Name: Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende a construir una cámara de estimulación eléctrica reutilizable y de bajo costo para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales in vitro. Este método facilita la investigación en ingeniería de tejido óseo.

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Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de puesta en marcha de la Fundación AO (S-14-03 H) y la Fundación de Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) con sede en Fráncfort del Meno, Alemania.

1. construcción del compartimiento de la cultura de la estimulación eléctrica de la célula
<ol><li>Para construir la cámara EStim, recoger dos tapas de placas de cultivo estándar celular 6-bien; cable 99.99% platino, 60 cm de longitud con un diámetro de 0,5 a 1 mm; alambre de cobre recubierto de plata, 70 cm de longitud con un diámetro de 0,6 mm; alicates de corte; kit de soldador; un tubo de pegamento superconductor; conector del bloque de terminal de un cable, pequeño seis 2,2 V LED (opcional); un tubo de pegamento de silicón no corrosivo capa (opcional); un rollo de cinta aisladora negra; estándar, flexible, con aislamiento cables eléctricos cobre (0,14 mm2), 2 m de largo (tabla de materiales).</li>
	<li>En una tapa de placa de 6 pozos, marca y luego perfore dos agujeros (con un diámetro de ~ 1 mm), 25 mm., cerca del borde externo de cada uno de los seis pozos (12 agujeros en total), como se muestra en la figura 1A, B.</li>
	<li>Cortar 12 tiras de 5 cm de alambre de platino con alicates de corte. Cada uno de los cables manualmente en forma de L, dejando 3 cm de largo uno de los extremos de la curva y los otros 2 cm. Corte el cable revestido de plata en dos longitudes de 35 cm.</li>
	<li>Inserte el extremo doblado del más largo (3 cm) de un alambre de platino (de dentro hacia fuera) en cada orificio taladrado, dejando 1-2 mm que sobresale de la parte exterior de la tapa, lo doble con unas pinzas. Asegure los alambres de platino en los agujeros de la tapa con pegamento de superconductor y dejarlo secar por alrededor de 6 horas.</li>
	<li>Las puntas de los alambres de platino seis (que más tarde servirá de cátodos, ver figura 1A) de la soldadura que sobresale de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata. Repita el mismo procedimiento, soldar los cables de platino seis restantes (que más tarde servirá de ánodos) al otro cable revestido de plata.<ol>
<li>Añadir LEDs en el circuito entre cada uno de los seis pares de electrodo de platino de ánodo-cátodo, para confirmar la funcionalidad durante los experimentos (opcionales). Coloque un pedazo de cinta negra debajo de cada LED para evitar exponer a las células en las placas de la cultura a la luz de LED (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pegar el cable conector del bloque terminal en la esquina superior izquierda de la tapa de placa de 6 pozos y Conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada, como se muestra en la figura 1.</li>
	<li>Corte una sección de 20 x 20 mm de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de 6 pozos (figura 1B, la tapa no. 2) para el conector del bloque de terminal en la primera tapa. Cubre la primera tapa, equipada con electrodos, con la segunda tapa y pegarlas con cinta adhesiva.<ol>
<li>Para mejorar la vinculación de las dos tapas, use adhesivo de silicona capa (opcional). Para ello, cubra la tapa con los electrodos de plata con una capa de 3-5 mm de silicona adhesivo y cubrir con la tapa, permitiendo a 12 h para que el adhesivo se seque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar para los terminales de salida del conector del cable y los otros extremos a conectores macho banana (4 mm). Nota: La longitud de los cables depende de la distancia de la plataforma en la incubadora, donde las células se mantendrá, a la alimentación, fuera de la incubadora (figura 1).</li>
	<li>Ajustar la dosis (voltaje) y régimen de EStim entregado a las células mediante la regulación de la fuente de alimentación.<ol>
<li>Encienda la alimentación presionando el botón ON/OFF en el panel frontal. Activa canal 1 pulsando el botón 1.</li>
		<li>Pulse la tecla nº 4 (V-set) para ajustar la tensión. Pulse botones de 2, . y 5 para ajustar la salida de carga en 2.5 V. Oprima Enter.</li>
		<li>Asegurar que la salida de carga de 2,5 V (2.500 mV) corresponde a un EStim de 100 mV/mm, según la ecuación siguiente, simplificada. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; o V = VEStim × d Aquí V = el voltaje de alimentación de la salida de milivoltios; d = distancia entre electrodos en milímetros; V EStim = el voltaje de estimulación en milivolts por milímetro. Nota: Esta simplificación se aplica sólo en caso de voltaje de DC constante. La resistencia entre el medio y las células es insignificante ya que los electrodos no están en contacto directo con las células; en cambio, EStim se entrega a las células a través del medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenquimatosas células cultura en medio osteogénico
<ol><li>Comprar y almacenar MSCs rata comercialmente disponibles (véase Tabla de materiales) en nitrógeno líquido hasta el día del experimento. Por otra parte, aislamiento MSCs de otros animales según protocolos había publicado7,8 según la normativa institucional local para el uso de animales de experimentación.</li>
	<li>En el día del experimento, saque el almacenamiento de nitrógeno líquido de un frasco (1 x 106 células) de MSCs y rápidamente (dentro de 1 min) descongelar las células en un baño de agua precalentada a 37 ° C.<ol>
<li>Bajo condiciones estériles en campana de flujo laminar, pipetee el contenido del frasco en un tubo falcon de 50 mL y añadir 9 mL de medio normal (NM) precalentado a 37 ° C, que consiste en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 1 x) con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina/estreptomicina. Sedimenten las células durante 5 min mediante centrifugación a 300 x g.</li>
		<li>En campana de flujo laminar, quite el sobrenadante y con cuidado Resuspender el precipitado de células en 12 mL de NM precalentada a 37 ° C. Transferir las células resuspendidas a un matraz de cultivo de células T-75.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Las células a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 de la cultura hasta llegar a una confluencia del 80% – 90% (después de aproximadamente 3 a 5 días).</li>
	<li>Las células de paso. Nota: Realice todas las operaciones excepto la centrifugación e incubación en condiciones estériles en campana de flujo laminar.<ol>
<li>Después de alcanzar una confluencia del 80% – 90%, recuperar las células con solución de separación celular. Aspirar el medio de cultivo celular, lavar 2 x 1 x tampón fosfato solución salina (PBS), añadir 5 mL de solución de separación celular 1 x y vuelva las células a la incubadora durante 5 minutos.</li>
		<li>Una vez que las células son separadas, añadir una cantidad igual de medio de cultivo para inactivar la solución de la separación. Recoger las células en un tubo falcon de 50 mL y centrifugado a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Descartar el medio y resuspender las células en 1 mL de medio fresco normal. Evaluar el número de células viables con el colorante azul de trypan.</li>
		<li>Semilla 1 x 106 células en un nuevo frasco de T-75 con 12 mL de NM precalentada. Las células a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 de la cultura hasta llegar a un 80% – 90% de confluencia. Nota: Celular pases (medidas 2.4.1–2.4.4) se puede repetir varias veces hasta obtener la cantidad necesaria de células. No utilice las células mayores de paso 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 células de semilla 9 x 10 3 ml de NM (10% suero bovino fetal inactivado con calor, 1% de penicilina/estreptomicina, DMEM) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos. Incube las células durante 1 día a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.</li>
	<li>Al día siguiente, aspirar el medio de cultivo y aplicar 3 mL de medio de diferenciación osteogénica (OM; normal suplementado con 10-7 M de dexametasona, glicerofosfato-β de 10 mM y 0.05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato).</li>
	<li>Coloque la placa de 6 pozos con células en la incubadora e incubar a 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 durante la noche.</li>
</ol>3. tratamiento de MSCs con EStim
<ol><li>El día que las células se tratan con EStim, esterilizar los electrodos en solución de etanol 70% durante 30 minutos; Luego, secar bajo la luz en un gabinete durante una 30 minutos adicionales de seguridad UV.</li>
	<li>En campana de flujo laminar, cubra la placa de 6 pozos con MSCs cultivadas con tapa equipada con electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio (si es necesario, añadir medio). La placa de 6 pozos cubierta (EStim cámara) con las células de transferencia a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación.</li>
	<li>Establecer la fuente de alimentación a la salida de carga de 2,5 V y tratar las células con EStim para 1 h3,9.</li>
	<li>Después de la estimulación, desconecte la alimentación y extraiga la cámara EStim de la incubadora. Bajo condiciones estériles, intercambiar la tapa consta de electrodos con una tapa estándar placa de 6 pozos.</li>
	<li>Vuelva las células a la incubadora y dejar toda la noche. Limpiar los electrodos, primero con el PBS y luego con solución de etanol al 70%. Limpiar los productos de corrosión acumulados desde la superficie del electrodo con papel de lija fino.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1 a 3.5 durante 6 días consecutivos. El día 4, antes de aplicar EStim y bajo condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo por aspiración 1,5 mL de medio y reemplazarlo con 1,5 mL de OM. fresco precalentado</li>
	<li>Después de aplicar EStim durante 7 días consecutivos, mantener las células en cultivo por un adicional de 7 días, cambiar el medio cada 3-4 días.</li>
</ol>4. medidas de diferenciación osteogénica
<ol><li>Analizar cambios de morfología de la célula bajo el microscopio.</li>
	<li>Para evaluar el efecto de EStim en MSC Diferenciación osteogénica medida deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos, como describe en otra parte3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos la construcción de una cámara y un método para el tratamiento de células madre mesenquimales con EStim que se traduce en mayor diferenciación osteogénica.
La configuración de EStim presentada no requiere equipo especial/conocimientos y se puede realizar en un laboratorio de Biología/Bioquímica de la célula de vástago estándar por jóvenes investigadores. Sin embargo, al construir y utilizar la cámara EStim, especial debe tener cuidado en algunos pasos críticos. Al manipular los...

Un aumento de traumas o defectos óseos inducidos por la enfermedad son tratados con diferentes combinaciones de tecnologías de la medicina regenerativa y terapia celular. MSCs son la célula de elección en estos tratamientos, debido a su relativamente alta actividad osteogénica, aislamiento y eficiencia de expansión y seguridad1. Para maximizar su actividad osteogénica y, así, optimizar su eficacia terapéutica, se han introducido varios métodos para manipular MSCs antes de su uso en estos tratamientos (ya revisado por Mauney et al.2). Un tal método es EStim, que se ha demostrado para mejorar la diferenciación osteogénica de MSC en vitro3 y promover hueso curativo en vivo4. A pesar del creciente número de estudios centrados en el tratamiento de MSCs con EStim, un régimen óptimo para maximizar el efecto pro-osteogénica de EStim todavía tiene que definirse.
Otros métodos in vitro utilizando EStim utilizan puentes de sal sumergidos en el medio de cultivo, que separa las células de electrodos metálicos5. La ventaja es que entrega EStim a través de puentes de sal elimina la introducción de subproductos químicos (por ejemplo, corrosión de los electrodos metálicos) que pueden ser citotóxicos. A pesar de esta ventaja, puentes de sal son engorrosos para trabajar con, y EStim que difiere de la que en los modelos in vivo, lo que es difícil correlacionar los resultados obtenidos al utilizar los dos sistemas. Configuraciones que EStim vía los electrodos metálicos o carbono fijados dentro de los pozos de la cultura de célula (ya revisado por Tupaj Hronik y Kaplan6) simulan mejor los dispositivos usados en vivo; sin embargo, estos dispositivos son difíciles de limpiar/esterilizar entre los usos y el número de células que pueden ser estudiados por experimento está limitado. Diseñamos la cámara EStim presentada específicamente para hacer frente a las limitaciones de estas otras configuraciones. Aunque la mayor parte de nuestra experiencia con esta cámara EStim ha sido con 2D y 3D culturas que contiene médula ósea adiposo-tejido-derivadas y MSCs3,4, una gran ventaja de esta cámara es es versátil y, con relativamente menores cambios, pueden ser adaptados a otros tipos celulares bajo una variedad de diferentes condiciones de estudio.
Aquí describimos la construcción de una sala de cultura de célula EStim; Luego, se demuestra su uso por MSCs tratando con diferentes regímenes de EStim y medir el efecto resultante sobre la diferenciación osteogénica. Diferenciación osteogénica MSC es evaluada a través de la deposición de calcio, actividad de la fosfatasa alcalina y expresión génica de marcadores osteogénicos. Lo importante, más allá de experimentos que utilizan esta configuración, observamos que estos efectos pro-osteogénica persisten mucho después de que se suspendió el tratamiento de EStim.

<table><tbody><tr><td>Estim fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector banana/adaptador Jack</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 piezas</td></tr><tr><td>Alicates de corte</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación DC (0-30V/0-3A)</td><td>B& K Precision</td><td>Modelo 9130B</td><td>Se puede utilizar cualquier modelo simulado</td></tr><tr><td>Alambres flexibles aislados (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 piezas</td></tr><tr><td>Caucho de silicona no corrosivo</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>* se puede comprar en muchas tiendas</td></tr><tr><td>Alambre de platino (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m necesarios para 1 cámara Estim</td></tr><tr><td>solución de etanol al 70%</td><td>cualquier</td><td></td><td>Esterilización de la cámara Estim</td></tr><tr><td>Alambre de cobre recubierto de plata (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 70 cm necesarios para 1 dispositivo Estim</td></tr><tr><td>Juego de soldadores</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>Se puede utilizar cualquier modelo de simulación</td></tr><tr><td>Tapa de placa TPP de 6 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 tapas para cámara Estim</td></tr><tr><td>LEDs circulares con cable de 2,2 V</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 piezas</td></tr><tr><td>UHU Super pegamento</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>* podría comprarse en muchas tiendas</td></tr><tr><td>MSC cultivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerofosfato sódico sal hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>cultivo celular osteogénico</td></tr><tr><td>DMEM, bajo en glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Thermo-Fischer </td><td>Cultivo celular</td><td>14190144</td> científico</tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>cultivo celular osteogénico</td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Cultivo celular 10500064 Thermo-Fischer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific 50 ml Tubo Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>cultivo</td></tr> <tr>celular osteogénico<td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Células madre mesenquimales de rata Sprague-Dawley (SD), origen en médula ósea</td><td>Cultivo celular</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td></tr><tr><td>Solución de desprendimiento celular</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>cultivo celular, desprendimiento celular</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Placas TPP de 6 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA Cultivo celular</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano, solución al 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>recuento de células</td></tr></tbody></table>

construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales in vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Células madre/estromales mesenquimales (MSCs) se han utilizado extensivamente para promover el hueso curativo en enfoques de ingeniería de tejidos. Estimulación eléctrica (EStim) se ha demostrado para aumentar la diferenciación osteogénica de MSC in vitro y promover hueso curativo en ajustes clínicos. Aquí describimos la construcción de una cámara de cultivo celular de EStim y su uso en el tratamiento de MSC de médula ósea para mejorar la diferenciación osteogénica de la rata. Se encontró que el tratamiento de MSCs con EStim durante 7 días da lugar a un aumento significativo en la diferenciación osteogénica, y lo importante, este efecto osteogénico pro persiste mucho tiempo después (7 días) EStim. Este enfoque de pretratamiento de MSCs con EStim para mejorar la diferenciación osteogénica podría utilizarse para optimizar los resultados del tratamiento de recreando el tejido del hueso y, así, ayudarles a alcanzar su potencial completo terapéutico. Además de esta aplicación, esta EStim compartimiento de la cultura de célula y protocolo pueden también utilizar para investigar otros comportamientos de célula EStim-sensibles, tales como la migración, proliferación, apoptosis y accesorio del andamio.

Para evaluar el efecto de 100 mV/mm de EStim en la diferenciación osteogénica de MSCs, las células tratadas con EStim para 3, 7 y 14 días o no tratada (control) fueron analizadas en el día 14 de cultivo mediante la evaluación de cambios morfológicos y la deposición de calcio (figura 2 ). Esto fue hecha por las células mediante microscopía de campo brillante (cambios de morfología) la proyección de imagen o por fijación de células en solución de paraformaldehí...

Aquí presentamos un protocolo para la construcción de una cámara de cultivo celular diseñada para exponer distintos tipos de estimulación eléctrica y su uso en el tratamiento de células madre mesenquimales para realzar la diferenciación osteogénica de las células.

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Aquí, mostramos cómo construir una cámara de estimulación eléctrica utilizando seis placas comunes de cultivo de pared, y cómo usarla para estimular la diferenciación osteogénica en células madre mesenquimales. Esta cámara es fácil y no costosa de construir, y se puede reutilizar en múltiples experimentos. Después de ser pretratado con estimulación eléctrica en nuestra cámara, las células madre mesenquimales se pueden utilizar para mejorar los resultados en los tratamientos de ingeniería de tejido óseo.Esta cámara también se puede utilizar para investigar otros tipos de células y comportamientos celulares electrosensibles como la migración, la proliferación, los cambios en el potencial de la membrana, la apoptosis y la fijación cuidadosa. En una tapa de placa de seis pozos, marque y luego taladre dos agujeros de un milímetro de diámetro, separados por 25 milímetros, cerca del borde exterior de cada uno de los seis pozos. A continuación, corte un alambre de platino en secciones de 12 cinco centímetros de largo.Dobla manualmente cada sección de cinco centímetros en forma de L, dejando un extremo de tres centímetros de largo, y los otros dos centímetros de largo. Luego, corte el alambre recubierto de plata en dos longitudes de 35 centímetros. Inserte el extremo doblado más largo de un alambre de platino en el agujero perforado, dejando de uno a dos milímetros sobresaliendo del exterior de la tapa.Doblarlo usando fórceps. Después, fije los cables de platino en los orificios de la tapa con pegamento superconductor y déjelos secar durante aproximadamente seis horas. Para preparar los cátodos, suelde las puntas de los seis cables de platino que sobresalen de la tapa a uno de los cables recubiertos de plata.Para preparar los ánodos, suelde los seis alambres de platino restantes a otros cables recubiertos de plata. Posteriormente, agregue LED en el circuito entre cada uno de los seis pares de platino-electrodo de ánodo-cátodo para confirmar la funcionalidad. Coloque un pedazo de cinta de aislamiento negro debajo de cada LED para evitar exponer las células de las placas de cultivo a la luz LED.A continuación, pegue el conector del bloque de terminales de alambre a la esquina superior izquierda de la tapa de la placa de seis pozos y conecte ambos cables recubiertos de plata a los terminales de entrada. A continuación, corte una sección cuadrada de 20 milímetros por 20 milímetros de la esquina superior izquierda de una segunda tapa de placa de seis pozos, para acomodar el conector de bloque de terminales en la primera tapa. Cubra la primera tapa, equipada con los electrodos, con la segunda tapa, y fíbralos junto con cinta adhesiva.Conecte un extremo de los dos cables de cobre aislados estándar a los terminales de salida del conector de cable y los otros extremos a conectores macho de plátano. Encienda la fuente de alimentación pulsando el botón ON-OFF del panel frontal. Active el canal uno pulsando el botón uno.Después, pulse el botón cuatro para ajustar la tensión. Ajuste la salida de carga a 2,5 voltios. A continuación, pulse Intro.El día en que las células son tratadas con tallo E, esterilizar los electrodos en 70%solución de etanol durante 30 minutos. Luego, séquelos bajo luz UV en un armario de seguridad durante 30 minutos adicionales. En una campana de flujo laminar, cubra la placa de seis pozos que contiene los MSC cultivados con la tapa equipada con los electrodos, asegurándose de que los electrodos estén completamente sumergidos en el medio.Luego, transfiera la placa cubierta de seis pozos con las células a la incubadora y conecte sus cables a la fuente de alimentación. A continuación, establezca la fuente de alimentación en una salida de carga de 2,5 voltios y trate las células con el vástago E durante una hora. Después de la estimulación, desconecte la fuente de alimentación y retire la cámara del vástago E de la incubadora.En condiciones estériles, reemplace la tapa, equipada con electrodos, con una tapa de placa estándar de seis pozos. Posteriormente, devuelva las células a la incubadora y déjelas durante la noche. Limpie los electrodos, primero con PBS y luego con una solución de etanol al 70%.A continuación, limpie los productos de corrosión acumulados de la superficie del electrodo con papel de lija fino. Repita el tratamiento del tallo E durante seis días consecutivos. El cuarto día, antes de aplicar la estimulación eléctrica, y en condiciones estériles, cambiar el medio de cultivo aspirando 1,5 mililitros de medio y sustituyéndolo por 1,5 mililitros de medio de diferenciación osteogénico fresco precalentó.Después de aplicar la estimulación eléctrica durante siete días consecutivos, mantener las células en cultivo durante siete días adicionales, intercambiando el medio cada tres a cuatro días. Cuando se complete el tratamiento, analice los cambios de morfología celular bajo un microscopio. Para evaluar el efecto de la estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, mida la deposición de calcio, la actividad de fosfatasa alcalina y la expresión génica del marcador osteogénico, como se describe en otros lugares.Para evaluar el efecto de 100 milivoltios por milímetro de estimulación eléctrica en la diferenciación osteogénica de MSC, las células tratadas con estimulación eléctrica durante tres, siete y 14 días y las células no tratadas, se analizaron en el día 14 del cultivo mediante la evaluación de los cambios morfológicos y la deposición de calcio. Los cambios significativos en la morfología celular y los depósitos de calcio fueron visibles en las células tratadas con estimulación eléctrica durante siete y 14 días. Se realizó un análisis detallado de los cambios osteogénicos de la expresión génica del marcador en los días tres, siete y 14 del cultivo.En el séptimo día de cultivo, la expresión De RunX2 fue significativamente mayor en células tratadas con estimulación eléctrica durante siete días. Mientras que la expresión de Colla1 fue significativamente mayor en las células tratadas durante siete días, medidas en el día 14 del cultivo. La expresión de osteopontina se incrementó significativamente en las células estimuladas eléctricamente en los días tres, siete y 14 del cultivo.La expresión de Osterix estaba ausente en las células de control en todos los puntos de tiempo, y sólo se vio a los siete y 14 días de cultivo en células expuestas a la estimulación eléctrica. La cámara de estimulación eléctrica es relativamente fácil de construir. Sin embargo, se debe tener especial cuidado al manipular los cables de platino, y también al limpiar y esterilizar los electrodos.Las células pretratadas a la electricidad en nuestra cámara, solas o sentadas en un material de andamio, podrían implantarse en modelos animales, para estudiar cómo el efecto positivo de la estimulación eléctrica persiste in vitro. Esta técnica proporciona una herramienta simple pero potente para estudiar el mecanismo por el cual la estimulación eléctrica regula las funciones celulares. Este conocimiento puede estar disponible en células de medicina regenerativa.

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En general, se entiende que las fuerzas mecánicas en el cuerpo puede influir en la diferenciación y proliferación celular. Aquí se presenta un protocolo de vídeo que demuestra el uso de un biorreactor a medida para la entrega de tensión uniaxial de tracción cíclica a las células madre cultivadas en substratos flexibles micropatterned.

La estimulación mecánica de células madre utilizando tensión uniaxial cíclica

Este video demuestra el uso de un chip microfluídico recubierto de matriz extracelular para diferenciar células madre neurales y progenitoras o NPC a través de la estimulación eléctrica. Después de sembrarse y adherirse a la región recubierta, las NPC crecen y la aplicación de una corriente continua desencadena su diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Diferenciación inducida por estimulación eléctrica de células madre neurales y progenitoras

Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial de diferenciación hacia el linaje osteoblástico cuando se estimulan con factores solubles o biomateriales específicos. Este trabajo presenta una opción novedosa para la administración de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emplea la matriz ósea bovina Nukbone (NKB) como andamio.

El aislamiento de células madre mesenquimales humanas y su cultivo en la matriz del hueso poroso

El cultivo de células mesenquimales estromales humanas (hMSC) con suero autólogo, reduce los riesgos de rechazo por el material xenogénico y otros efectos negativos. También permite la recuperación de un subconjunto de progenitores mesodérmicos, que puede entregar hMSCs frescas. Incorporación de hMSCs en un coágulo de fibrina autóloga permite un manejo fácil y efectiva implantación quirúrgica.

Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Aquí presentamos un protocolo para la formación de una población celular mediante estímulos eléctricos y mecánicos, emulando la fisiología cardiaca. Esta estimulación electromecánica realza el potencial cardiomiogenético de las células tratadas y es una estrategia prometedora para la terapia celular más, modelado de la enfermedad y drogas.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

Este protocolo describe el proceso paso a paso para construir estimuladores eléctricos y magnéticos utilizados para estimular los tejidos biológicos. El protocolo incluye una directriz para simular campos computacionalmente eléctricos y magnéticos y la fabricación de dispositivos estimuladores.

Dispositivos eléctricos y de campo magnético para la estimulación de tejidos biológicos

La terapia ósea a través de la osificación endocondral mediante la implantación de tejido cartilaginoso artificial producido a partir de células madre mesenquimales tiene el potencial de eludir los inconvenientes de las terapias convencionales. Los hidrogeles de ácido hialurónico son eficaces para escalar injertos de cartílago uniformemente diferenciados, así como para crear hueso integrado con vascularización entre injertos fusionados in vivo.

Formación ósea integrada a través de la osificación endocondral in vivo utilizando células madre mesenquimales

Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

Aprende a construir una cámara de estimulación eléctrica reutilizable y de bajo costo para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales in vitro. Este método facilita la investigación en ingeniería de tejido óseo.

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro (Video) | JoVE Journal

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

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