Name: Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprende a realizar ensayos de hojas independientes para estudiar la expresión génica en papa durante la herbivoría por Manduca sexta. Este método simplificado permite obtener datos reproducibles sobre respuestas vegetales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores quieren agradecer a Bob Farrar y Alexis Park por proporcionar insectos utilizados en este estudio y por su experiencia en la puesta en escena larval. Gracias adicionales a Michael Blackburn y Saikat Ghosh por la revisión crítica del manuscrito.
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
USDA es un Proveedor y Empleador de Igualdad de Oportunidades.

NOTA: El siguiente protocolo está diseñado para que una persona configure, haga observaciones y recoja muestras. Se pueden combinar varias ejecuciones de la misma configuración para aumentar la replicación biológica. Cualquier repetición adicional del experimento debe configurarse a la misma hora del día para eliminar posibles influencias diurnas en la expresión génica. El protocolo está diseñado para crear 3 hojas 'infestadas' para 5 puntos de tiempo de cosecha separados. Las hojas de control coincidentes para cada punto de tiempo crean un total de 30 muestras. El experimento se puede realizar con una variedad de tamaños de hojas y etapas larvales, pero se recomienda que el tamaño de la hoja, la etapa larval y el tiempo de infestación sean consistentes durante todo el procedimiento.
1. Preparación de las plantas de patata
NOTA: Todos los pasos que requieren técnica estéril deben realizarse en una campana de cultivo de tejido18,19.
<ol><li>Prepare las plantas de Kennebec de la fuente explantada.<ol>
<li>Prepare el medio de propagación.<ol>
<li>Añadir 4,43 g de Murashige y Skoog (MS) con vitaminas en polvo, 20 g de sacarosa y 2 g de sustituto de agar a 1 L de agua purificada con ósmosis inversa (RO) en un matraz de 2 L con barra de espín. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando NaOH mientras continúa revolviendo. NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave.</li>
			<li>Añadir 1 ml de conservante/biocida y autoclave en ciclo líquido durante 20 min (121oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de medio de propagación estéril y refrigerado a recipientes de cultivo estériles (por ejemplo, Magenta o Plantcon) utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar el material de la explantación.<ol>
<li>Obtener fuente explantar como papas de semilla kennebec y eliminar todos los restos de tierra mediante el lavado con grifo H2O. Retire los brotes y cortar en trozos de 2 cm con un bisturí estéril.</li>
			<li>Esterilice las piezas del brote empapando durante 15 s en 70% de etanol, seguido de 13 min en 1:1 lejía (1 parte de RO-agua: 1 parte de lejía germicida/comercial concentrada). Enjuague 5 veces en H2O estéril.</li>
			<li>Transfiera el material explantativo a recipientes de cultivo de tejido estéril con medio de propagación en una campana de cultivo de tejido utilizando una técnica estéril. Transfiera los recipientes a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 a 2o123 semanas o hasta que se formen plantlets a 24oC, 16 h de luz (140 m-2os-1)/8 h fotoperiodo oscuro.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar plantas de papa sin tejido sintraidos.<ol>
<li>Prepare el medio de transferencia nodal. NOTA: Esto hará 10 vasos de cultivo de tejido que pueden ser utilizados el mismo día o pueden ser hechos con anticipación y almacenados a 4 oC hasta la transferencia nodal.<ol>
<li>Añadir 36,43 g de mezcla de agar nutritivo a 1 L de agua purificada por RO en un matraz de 2 L con una barra de centrifugado. Transfiera el matraz a una placa de revolvición y mezcle. Ajuste el pH a 5.8 usando KOH mientras continúa agitando. NOTA: El agar no se disolverá hasta que se autoclave.</li>
			<li>Autoclave en ciclo de líquido durante 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirar el medio del autoclave inmediatamente después de que el ciclo haya terminado y enfriarlo a 50 oC. Transfiera 100 ml de recipientes de cultivo nodal refrigerados estériles a recipientes de cultivo estériles (ver la Tabla de Materiales)utilizando técnica estéril en una campana de cultivo de tejido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepara esquejes nodal.<ol>
<li>Obtener los plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado (producido en el paso 1.1.2). Las plantlets deben tener al menos de 3 a 4 nodos (puntos de bifurcación). Retire las hojas con tijeras estériles o bisturí. Cortar las ramas cerca del tallo principal, dejando alrededor de 2 mm de tejido de rama.</li>
			<li>Retire las secciones nodal del tallo cortando aproximadamente 2 mm por encima y por debajo de cada punto de rama o nodo. Organizar esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga medio de transferencia nodal (producido en el paso 1.2.1.2) en la misma orientación que en el recipiente anterior (rama apuntando hacia arriba).</li>
			<li>Transfiera los recipientes con esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal y crezca durante 2 u20123 semanas a 24 oC, 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro. NOTA: Cada corte nodal crecerá hasta convertirse en una nueva planta. El número de esquejes en cada recipiente determina el tamaño de la hoja. Menos esquejes transferidos por recipiente darán lugar a hojas más grandes. Tres plantas por recipiente tendrán hojas de 15 mm x 20 mm en 2 u20123 semanas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>(Opcional) Preparar plantas de patata Kennebec cultivadas en el suelo. NOTA: Para producir hojas más grandes, las plantas de papa sin extensión de nodal se pueden transferir al suelo.<ol>
<li>Transfiera las plantas de patata cultivadas en el medio de transferencia nodal medio a tierra tirando suavemente de la planta del medio hasta que todo el tejido radicular se libere del agar.</li>
		<li>Transfiera al suelo justo por encima del 1o nodo de las raíces y empaque ligeramente el suelo alrededor del trasplante. Sube suavemente para asegurar el contacto del suelo con el sistema radicular.</li>
		<li>Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y temperaturas diurnas/nocturnas de 25/20 oC. NOTA: Las plantas están listas cuando las dos hojas completamente expandidas han alcanzado el tamaño adecuado para el ensayo.</li>
	</ol></li>
	<li>(Opcional) Preparar plantas de patata cultivadas con tubérculos. NOTA: Las plantas de patata cultivadas a partir de tubérculos son más grandes y robustas y pueden ser útiles si se crían larvas en las plantas o si se desea alimentar la larvadurante durante la noche.<ol>
<li>Coloque un tubérculo de patata 6 en profundidad en una olla de 10 en maceta que contenga mezcla de suelo complementada con fertilizante de liberación lenta de 10 ml de pellets.</li>
		<li>Colocar en una cámara de crecimiento con 16 h de luz (140 m-2s-1)/8 h fotoperiodo oscuro y 25/20 oC de temperatura diurna/noche. Las plantas están listas aproximadamente a 30 o201240 días desde la plantación del tubérculo. NOTA: No utilice plantas que hayan comenzado a florecer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de insectos para la alimentación
<ol><li>Obtener la etapa larval deseada de M. sexta. NOTA: Las larvas para este estudio fueron criadas en dieta artificial hasta la 5a estrella20 y escenificadas por un individuo experimentado del insectiario interno. Las larvas también pueden criarse parcial o completamente en el tejido vegetal. Las larvas no comen inmediatamente antes de una muda y son más propensas a comer justo después de la muda, por lo que la puesta en escena adecuada es importante21.</li>
	<li>Transfiera las larvas a un recipiente de contención apropiado (por ejemplo, plato de cultivo de tejido de 6, 12, 24 pozos) dependiendo del tamaño de la larva. Debe haber una larva por pozo en el plato. NOTA: Las larvas pueden mostrar un comportamiento territorial o caníbal sin una fuente de alimento y pueden lesionarse si se alojan juntas.</li>
	<li>(Opcional) Las larvas de hambre durante hasta 2 h, ya que esto puede mejorar la alimentación larvaria. NOTA: Las larvas deben estar en un recipiente de contención almacenado en la cámara de crecimiento durante este tiempo.</li>
</ol>3. Configuración de componentes para el experimento de infestación
NOTA: Consulte el resumen esquemático de la Figura1.
<ol><li>Cree plantillas de ubicación para cada punto de tiempo de cosecha. NOTA: Es útil configurar 5 bandejas diferentes para cada punto de tiempo de cosecha. Esto mantiene las muestras organizadas y permite que los platos se muevan de manera más eficiente como un conjunto sin cambiar su disposición. Si se realizan cálculos porcentuales de daño, esto es esencial, ya que las imágenes anteriores y posteriores a la infestación deben capturarse a la misma distancia focal.<ol>
<li>Obtenga 5 bandejas robustas capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado y línea con papel blanco. NOTA: El tamaño de la placa Petri se basa en el tamaño de hoja elegido para el ensayo de alimentación. La hoja debe caber fácilmente en el plato sin tocar los lados. Por ejemplo, un plato de 60 mm x 15 mm es adecuado para hojas de hasta 50 mm de longitud o anchura.</li>
		<li>Trace un conjunto de seis círculos usando la placa Petri de tamaño adecuado en el papel en cada bandeja. Etiquete un conjunto de círculos 'control' A, B y C y el otro 'infestado' A, B y C. También etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Opcional) Configure una cámara para la captura de imágenes "antes de la infestación" y "después de la infestación".<ol>
<li>Asegure una cámara en un soporte en la distancia focal adecuada para la captura de imágenes de todos los platos Petri en la plantilla de colocación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiquetar los tubos de punto de tiempo de cosecha.<ol>
<li>Etiquete un conjunto de tubos de microcentrífuga de 30, 1,7 ml correspondientes a cada círculo en la plantilla de colocación. Etiquetar los tubos para identificar adecuadamente la perturbación (control/infestado), la carta de replicación de la planta (A, B o C) y el punto de tiempo de cosecha (número de minutos después del período de infestación).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare los platos de Petri elegidos en el paso 3.1.1.<ol>
<li>Coloque un disco de papel de filtro estéril en cada uno de los 30 platos Petri del paso 3.1.1. Añadir agua estéril para humedecer los discos; no permita que el exceso de agua se acuse en el plato. Coloque cada plato en cada uno de los seis círculos en cada plantilla de colocación.</li>
		<li>Coloque tres plantas de papa junto a cada plantilla de colocación. Asegúrese de que las plantas tienen la misma edad y tamaño relativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Realizar infestación
NOTA: Se configura una plantilla de punto de tiempo de cosecha/ubicación a la vez.
<ol><li>Retire las dos hojas superiores emparejadas de cada planta con tijeras estériles y coloque una hoja en la placa Petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta (A, B y C). Lleve a cabo este proceso lo más rápido posible.</li>
	<li>(Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar una imagen de "antes de la infestación".</li>
	<li>Transfiera las larvas a cada plato infestado usando fórceps suaves al tacto tan rápido como sea posible. Ajuste el temporizador para el tiempo de 'infestación' deseado. NOTA: El período de tiempo en que las larvas consumen el tejido de la hoja es el "tiempo de infestación". Esto es algo que se puede determinar empíricamente usando unas pocas hojas de prueba / larvas antes del inicio de la infestación real. El "tiempo de infestación" elegido debe ser consistente para todas las hojas infestadas. NOTA: Las larvas deben ser manipuladas con cuidado por fórceps suaves. De 2a a 4a instar puede ser agarrado suavemente por su cuerno o sección media.</li>
	<li>Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas estén comiendo. Las larvas deben añadirse/eliminarse en función del comportamiento de alimentación. Mantenga las tapas de los platos de Petri tanto como sea posible. NOTA: Se pueden utilizar varias larvas por hoja.</li>
	<li>Retire las larvas de las hojas al final del tiempo de infestación. Inicie el temporizador para el tiempo de cosecha.</li>
	<li>(Opcional) Transfiera la plantilla de colocación al soporte de la cámara para capturar la imagen "después de la infestación". NOTA: Las seis hojas en la plantilla de colocación se cosechan en el momento específico de la cosecha.</li>
</ol>5. Cosecha de hojas
<ol><li>Transfiera cada hoja al tubo etiquetado correspondiente al final de cada punto de tiempode cosecha y congele inmediatamente dejando caer el tubo en el líquido N 2. Almacenar el tejido vegetal cosechado a -80 oC hasta el aislamiento del ARN.</li>
	<li>Repita los pasos 4-u20125.1 para cada punto de tiempo de cosecha.</li>
</ol>6. Procesamiento del tejido de la hoja para el análisis de la expresión génica
<ol><li>Moler el tejido de la hoja congelada en un polvo con un micropsto.</li>
	<li>Aísle el ARN total y el proceso de expresión génica como se describió anteriormente22.</li>
</ol>7. (Opcional) Estimación del daño de las hojas
<ol><li>Calcule visualmente el porcentaje del daño de la hoja o calcule el área de la hoja en las imágenes antes y después de la infestación.</li>
	<li>Mida el área de la hoja con herramientas de software (por ejemplo, Fenofita)23.</li>
	<li>A partir de las mediciones del área de la hoja, calcule el porcentaje de daño como % de daño [(área de la hoja antes – área de la hoja después)/área de la hoja antes] x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMPs%2C+MAMPs%2C+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li>
<li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li>
<li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+in+the+plant+tissue%3A+the+defense+of+a+dangerous+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li>
<li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+Plant+Defenses%3A+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li>
<li>Chen, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li>
<li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li>
<li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+PLANTS%22%5BJournal%5D)">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li>
<li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li>
<li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate%3A+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li>
<li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li>
<li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li>
<li>Hjältén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+herbivory%3A+problems+and+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li>
<li>Lehtilä, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li>
<li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+the+evidence%3F+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li>
<li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li>
<li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Before+gene+expression%3A+early+events+in+plant-insect+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li>
<li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Research%22%5BJournal%5D)">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li>
<li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li>
<li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li>
<li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li>
<li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoPhyte%3A+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li>
<li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li>
<li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li>
<li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li>
<li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance%3A+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li>
<li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li>
<li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li>
<li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li>
<li>Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328(2014).</li>
<li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li>
<li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins%2C+specificity%2C+perception+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li>
<li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+wound+signaling+in+plants%3A+A+new+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li>
<li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li>
<li>Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018).</li>
<li>Great Lakes Hornworm. Products. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018).</li>
<li>The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/">http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/</a> (2018).</li>
<li>Raising Manduca sexta. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018).</li>
<li>Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de metodologías herbáceas de plantas enteras existentes no es necesario para lograr el objetivo de este estudio en particular (es decir, examinar un conjunto de genes candidatos para su respuesta a la infestación). El beneficio obvio del refinamiento de la hoja separada es acortar el tiempo que se tarda en realizar ensayos herbívoros. La naturaleza difícil de controlar de plantas enteras con jaulas de clip se elimina y los ensayos se realizan antes, ya que las plantas de tan solo 2 semanas se pueden utilizar para ...

Herbivory pone en marcha una serie de eventos moleculares durante los cuales una planta puede identificar el ataque y montar una respuesta apropiada para su supervivencia. Una planta recibe dos señales básicas de los insectos masticadores; uno por el daño físico al tejido y el otro a partir de sustancias específicas de insectos. Los patrones moleculares asociados al daño (DamP) se liberan en respuesta al daño creado por las partes bucales larvales y desencadenan una respuesta de herida bien definida que resulta en un aumento de la hormona ácido jasmónico y la transcripción de los genes de defensa1. Uno de los DamPs más conocidos es systemin, un polipéptido que se forma por el escote de la proteína prosystemin más grande después de que una hoja es herida2,3. La respuesta de la herida de ácido jasmónico se modula aún más por patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMPs), que pueden derivarse de saliva de oruga, contenido intestinal (regurgitante) y heces (frass)4. Los insectos utilizan estas sustancias para aumentar o evadir la respuesta de defensa5. Los factores de transcripción transmiten el mensaje de las señales hormonales en la respuesta de defensa a través de la regulación de los genes de defensa aguas abajo6,7,8.
Algunos estudios de interacción entre plantas y insectos utilizados en entornos de laboratorio son del tipo simulado, con el objetivo de aproximar el método natural de alimentación por el insecto. El herbívoro simulado generalmente se logra mediante la creación de daño artificial a los tejidos vegetales con varias herramientas que imitan el mecanismo específico de las partes bucales de insectos suficientes para causar la liberación de DAPP y desencadenar la producción de genes de defensa. Otros componentes específicos de insectos como las secreciones orales o regurgitante a menudo se añaden para replicar la contribución de los HAMPs9,10,11. La creación de un tamaño y tipo específico de herida y la aplicación de cantidades precisas de HAMPs es una ventaja para este tipo de estudios y puede ofrecer resultados más reproducibles. Los estudios herbívoros naturales, donde el daño al tejido vegetal se logra mediante la aplicación de insectos adquiridos en el campo o criados en laboratorio, a menudo son más difíciles porque el tamaño de la herida y las cantidades de HAMP se rigen por el comportamiento de los insectos y añaden variabilidad a la Datos. Los métodos naturales versus simulados y sus ventajas y desventajas están bien debatidas en la literatura12,13,14.
Para estudiar los primeros eventos de señalización, como los factores de transcripción, se debe consumir un cierto porcentaje de la hoja en un período relativamente corto de tiempo, por lo que las larvas deben comenzar a masticar inmediatamente y mantener el consumo hasta que la hoja se congele para su análisis. M. sexta es un alimentador voraz en múltiples plantas solanaceous durante muchas de sus etapas larvales, por lo que es ideal para impartir el máximo daño en un período relativamente corto de tiempo15. Esto es conveniente cuando se estudian los primeros eventos de señalización, ya que la respuesta de la planta ocurre casi inmediatamente después de que un insecto entra en contacto con la superficie de la hoja16,17. El método de contención de jaulas de clip comúnmente utilizado resulta torpe, ya que varias jaulas requerirían ajustes continuos a lo largo del experimento para permitir la eliminación o adición de larvas. Las hojas también deben ser lo suficientemente grandes y fuertes como para soportar la alimentación de múltiples insectos al mismo tiempo. Estos tipos de plantas de patata requieren una gran cantidad de espacio para observar la alimentación. Las larvas a menudo se reubican en la parte inferior de la superficie de la hoja, lo que también hace que las observaciones de alimentación sean bastante difíciles. El uso de plantas enteras para realizar estos experimentos es claramente engorroso.
El estudio actual utiliza hojas desprendidas aisladas en platos Petri en lugar de plantas enteras para agilizar y simplificar todo el enfoque vegetal para estudiar el herbívoro. La aplicación del protocolo en este estudio se limita a la observación de un grupo de factores de transcripción C2H2 inducidos temprano en las hojas de patata después del daño herbívoro por M. sexta larvas.

<table><tbody><tr><td>sustituto de agar</td><td>Laboratorios de Fitotecnología</td><td>G3251</td><td>el producto es</td></tr><tr><td>un recipiente de contención Gelzan (plato de 6, 12 o 24 pocillos)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>muchas otras empresas venden estos productos</td></tr><tr><td>huevos de manduca&nbsp;</td><td>Compañía de Suministros Biológicos de Carolina</td><td>143880</td><td>30-50 huevos</td></tr><tr><td>huevos de manduca&nbsp;</td><td>Gusano de los Grandes Lagos</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 o 500 huevos</td></tr><tr><td>larvas de manduca</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>llama para estadios larvales específicos solicita</td><td>cualquier</td></tr><tr><td>estadio larvas de manduca</td><td>gusano de los Grandes Lagos</td><td>llama para estadios específicos solicitudes de</td><td></td></tr><tr><td>microcentrífugas de estadio, 1.7 ml&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R22</td><td>estos han sido probados en N2 líquido y no explotarán</td></tr><tr><td>Murashige & Medio basal de Skoog (MS) con vitaminas</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M519</td><td>utilizado para hacer la mezcla de agar de nutrientes del medio de propagación</td></tr><tr><td></td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>el producto es Murashige & Medio basal Skoog con vitaminas, sacarosa y</td></tr><tr><td>discos de filtro de papel</td> Gelzan <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>09-805A</td><td>Círculos Whatman-comprar para encajar en</td></tr> placa de <tr><td>Petri placa de Petri, 60X15 mm o 100X15 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB0875713A o FB0875712</td><td>tamaño de compra apropiado para el tamaño</td>de</tr><tr><td>la hoja tubérculos de papa&nbsp;</td><td>cualquier</td><td>tamaño B (no orgánico)</td> <td>sugiere Maine Farmer' s Macetas de intercambio</td></tr><tr><td>, 10"&nbsp;</td><td>Suministros de invernadero Griffin, Inc.</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr><tr><td>conservante/biocida</td><td>Tecnología de células vegetales</td><td>El producto NA</td><td>es PPM (mezcla de conservantes vegetales)</td></tr> <tr><td>patatas de siembra para la fuente de explante</td><td>de cualquier</td><td>tamaño B (no orgánico)</td> <td>sugiere Maine Farmer' s Intercambio</td></tr> de <tr><td>fertilizante de liberación lenta (14-14-14 )</td><td>cualquier</td><td>NA</td><td>Osmocote es una marca popular</td></tr><tr><td>pinzas de tacto suave</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>mezcla de suelo</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>65-51121</td><td>el producto es el recipiente de cultivo estéril de mezcla Sunshine LC1</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Laboratorios de Fitotecnología</td><td>C2100</td><td>Recipiente tipo magenta,</td></tr><tr><td>recipiente de cultivo estéril PTL-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>ICN2672206</td><td>producto es MP Biomedicals Plantcon</td></tr></tbody></table>

ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos manduca sexta

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

La naturaleza multitrófica de los estudios de expresión génica de herbívoros de insectos exige un gran número de réplicas biológicas, creando la necesidad de protocolos herbáricos más simples y simplificados. Las perturbaciones de los insectos masticadores generalmente se estudian en sistemas vegetales enteros. Si bien esta estrategia de todo el organismo es popular, no es necesario si observaciones similares se pueden replicar en una sola hoja separada. La suposición es que los elementos básicos necesarios para la transducción de la señal están presentes dentro de la propia hoja. En el caso de los primeros acontecimientos en la transducción de la señal, las células sólo necesitan recibir la señal de la perturbación y transmitir esa señal a las células vecinas que se ensayan para la expresión génica.
El método propuesto simplemente cambia el momento del desprendimiento. En experimentos con plantas enteras, las larvas se limitan a una sola hoja que finalmente se separa de la planta y se ensaya para la expresión génica. Si se invierte el orden de la escisión, desde el último en estudios de plantas enteras, hasta el primero en el estudio separado, se simplifica el experimento de alimentación.
 Kennebec se propaga por transferencia nodal en un medio de cultivo de tejido simple y se transfiere al suelo para un mayor crecimiento si se desea. Las hojas se extircan de la planta madre y se trasladan a los platos de Petri donde el ensayo de alimentación se lleva a cabo con las etapas larvales de M. sexta. El tejido de la hoja dañado se ensaya para la expresión de eventos relativamente tempranos en la transducción de la señal. El análisis de la expresión génica identificó factores de transcripción Cys2-His2 (C2H2) específicos de la infestación, lo que confirma el éxito del uso de hojas desasociadas en estudios de respuesta temprana. El método es más fácil de realizar que las infestaciones de plantas enteras y utiliza menos espacio.

El consumo de hoja define el éxito del protocolo. Las larvas sanas y escenificadas con precisión deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante el tiempo de infestación. En el video1, la larva en la parte superior comienza a masticar inmediatamente después de la colocación y mantiene una velocidad constante durante la alimentación. Esto es especialment...

El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Este protocolo utiliza un enfoque simplificado para medir la expresión génica de la planta en respuesta al herbívoro de insectos. Mediante el uso de hojas separadas aisladas en platos Petri, los insectos son más fáciles de aplicar y monitorear durante el período relativamente corto de infestación contribuyendo a datos reproducibles de expresión génica. Este protocolo puede adaptarse a muchas interacciones entre plantas y insectos.si se consideran las observaciones de referencia de sistemas vegetales enteros. La naturaleza impredecible de la alimentación de insectos puede ser un desafío. Por lo tanto, un suministro confiable de larvas correctamente escenificadas y plantas sanas proporcionan la mejor oportunidad de éxito.Visualizar cómo deben aparecer y comportarse las plantas e insectos sanos es fundamental para lograr resultados óptimos, especialmente para los investigadores nuevos en el campo de estudio. Demostrando el procedimiento conmigo estará Frances Pérez, una bióloga molecular en el laboratorio de mejora genética de frutas y verduras. Para preparar plantas de patata de cultivo de tejido propagado nodal, primero obtenga plantlets Kennebec cultivados a partir de material explantado con al menos tres a cuatro nodos.Utilice una cuchilla estéril para eliminar las hojas cortando las ramas cerca del tallo principal y dejando alrededor de dos milímetros de tejido de rama por hoja. Corte aproximadamente dos milímetros por encima y por debajo de cada nodo para eliminar las secciones nodales de los tallos y organizar los esquejes nodales en un recipiente de cultivo de tejido estéril que contenga un medio de transferencia nodal con la rama apuntando hacia arriba. Luego transfiera los esquejes nodales a una cámara de cultivo de tejido vegetal para dos o tres semanas de crecimiento a 24 grados centígrados y un período de foto oscuro de 16 horas de luz y ocho horas.Para preparar los insectos para la alimentación, obtener la etapa larval deseada de M.sexta y transferir una larva a cada pozo de un recipiente de contención apropiado de acuerdo con el tamaño de la larva. Haga plantillas de colocación para cada punto de tiempo de cosecha utilizando cinco bandejas resistentes capaces de sostener un conjunto de seis platos Petri de tamaño adecuado forrados con papel blanco. Trace un conjunto de seis círculos usando el plato Petri del tamaño adecuado en el papel en cada bandeja y etiquete un conjunto de círculos control A, B y C y el otro infestado A, B y C.Then etiquete cada plantilla de colocación con el tiempo de cosecha adecuado.A continuación, etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para cada círculo de la plantilla de colocación para identificar adecuadamente la perturbación, la letra de replicación de la planta y el punto de tiempo de cosecha. Cuando todos los tubos hayan sido etiquetados, coloque un disco de papel de filtro estéril en un plato de Petri por plantilla y humedezca los discos con agua estéril sin dejar que el exceso de líquido se acose en cada plato. A continuación, coloque un plato en cada círculo en cada plantilla de colocación y coloque tres plantas de papa de la misma edad y tamaño relativo junto a cada plantilla de colocación.Para iniciar la infestación, utilice tijeras estériles para eliminar las hojas superiores de dos tamaños de cada planta y coloque una hoja en el plato petri de control y una en el plato Petri infestado para cada planta lo más rápido posible. Cuando se hayan colocado todas las hojas, utilice fórceps táctiles suaves para transferir al menos una larva a cada plato infestado lo más rápido posible y ajuste el temporizador para el tiempo de infestación deseado. Observe la alimentación para asegurarse de que todas las larvas están comiendo, reemplazando cualquier larva no alimentada según sea necesario.Retire todas las larvas de todas las hojas al final del tiempo de infestación e inicie el temporizador para la cosecha. Al final de cada punto de tiempo de cosecha, transfiera cada hoja al tubo correspondiente y suelte inmediatamente el tubo en nitrógeno líquido para congelar la muestra de la hoja antes de almacenarla a menos 80 grados centígrados hasta el aislamiento del ARN. Las larvas saneadas con etapas precisas deben comenzar a alimentarse inmediatamente después de la colocación en la superficie de la hoja y la alimentación debe continuar de manera bastante consistente durante todo el período de tiempo de infestación.La larva en el fondo de esta hoja no consumió ningún material vegetal y es un ejemplo de una infestación infructuosa. Estas hojas se separaron de las plantas de cultivo de tejido propagado nodal de dos semanas de edad y se consumieron a diferentes velocidades y estilos de alimentación para cada etapa larval. Sobre la base de estos resultados, se seleccionaron las cuartas larvas instar para evaluar aún más el daño a las hojas de las plantas de papa cultivadas en suelo más maduro que se aproximan más a las plantas de papa cultivadas en el campo.En estos estudios de expresión génica, se identificaron dos nuevos factores de transcripción de dedos de zinc C2H2 que responden robustamente al herbívoro M.sexta apoyando el uso de hojas separadas para ensayos de infestación. Recuerde usar la edad y el tamaño de las hojas emparejadas y para escenificar adecuadamente las larvas para cada experimento como la uniformidad resulta en datos más reproducibles. Los tejidos de las hojas se pueden ensayar para especies de oxígeno reactivo inducidas por el estrés y derivados de la hormona del ácido jasmónico.También se pueden realizar estudios completos de transcriptoma, proteoma o microbioma en los tejidos de las hojas.

detached-leaf-assays-to-simplify-gene-expression-studies-potato

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Fuente: Shi, J., et al. Cribado e identificación de supresores silenciadores de ARN a partir de efectores secretados de patógenos vegetales. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo muestra un ensayo de coinfiltración para identificar proteínas efectoras de patógenos que suprimen el silenciamiento de ARN en Nicotiana benthamiana 16c. Un reportero fluorescente y un gen efector candidato se introducen en las hojas de las plantas a través de Agrobacterium. Normalmente, el silenciamiento de ARN degrada los...

Ensayo de coinfiltración para detectar efectores de patógenos que suprimen el silenciamiento del ARN vegetal

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

Análisis de una sola célula de la expresión génica de patógenos extraídos por plantas

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

La cuantificación del crecimiento de patógenos es una poderosa herramienta para caracterizar diversas respuestas inmunitarias de Arabidopsis thaliana (en adelante: Arabidopsis). El método descrito aquí presenta un ensayo optimizado de infiltración de jeringas para cuantificar la Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 crecimiento en hojas adultas de Arabidopsis.

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema

Muchos genes importantes para el desarrollo tienen patrones de expresión específicos de células o tejidos. En este artículo se describen experimentos de LM RNA-seq para identificar genes que se expresan diferencialmente en el límite de la hoja y la vaina del maíz y en mutantes lg1-R en comparación con el tipo salvaje. Las consideraciones experimentales discutidas aquí se aplican a los análisis transcriptómicos de otros fenómenos del desarrollo.

Diseño experimental para microdisección láser RNA-Seq: Lecciones de un análisis del desarrollo de la hoja de maíz

Este artículo muestra nuevas técnicas desarrolladas para la entrega oral de ARN bicatenario (dsRNA) a través de los tejidos vasculares de las plantas para ARN de interferencia (ARNi) en la savia del floema insectos.

Double-stranded RNA Oral entrega métodos para inducir la interferencia de ARN en floema e insectos Hemipteran alimentación planta de sap

El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.

Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa

Aquí, presentamos un método de cribado modificado que se puede utilizar ampliamente para examinar rápidamente los supresores de silenciamiento de ARN en patógenos vegetales.

Detección e identificación de supresores de silenciamiento de ARN de efectos secretos de patógenos vegetales

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

El protocolo describe la infección de las raíces de Solanum tuberosum con nematodos parásitos de plantas en condiciones de invernadero in vivo y las raíces transgénicas de papa in vitro para el análisis histoquímico de la estructura de la raíz mediante microscopía óptica.

Infección in vivo e in vitro de raíces de papa con nematodos parásitos de plantas para la evaluación de cambios estructurales inducidos

Este protocolo describe un enfoque de alto rendimiento para evaluar la fuga iónica de la planta, la actividad de la peroxidasa y la producción de calosas en la misma muestra.

Evaluación de las respuestas foliares a metabolitos microbianos secundarios utilizando un formato de alto rendimiento

Aprende a realizar ensayos de hojas independientes para estudiar la expresión génica en papa durante la herbivoría por Manduca sexta. Este método simplificado permite obtener datos reproducibles sobre respuestas vegetales.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta (Video) | JoVE Journal

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

Explorar más videos