforma a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este enjuague 11 veces más durante todo el día, cada 30 minutos. A continuación, llene cada vial con 100% MABT y colóquelos en un mezclador nutating durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados.En primer lugar, reemplace el MABT en cada vial con un mililitro de tampón AP y déjelo lavar durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces para retirar completamente el MABT. Entonces substituya el buffer AP con un mililitro del buffer AP fresco que contiene 3.5 microlitros del BCIP y 4.5 microlitros del MBT.Sustituya esto por una mezcla fresca de tampón AP que contenga el BCIP y el MBT cada hora hasta que se complete la reacción, asegurándose de monitorear la reacción de cerca y comprobar cada 15 minutos hasta que se haya alcanzado el nivel deseado de tinción. Detenga la reacción de coloración enjuagando los embriones en una concentración creciente de 1X PBT en el búfer AP como se describe en el protocolo. Enjuague los embriones en aproximadamente cinco mililitros de 100% PBT en un mezclador nutating hasta que se alcance la tinción mínima de fondo deseada.Cuando el enjuague esté completo, lave los embriones en 500 microlitros de PBS estériles en un agitador de plataforma y coloque las muestras como se describe en el protocolo de texto. Después de enjuagar los embriones, colóquelos en cuatro mililitros de PBS 100% estéril y, si es necesario, guárdelos a largo plazo a cuatro grados centígrados. En este estudio, los especímenes embrionarios de Astyanax están etiquetados para el análisis de expresión génica de alta calidad.Este proceso se ha implementado con éxito tanto en el pez cueva de Pachon como en los embriones de peces de superficie. Los embriones de pez cueva etiquetados para la expresión Sox9 demuestran un etiquetado claro en los arcos ramificados en desarrollo y la aleta pectoral. Tenga en cuenta que la tinción está prácticamente ausente en el saco de yema o en las somitas en desarrollo en el flanco.Del mismo modo, la expresión de Tfap2a es evidente en las porciones de la cabeza en desarrollo como células de cresta neural de migración temprana a lo largo de la región del flanco dorsal del embrión. El tercer gen presentado para los embriones de pez cueva, Phf20a, se observa en las porciones del mesodermo somático y la cabeza posterior que están destinados a dar lugar a tejido óseo. Los embriones de peces de superficie etiquetados para CXCR muestran un etiquetado positivo en regiones aisladas de la cabeza y el flanco, así como algunas células individuales que cubren el saco de yema.El gen Adcyap1a se expresa en regiones del sistema nervioso central, incluidas las células pituitarias. Observe la expresión altamente específica en grupos bilaterales emparejados de células en el aspecto dorsal del embrión, así como una región más grande de expresión de línea media. El último gen examinado para los embriones de pez cueva, Sox10, es evidente como un marcador temprano de la cresta neural en los lados izquierdo y derecho del embrión dorsal.Después de completar in situ, normalmente imagen de nuestros resultados utilizando microscopía de luz. Lo mejor es hacer esto dentro de las dos semanas después de la finalización con el fin de evitar la degradación de la tinción.

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Research

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El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación.   Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

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El embrión de pez cebra es un excelente modelo para la investigación de la biología del desarrollo. Durante la embriogénesis, el desarrollo de pez cebra con una masa de yema, que presenta retos en tres dimensiones para la observación de muestras y análisis. Este protocolo se describe cómo crear dos dimensiones planas montar preparaciones de todo el montaje in situ (WISH), teñidas muestras de embriones de pez cebra.

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Presentamos aquí un protocolo optimizado para genotipar, teñir y preparar ratones fetales para la obtención de imágenes de proyecciones de axones nociceptores periféricos en todo el animal, como un método eficaz para evaluar los fenotipos de crecimiento sensorial de axones en ratones modificados genéticamente en desarrollo.

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Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Aprende hibridación in situ en embriones de Astyanax mexicanus para visualizar expresión génica con mínimo fondo. Este protocolo simplificado facilita estudios de biología del desarrollo y neurociencia.

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