Name: Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprende la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes en patata. Este método permite evaluar la actividad de promotores mediante tinción GUS en raíces transgénicas.

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Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, beca FPI para PB), el Ministerio de Economía y Competitividad, FEDER fondos (36725 AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) y la Universidad de Girona (beca de doctorado a SF y grant SING11/1). Los autores agradecemos al Dr. Inge Broer (Instituto para el uso de la tierra, Universidad de Rostock, Rostock, Alemania) y Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, España) a. rhizogenes y la cepa de a. tumefaciens , respectivamente y el Dr. Marçal Soler y el Dr. Anna Plasencia por la ayuda y el apoyo recibido en la iniciación de los experimentos de transformación de a. rhizogenes (Universidad Toulouse III Paul Sabatier, CNRS, laboratorio de investigación de planta (LRSV), Castanet Tolosan, Francia). Los autores agradecen a Sara Gómez (Departamento de biología, UdG, Girona) por su valiosa asistencia en la realización del trabajo de laboratorio y cuidar de las plantas y Ferran Fontdecaba y Carla Sánchez quien ayudó con algunos de los experimentos mientras que estaban haciendo sus proyectos final de carrera.

El protocolo de transformación de a. rhizogenes fue adaptado y modificado de cuerno et al7 y el genotipo probado fue S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). El protocolo de transformación de a. tumefaciens fue adaptado y modificado de Banerjee et al22 y los genotipos probados fueron S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) y S. tuberosum SSP. andigena. Los pasos principales de ambos procedimientos se resumen en la figura 1 y figura 2, respectivamente.
Nota: En todos los pasos del procedimiento realizar transferencias en vitro , hacerlo rápidamente y, cuando sea posible, mantener las placas o potes cerrados, minimizando así la exposición de la planta al aire para evitar el marchitamiento y la contaminación. Indique lo contrario, todas las incubaciones de planta se realizaron en gabinetes en las condiciones de 12 h de luz/12 h de 24 ° C 20 ° C oscuro y 67 μmol m-1 s-1. Indique lo contrario, llevar a cabo todas las bacterias manipulación de vitro planta transferencias y en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. Todas las recetas de medios de cultivos vegetales Agrobacterium y en vitro se proporcionan en la Tabla S1.
PRECAUCIÓN: Depositar todas las bacterias genéticamente modificadas y las plantas para el depósito de residuos apropiado.
1. culturas de Agrobacterium utilizadas para la transformación
Nota: La cepa empleada para la transformación de a. rhizogenes fue el C58C1:Pri15837 (proporcionado amablemente por el Dr. Inge Broer) y que para a. tumefaciens fue el GV2260 (proporcionado amablemente por el Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes se transformó con el vector binario PK7GWIWG2_II-ya sean (VIB-Departamento de Biología de sistemas de planta en Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) que contiene una T-DNA con un marcador de transformación para monitorear la raíz melenuda formación. Para comparar las raíces transformadas de a. rhizogenes y a. tumefaciens, ambos fueron transformados con la pKGWFS7 de vector binario que contiene un ADN de T lleva el promotor FHT conducir el gen reportero β-glucoronidase (GUS) y el gen de resistencia a kanamicina como marcador seleccionable15.
<ol><li>Elegir una colonia de Agrobacterium y crecer durante la noche (O/N) en 5 mL de medio YEB suplementado con antibióticos (Tabla S1) en un tubo de centrífuga de 50 mL a 28 ° C con agitación a 200 rpm.</li>
	<li>Para la transformación de a. tumefaciens , medir la densidad óptica, que debe ser OD600 = 0.6-1.0.<ol>
<li>Si la densidad óptica es superior, realizar un subcultivo bajando a OD600 = 0.3 con medios frescos y espere hasta que la cultura llegue a OD600 = 0.6-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar 1 mL de cultivo de Agrobacterium a 3.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quite el sobrenadante mediante pipeteo y resuspender las células en 1 mL de medio YEB fresco sin antibióticos. Repita este paso para asegurar la eliminación completa de los antibióticos.<ol>
<li>Para la transformación de a. tumefaciens , en la resuspensión último añadir el volumen adecuado de YEB para obtener una densidad óptica final de OD600 = 0.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantener las células en hielo mientras se preparan las plantas infectadas.</li>
</ol>2. material para la transformación de la planta
<ol><li>Hacer uno o dos esquejes de tallo de nodo ya sea con el apical o los brotes auxiliares de estéril en vitro patata plantas (donante); crecen en medio sólido 2MS en macetas de 3 a 4 semanas (figura 1A y figura 2A).</li>
</ol>3. planta de transformación con a. rhizogenes (figura 1)
Nota: Este procedimiento permite la obtención de raíces pilosas transformadas. Para evaluar la expresión del transgen, se necesita un control negativo. Para preparar el control negativo, siga el procedimiento utilizando una cepa de a. rhizogenes transformaciones o transformadas con el vector vacío que incluye el gen marcador de transformación.
<ol><li>Utilizar placas de medio fresco; por otra parte, las placas pueden conservarse a 4 ° C con el lado de la tapa, bien selladas con la película transparente para evitar la deshidratación de los medios de comunicación. Para preparar las placas de medios cuadrados, pendiente a ~ 15°, 40 mL de MS, se llenan y deje solidificar. Esto reducirá al mínimo el contacto de la parte aérea de la planta con el medio.</li>
	<li>Transferencia muy cuidadosamente una planta donante desde el medio de 2MS a una placa cuadrada de 120 x 120 mm.</li>
	<li>Inyectar a la un madre entrenudo 3 μL de la cultura de a. rhizogenes utilizando una aguja quirúrgica y repetirlo dos veces por planta de entrenudos diferentes cuando sea posible. Nota: Considerar cada inyección como un evento de transformación independientes (figura 1B).</li>
	<li>Transferir inmediatamente la planta entera a una placa cuadrada con sólida MS suplementado con 0,1 mM acetosiringona. Capacidad para 2 plantas por placa. Nota: La solución stock de 1 M acetosiringona está preparada en DMSO y puede ser almacenada a-20 ° C.</li>
	<li>Selle la placa con cinta quirúrgica y organizar verticalmente dentro de un gabinete de crecimiento durante 4 días.</li>
	<li>Transferencia de la planta a un nuevo plato cuadrado con medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL] a . rhizogenes.</li>
	<li>Después de 10-12 días, las raíces pilosas empezarán a aparecer (figura 1,D 1). A continuación, suprimir las raíces nativas de la planta y la planta de transferencia a un nuevo plato cuadrado con medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL]. Nota: Raíces peludas transformadas pueden comprobarse por fluorescencia roja cuando se utiliza un marcador de transformación DsRed (figura 3D).</li>
	<li>Para obtener una planta compuesta (Figura 1E), permita que las raíces pilosas transgénicas crecen durante 3-4 semanas en medio MS suplementado con Cefotaxima sódica [500 μg/mL] (cambiar el medio cada semana).</li>
	<li>Según el propósito, difundir las raíces pilosas transgénicas y los controles negativos como sigue.<ol>
<li>Transferencia de la planta entera compuesta para un cultivo hidropónico (Tabla S2) o medio de suelo para permitir un desarrollo masivo.</li>
		<li>Para propagar individualmente las raíces pilosas transformadas, con un bisturí corta las raíces que expresan el marcador rojo transformación fluorescente (proteína DsRed) cuando son 4-8 cm de largo (Figura 1E) y transferirlas a una placa Petri con medio sólido Gamborg B5 suplementado con 2% sacarosa y cefotaxime sódico [500 μg/mL]. Sellar las placas con película de plástico de laboratorio y crecer en la oscuridad a 20 ° C. Nota: Las raíces pueden ser manipuladas bajo un estereomicroscopio equipado para detectar la fluorescencia bajo condiciones estériles (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Para la producción de biomasa (es decir, análisis de expresión génica), cortar una raíz de 5 cm largo peludo y propagar en un erlenmeyer de 150 mL con 20 mL de Gamborg B5 líquido suplementado con 2% sacarosa y cefotaxime sódico [500 μg/mL]. Crecer durante 6 semanas en la oscuridad a 20 ° C y 60 rpm.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3.jpg"> Figura 1: Línea de tiempo para obtener patatas transgénicas raíces pilosas con a. rhizogenes. Se muestran las semanas acumuladas para llegar a cada etapa del proceso de transformación y los pasos subsiguientes para crecer las raíces pilosas. Muestran imágenes representativas de diferentes etapas: la iniciación del proceso con 3 semanas de edad en vitro de las plantas (A), entonces la infección de las plantas mediante la inyección de a. rhizogenes (B), la formación de la proliferativa tejido (C, flechas) con raíces peludas emergentes (D) y las raíces pilosas desarrolladas expresar el marcador de la transformación fluorescente rojo DsRed (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig1v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. planta de transformación con a. tumefaciens (figura 2)
Nota: Este procedimiento permite la obtención de plantas transformadas. Para evaluar el efecto del transgén, se necesita un control negativo. Una opción es seguir el procedimiento con una a. tumefaciens transformadas con el vector vacío. Alternativamente, pueden utilizarse las plantas de tipo silvestre.
<ol><li>Corte y coloque una hoja de las plantas 3-4 semanas de edad (figura 2A) en una placa Petri. Con un bisturí excluir el peciolo y realizar cortes transversales (1-3 dependiendo del tamaño de la hoja) desde el centro de la hoja en los bordes evitando cortarlos apagado (figura 2B).</li>
	<li>Coloque la hoja flotando en 10 mL de 2 ms fresco medios líquidos en caja Petri con el lado abaxial inmediatamente y cerrar la placa. Repita el paso con capacidad hasta 15 hojas de CV Désirée y 25 hojas para SSP. unndigena (dependiendo del tamaño de la hoja).</li>
	<li>Inmediatamente añadir 80 μl del cultivo de a. tumefaciens a OD600 = 0,8 en los medios líquidos y homogeneizar la placa manualmente durante 1 minuto para la distribución de la solución bacteriana.</li>
	<li>Cuidadosamente sellar con lacre de la película, cubrir con papel de aluminio e Incube por 2 días en una cámara a 24 ° C dejar que la transformación ocurra.</li>
	<li>Transferir las hojas manteniendo lado abaxial hasta medio CIM (figura 2B) e incube durante una semana en un gabinete de crecimiento.<ol>
<li>Raspe el medio CIM con las pinzas para que las hojas se pueden acomodar mejor en los medios de comunicación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir las hojas manteniendo lado abaxial hasta medio SIM (figura 2) e Incube en un crecimiento del gabinete, refrescante al medio cada 7-10 días, hasta que los brotes son unos 2 cm de altura.<ol>
<li>Raspe el medio SIM con las pinzas para que las hojas pueden ser completamente rodeadas por los medios de comunicación. Cuando los brotes emergidos a la tapa, trabajar con altura de Petri (100 x 20 mm, altura x diámetro). Nota: El callo se formará después de 2-3 semanas en medio de SIM (Figura 2D) y los brotes después 6-7 semanas (Figura 2E). Los brotes se considerarán como eventos independientes transformación cuando emergen de callo formado a partir de heridas independiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte tres brotes emergido de cada callo (considerado como el evento mismo de la transformación) (Figura 2E), para frascos de cultivo con medio de MG suplementados con Cefotaxima sódica [250 mg/L] para permitir la transferencia de enraizamiento, etiqueta el subconjunto con un número y Incubar en un crecimiento del gabinete para 3-4 semanas o hasta que los brotes son vigorosos (figura 2F). Nota: Cuando corte los brotes, eliminar bien el callo de lo contrario la raíz no se formará.<ol>
<li>Repetir tantas veces como líneas independientes son necesarias. Hasta 5 transformación diferentes eventos se pueden colocar en un matraz de cultivo con un diámetro de 8 cm para trabajar en la plena confianza que no se mezclan las plantas de diferentes eventos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione la planta más vigorosa de cada evento, cortar el segmento apical de los brotes con entrenudos 3-4 y colocarlo en un nuevo frasco de cultura con 2 ms suplementado con Cefotaxima sódica [250 mg/L]. Nota: En 3-6 semanas que la planta crecerá de forma eficiente, desarrollando una sesión vigorosa y raíces.<ol>
<li>Traer de vuelta a la cámara de los brotes no seleccionados hasta que la planta seleccionada ha desarrollado completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cortar segmentos de tallo de la planta con mínimo un entrenudo o con la yema apical y transferirlos a nuevo medio de 2 ms suplementado con cefotaxima [250 mg/L]. Les Incube en el gabinete de crecimiento.<ol>
<li>Repetir cada 3-4 semanas para establecer las líneas en vitro transformado. Nota: La Cefotaxima sódica es necesaria en al menos tres las transferencias posteriores al medio de 2MS para asegurarse para matar al de a. tumefaciens; Luego, si se observa un crecimiento excesivo de a. tumefaciens , transferir las plantas otra vez a 2MS medios suplementados con Cefotaxima sódica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para caracterizar el fenotipo de la planta, transferencia de plantas al suelo para su caracterización completa o al cultivo de hidroponía para la inspección de la raíz.<ol>
<li>Mantener los tubérculos producidos en suelo para propagar y mantener las líneas establecidas.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59119/59119fig2.jpg"> Figura 2: Línea de tiempo para obtener patatas transformadas plantas utilizando a. tumefaciens. Se muestran las semanas acumuladas para llegar a cada etapa del proceso de transformación y los pasos subsiguientes para crecer las plantas. Muestran imágenes representativas de diferentes etapas: la iniciación del proceso utilizando las hojas de 3 - semanas de edad en vitro las plantas (A), el traslado de los heridos y los infectados deja a los medios CIM (B), las hojas cuando transfiere a Medio SIM (C), la visualización de las callosidades alrededor de las áreas heridas después de 2-3 semanas en los medios de comunicación (D), la formación sesión después 9-11 semanas en medios SIM (E) y los brotes después de ser trasladado a los medios de comunicación MG (F) SIM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59119/59119fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. cultivo hidropónico cultivo
<ol><li>Preparar solución de Hoagland a una fuerza media (0,5 x) (Tabla S2) en un cubo de 10 L.</li>
	<li>Sumerja una bomba de acuario para mantener la homogeneidad y las condiciones de oxígeno adecuado.</li>
	<li>Cubren las paredes de la cubeta con papel de aluminio para crecer las raíces en condiciones de oscuridad.</li>
	<li>Evitando el daño de la raíz, la transferencia en vitro plantas para cultivo hidropónico. Nota: Retire cualquier resto medio en vitro de raíces para evitar la proliferación de microorganismos durante la incubación agitando cuidadosamente las raíces sumergidas en agua.</li>
	<li>Cubrir las plantas con la película transparente como un invernadero para permitir una aclimatación adecuada e Incube en el cuarto de crecimiento.</li>
	<li>Hacer agujeros en la película después de 3 días y quitar completamente una semana después.</li>
	<li>Reemplazar con medio fresco cada 10 días.</li>
</ol>6. ensayo de genética de reportero histoquímica de GUS 
Nota: En nuestro caso el GUS se realizó análisis con raíces de 2 a 3 semanas en hidroponía o in vitro.
<ol><li>Fijar las raíces con acetona al 90% frío (v/v) e incubar durante 20 minutos en hielo.</li>
	<li>Realizar dos lavados con agua destilada.</li>
	<li>Añadir GUS fresco, coloración de la solución (tabla 1) y aplique vacío (-70 Pa) durante 20 minutos.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C en oscuridad para proteger al GUS fotosensible durante 4 horas o hasta que aparezca un color azul. Nota: La presencia de ferri y ferrocianuro en solución de GUS minimizar la difusión de productos de la reacción y proporcionar una ubicación más precisa. PRECAUCIÓN: Utilice una campana de humos y usar ropa protectora al manipular los derivados tóxicos de cianuro en la solución de GUS (Ferricianuro de potasio y de ferrocianuro de potasio). El sustrato de GUS y el material de desecho deberán ser eliminados con seguridad.</li>
	<li>Retire la solución de tinción GUS y descartar en contenedores apropiados.</li>
	<li>Realizar dos lavados con etanol 70% (v/v).</li>
	<li>Observar bajo un microscopio de campo brillante. Nota: GUS la coloración es estable por varias semanas; sin embargo, durante la primera semana, la señal de GUS es claro y menos a las vecinas las células difunde. Para un almacenaje más largo, sellar el tubo y almacenar a 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59119/59119tbl1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Tabla 1: Receta de solución tinción GUS.

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

En Papa, el sistema más común para obtener plantas transgénicas completas estables utiliza la transformación por cepas de Agrobacterium tumefaciens que requieren organogénesis con fitohormonas exógenas. Aunque los protocolos de Agrobacterium base tiene el potencial para integrar el vector T-DNA secuencia25, esta metodología es aún más fácil y menos costoso para transformar plantas de patata. Durante los últimos años, el interés en a. rhizogenes-transformación mediada ha ...

Aparte de interés económico, la generación de plantas transgénicas tiene su propia importancia en la investigación para demostrar la función última de los genes y a comprender mejor la fisiología de las plantas y el desarrollo. El más utilizado método de inserción de ADN de la planta es Agrobacterium-mediado transformación. Agrobacterium tumefaciens es capaz de generar agallas de corona en el tejido infectado de muchas especies de plantas por la acción de su plásmido inductor de tumor de (Ti). El plásmido contiene una región de ADN de T con un conjunto de genes que se integrará en el genoma de la planta e inducir diferenciación de tejido1,2. El intercambio de estos genes dentro del ADN de T por el transgén ha permitido la generación de modificaciones de la planta específica evitando efectos fenotípicos3. Para facilitar el transgén de clonación en el T-ADN, la región T-DNA ha sido suprimida en un plásmido independiente llamado un plásmido binario, mientras que el resto de los genes del plásmido Ti (los genes de virulencia que permiten los mecanismos de transferencia y de inserción de T-DNA) han sido situado en un plásmido helper. Para la investigación de biotecnología vegetal, transformación por a. tumefaciens tiene varias ventajas: no necesita dispositivos costosos, es capaz de generar transformación de planta estable y transitoria y bajo número de gene copias están integradas en la cromosoma4. Sin embargo, para la mayoría de las plantas, pero no, de Arabidopsis la generación de los transformantes estables requiere regeneración de plantas de una sola o unas pocas células mediante fitohormonas exógenas, haciendo este proceso laborioso y desperdiciador de tiempo. A. rhizogenes es capaz de modificar el genoma de la planta, produciendo las raíces pilosas o raíces adventicias en los sitios de infección debido a la expresión de los genes rol (root locus) codificado en la inducción de raíz (Ri) plásmido5. Aunque menos estudiado que a. tumefaciens, a. rhizogenes también se utiliza para la obtención de raíces transgénicas. En este caso, el a. rhizogenes contiene el original T-ADN en el plásmido Ri y un plásmido binario con un segundo T-DNA llevando el transgén. Cuando el sitio de infección en tallo o hipocotilos, una planta compuesta se puede obtener, con nuevas raíces transgénicas peludas surgen brotes de tipo salvaje. Alternativamente, peludas raíces transformadas pueden desarrollarse autónomamente en vitro en los medios de comunicación con las entradas de fuente de carbono. El uso de a. rhizogenes en lugar de a. tumefaciens a producir tejido transgénico está ganando relevancia cuando la raíz es el órgano Diana, porque no es necesaria la regeneración de plantas y por lo tanto es más rápido y menos costoso. Estudios anteriores han demostrado que esta metodología apropiada para la caracterización fenotípica de raíz genes específicos6,7,8,9.
La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto más importante cultivo en el mundo según la organización para la agricultura de las Naciones Unidas (FAO) y la alimentación ya que el tubérculo tiene importancia nutricional para el consumo humano por ser una buena fuente de vitaminas y minerales. Por eso, Papa se ha colocado en el foco de la biotecnología agrícola y también se considera como un buen modelo biológico genético y desarrollo de estudios de10,11. Transformación de la papa contribuyó significativamente a la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes los tejidos suberized a través de la caracterización de los genes implicados en suberina y cera biosíntesis12,13,14 ,15,16,17, monómero del suberin transporte Reglamento18 y transcripción19. El gen de la transferasa suberin feruloyl, FHT, es uno de estos genes biosintéticos caracterizados; su regulación a la baja da lugar a un fuerte deterioro de la protección de la peridermis, que se correlaciona con una disminución fuerte en ferulate ésteres de suberina y ceras en tubérculos de patata14. Concomitante, en raíces y semillas de Arabidopsis, el nocaut de su supuesta orthologue (ASFT/RWP1) también demostró su papel en la producción de ferulates Alquilo en suberina20,21. En Papa, la línea de reportero transcripcional FHT y el anticuerpo FHT demostraron respectivamente que se encuentran en la exodermis, endodermis, phellogen-derivados y en los tejidos heridos15la actividad del promotor y la proteína.
En este trabajo, detallamos un protocolo usando a. rhizogenes para producir transgénicas raíces peludas que se mantienen en una sesión de tipo salvaje, compuesto patata plantas generadoras o suprimido para crecer autónomamente en vitro. También ofrecemos el protocolo utilizando a. tumefaciens para obtener plantas de papa transgénicas completa. Como caso de estudio, a. rhizogenes y a. tumefaciens transformado con el mismo vector binario se utilizan para obtener las raíces con el promotor FHT conducción expresión de gen reportero GUS . Los resultados son registrados y comparados.

<table><tbody><tr><td> Acetona </td><td> Panreac </td><td> 1.310.071.21 </td><td></td></tr><tr><td> Acetosiringona </td><td> Acros </td><td> 115540050 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de acuario </td><td> Prodac </td><td> MP350 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclave </td><td> Ragpa Strelimatic </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Agar bacteriológico </td><td> Lab Conda </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> BAP<td> > Duchefa </td><td> B0904 </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de carne de vacuno </td><td> Lab Conda </td><td> 1700 </td><td></td></tr><tr><td> Armario de cultivo de plantas </td><td> Nuaire </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillina </td><td> Duchefa<td> > C0109 </td><td></td></tr><tr><td> Cefotaxima sódico </td><td> Duchefa </td><td> C0111 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Merck </td><td> 1029310161 </td><td></td></tr><tr><td> Ecotron infors </td><td> HT </td><td> 29378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Merck </td><td> 1.009.831.011 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de halcón </td><td> Control tecnica </td><td> CFT011500 </td><td></td></tr><tr><td> Ferricianato </td><td> Sigma </td><td> 101001081 </td><td></td></tr><tr><td> Ferrocianato </td><td> Sigma </td><td> 100979088 </td> <td></td></tr><tr><td>Maternal (8,06 cm de diámetro y 11,3 cm de altura) y tapa de plástico para cultivo in vitro </td><td> Apiglass </td><td> ref16 </td><td></td></tr><tr><td> GA3 </td><td> Sigma </td><td> G7645 </td><td></td></tr><tr><td> Gamborg B5 media </td><td> Duchefa </td><td> G0210 </td><td></td></tr><tr><td> Gelrite </td><td> Duchefa </td><td> G1101 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Sigma </td><td> K1377 </td><td></td></tr><tr><td> Leukopor </td><td> BSN Leucopor </td><td> BDF47467 </td><td></td></tr><tr><td> Lupe </td><td> Wild-Heerbrugg </td><td> M420 </td><td></td></tr><tr><td> Agitador magnético </td><td> Agimatic </td><td> 7000243 </td><td></td></tr><tr><td> MES hidratado </td><td> Sigma </td><td> M2933-25G </td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td> Panreac </td><td> 131404 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olympus </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de minufuga 5415R </td><td> Eppendorf </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Murashige y Skoog media </td><td> Duchefa </td><td> M0254.0050 </td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td> Panreac </td><td> 131679 </td><td></td></tr><tr><td> NAA </td><td> Duchefa </td><td> N0903 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Panreac </td><td> 131659 </td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td> Sigma </td><td> 58282 </td><td></td></tr><tr><td> NightSea Stereo </td><td> SFA Moonting Adapter </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm < </td><td> p>Anorsa </td><td> PRFL-001-001 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> Lab Conda </td><td> 1616 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Placas (90 x 14) </td><td> Anorsa </td><td> 200200 </td><td></td></tr><tr><td> pHmetre </td><td> Crison </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Fitotrón </td><td> Inkoa </td><td> RFTI-R5485 </td><td></td></tr><tr><td> Agar vegetal </td><td> Duchefa </td><td> P1001 </td><td></td></tr><tr><td> Refrigeratot </td><td> Liebherr Medline </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Rifampicina</p</td><td> > Duchefa </td><td> R0146 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomycin </td><td> Sigma </td><td> 59007 </td><td></td></tr><tr><td> Espectrofotómetro </td><td> Shimadzu </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Placas cuadradas (120 x 120) </td><td> Deltalab </td><td> 200204 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> S6501 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Panreac </td><td> 131621 </td><td></td></tr><tr><td> Cuchillas quirúrgicas </td><td> Swann-Morton </td><td> 201 </td><td></td></tr><tr><td> Aguja quirúrgica </td><td> NIPRO </td><td> 015/0204 </td><td></td></tr><tr><td> Triptone </td><td> Lab Conda </td><td> 1612 </td><td></td></tr><tr><td> Triton </td><td> Serva </td><td> 37240 </td><td></td></tr><tr><td> Unimax 1010 agitador </td><td> Heidolph </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Vacío </td><td> Dinko </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> x-GlcA (ácido 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glucurónico, sal de sodio anhidra) </td><td> Biosynth </td><td> B-7398 </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> Lab Conda </td><td> 1702.00 </td><td></td></tr><tr><td> Zeatin ribósido </td><td> Sigma<td> > 1001042850 </td><td></td></tr></tbody></table>

tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un gene del suberin por gus staining

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium SP., es uno de los métodos más utilizados para obtener plantas transgénicas, ya que tiene la capacidad de transferir e integrar su propio T-ADN en genoma de la planta. Aquí, presentamos dos sistemas de transformación para modificar genéticamente las plantas de papa (Solanum tuberosum). En la transformación de a. tumefaciens , hojas están infectadas, las células transformadas se seleccionan y se regenera una planta transformada completa nueva con fitohormonas en 18 semanas. En la transformación de a. rhizogenes , tallos son infectados por las bacterias de la inyección con una aguja, las nuevas raíces peludas transformadas emergidas se detectan usando un marcador fluorescente rojo y se eliminan las raíces no-transformado. En 5-6 semanas, la planta resultante es un compuesto de una sesión de tipo salvaje con raíces peludas transformadas completamente desarrolladas. Para aumentar la biomasa, las raíces pilosas transformadas pueden ser suprimidas y uno mismo-propagar. Aplicamos ambos métodos de transformación de Agrobacterium -mediado para obtener las raíces que expresan el gen reportero GUS conducido por un promotor de genes biosintéticos de suberina. El procedimiento de tinción GUS se proporciona y permite la localización celular de la inducción del promotor. En ambos métodos, las raíces de papa transformada demostraron la coloración en el suberized de la endodermis y exodermis y además, en las raíces de a. rhizogenes transformó la actividad de GUS GUS también se detectó en el surgimiento de raíces laterales. Estos resultados sugieren que a. rhizogenes puede ser una herramienta rápida alternativa para estudiar los genes que se expresan en las raíces.

Agrobacterium rhizogenes -mediada por la transformación de la papa
En este manuscrito, se presenta el procedimiento paso a paso para obtener raíz transformada con a. rhizogenes . Figura 1 presenta un resumen del procedimiento, que en conjunto toma alrededor de 5-6 semanas (de la inyección de a. rhizogenes para obtener raíces peludas comple...

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

La transformación mediada por agrobacterium es un método fácil para producir plantas de papa modificadas genéticamente. Con el fin de entender las funciones genéticas específicas y su contribución a la fisiología de los órganos. La transformación por agrobacterium rhizogenes es una herramienta robusta para evaluar rápidamente las raíces que funcionan con genes, ya que la transformación de agrobacterium tumefaciens puede obtener resultados similares.Demostrando este procedimiento estarán Sandra Fernandez-Pinan, una post-doc, y Jennifer Lopez, una estudiante de maste5r de nuestro laboratorio. Comience por cultivar una sola colonia de agrobacterium durante la noche en cinco mililitros de caldo de extracto de levadura, o medio YEB, complementado con antibióticos en un tubo centrífugo de 50 mililitros a 28 grados centígrados, a 200 rotaciones por minuto. Para la transformación de a-tumefaciens, mida la densidad óptica a la mañana siguiente.Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD 600 alcanza 0,6 a uno, centrifuga un mililitro del cultivo de agrobacteria y resuspend el pellet en un mililitro de medio YEB fresco sin antibióticos. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en medio YEB fresco sin antibióticos, a la concentración adecuada para obtener un OD final 600 de 0.8, y colocar las células bacterianas en hielo. Para la transformación de la planta utilizando A.rhizogenes, transfiera cuidadosamente una planta donante de un cultivo medio de 2MS a una placa cuadrada de 120 por 120 milímetros, y utilice una aguja quirúrgica para inyectar tres microlitros de un cultivo de A.rhyzogenes a diferentes internodos de tallo como sea posible.A continuación, transfiera inmediatamente toda la planta a una nueva placa cuadrada que contenga un medio sólido de la NIEBLA, complementada con 0,1 mililosiones de acetosyringona. Después de colocar una segunda planta en la misma placa, transformada de la misma manera, sellar la placa con cinta quirúrgica, y colocar la placa verticalmente dentro de un gabinete de crecimiento durante cuatro días. Transferir la planta a una placa cuadrada con medio de NIEBLA complementado con cefotaxime sódico para matar a los A.rhizogenes y colocar la placa sellada verticalmente dentro de un armario de crecimiento durante cuatro días.Después de 10 a 12 días, aparecerán nuevas raíces peludas. Su transformación puede ser confirmada por un microscopio estéreo fluorescente. En este momento, extirpar las raíces nativas de cada planta, y transferir las plantas a una nueva placa cuadrada con medio de LAMAS, complementado con cefotaxime sódico para matar a los A.rhizogenes.Para obtener una planta compuesta, dejar crecer las raíces peludas transgénicas durante otras tres a cuatro semanas en el medio de la MS, complementado con cefotaxime sódico. Para la transformación de plantas utilizando A.tumefaciens. Cortar y colocar una hoja de una planta de tres a cuatro semanas de edad en un plato de petri, y utilizar un bisturí para hacer de uno a tres cortes transversales desde el centro de la hoja a los bordes sin cortar las piezas de la hoja.y excluir el pecíolo. Coloque inmediatamente la hoja en un plato de petri que contenga 10 mililitros de medio líquido 2MS fresco, lado abaxial hacia arriba, y cubra la placa. Agregue rápidamente 80 microlitros del cultivo A.tumefaciens al medio líquido y revuelva suavemente el medio durante un minuto para distribuir homogéneamente la solución bacteriana.A continuación, selle cuidadosamente y cubra la placa con papel de aluminio para una incubación de dos días en una cámara Celsius de 24 grados. Al final del período de transformación, transfiera las hojas del lado abaxial hacia arriba, al medio inductor insensible, raspado con pinzas para una incubación de una semana en el gabinete de crecimiento. Al final de la incubación, transferir las hojas, lado abaxial hacia arriba, en el medio inductor de brotes raspados de pinza, e incubar las hojas en un gabinete de crecimiento.Cuando los conductos emergidos miten alrededor de dos centímetros de altura, corte tres conductos emergentes de cada insensible. Coloque hasta cinco eventos de transformación de conductos diferentes en frascos de cultivo individuales que contengan un medio MG complementado con cefotaxima sódico para permitir el enraizamiento, y etiquete el subconjunto como apropiado para una incubación de tres a cuatro semanas en el gabinete de crecimiento hasta que los conductos sean vigorosos. Al final de la incubación, seleccionar la planta más vigorosa de cada evento, y cortar los segmentos apicales del conducto con tres a cuatro internodos de cada planta.Colocar los segmentos en un matraz de cultivo que contenga 2MS medio complementado con cefotaxima sódico y cultivar las plantas hasta que desarrollen conductos y raíces vigorosas. Para realizar un ensayo genético de reportero histoquímico beta-glucuronidasa o GUS, fije las raíces de un cultivo vegetal in vitro de dos a tres semanas con acetona 90% refrigerada durante 20 minutos en hielo. Al final de la fijación, lave las raíces dos veces en agua destilada y trate las raíces con una solución fresca de tinción de GUS al vacío durante 20 minutos.Al final del tratamiento al vacío, coloque las raíces en 37 grados celsius en la oscuridad durante unas cuatro horas. Cuando un color azul es visible, lave las raíces dos veces con 70% de etanol, y visualice la tinción bajo un microscopio de campo brillante. Las raíces peludas transformadas exhiben una florescencia roja cuando se ilumina con luz verde, mientras que el agrobacterium no transformado de control negativo no demuestra tal florescencia, lo que indica la idoneidad del marcador de transformación rojo DS para identificar raíces peludas transgénicas.Aquí, se muestran manchas GUS en raíces de plantas transgénicas obtenidas por A.tumefaciens y raíces peludas transgénicas obtenidas por A.rhizogenes. Como se observa, las raíces transformadas con A, tumefaciens y cultivadas in vitro, demuestran manchas azules en la endodermis, una capa celular entre la corteza y la estela. En raíces más desarrolladas, el etiquetado azul es irregular en la capa externa, correspondiente a la exodermis.En raíces peludas transformadas obtenidas por A.rhizogenes, y cultivadas en hidroponía, el marcador GUS se encuentra específicamente dentro de la endodermis en la aparición de raíces laterales en las zonas heridas y en la exodermis. Además de ser un método rápido, las raíces transgénicas obtenidas con agrobacterium rhizogenes también llevaron el ADN del plásmido inductor de raíces, que puede desregular algunos procesos directamente controlados. Las raíces peludas transgénicas obtenidas con agrobacterium rhizogenes se pueden mantener mientras disparan, pero alternativamente pueden estar en el lugar hasta que se propaguen in vitro para la producción masiva de tránsito.La transformación de la patata proporciona una buena herramienta para comprobar la función genética y la activación del promotor, y también para producir reglas metodológicas en una especie de alto interés agronómico. El organismo modificado genéticamente debe desecharse de forma segura después de su uso para evitar la contaminación ambiental. Además, la solución de gas contiene derivados tóxicos de cianuro, por lo que la protección contra el desgaste y deseche la solución de forma segura.

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