Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen
19 de marzo de 2019
Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.
Esta técnica de preparación de muestras está diseñada para combinar la mejor calidad de preservación de la ultraestructura con el contraste más adecuado para la modalidad de imagen en un microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado. Este protocolo es especialmente útil para muestras que requieren preparación mediante congelación a alta presión para una preservación fiable de la ultraestructura, pero no obtienen suficiente contraste durante la sustitución por congelación para imágenes por volumen. Para una incrustación mínima de resina es esencial eliminar la mayor cantidad de resina posible para permitir una orientación adecuada más adelante en el microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado.
Para comenzar, utilice la pipeta para gotear una gota de 20%PVP PBS en la estera de corte. Sumerja el nervus tibialis diseccionado en la gota. Utilice el bisturí para cortar dos milímetros de longitud de la muestra.
Utilice fórceps finos para colocar la muestra en un soporte de muestra de metal de 0,2 milímetros de profundidad. Transfiera el soporte a la placa central del cartucho. Coloque el soporte tipo B recubierto de hexadecán en la parte superior como tapa.
Cierre el conjunto bajando la mitad superior del cartucho. Cierre el cartucho de tres piezas en la estación de carga del congelador de alta presión. Pulse el botón de proceso y proceda de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del fabricante.
En un baño de nitrógeno líquido, coloque los portadores de muestras en viales criográficos que contengan dos mililitros de ácido tánico congelado y acetona y cierre las tapas. Coloque los viales crios en la unidad de sustitución de congelación a menos 90 grados centígrados. Inicie el programa y mantenga las muestras allí durante 100 horas.
En la unidad de sustitución de congelación, lave las muestras con dos mililitros de acetona tres veces durante 30 minutos. Coloque 2%tetróxido de osmio en 0,1%acetato de uranilo en la unidad de sustitución de congelación para enfriar y agréguelo a las muestras durante siete horas de tinción continua a menos 90 grados centígrados. Cuando la temperatura del programa en la unidad de sustitución de congelación alcance menos 20 grados Celsius, mantenga las muestras allí durante otras 16 horas.
Cuando la temperatura suba a 4 grados centígrados, deseche el líquido en los viales y rellene la acetona pura. Retire los viales crios de la unidad de sustitución de congelación. El manejo de muestras antes de la congelación y después de la osmoficación es crítico, ya que la muestra puede dañarse gravemente.
En una campana de humo, utilice fórceps finos para retirar los portadores metálicos de los viales de crio y transferir las muestras de los portadores para sumergirlas en un plato de cristal de reloj de 150 milímetros de profundidad lleno de acetona. Utilice fórceps finos para transferir las muestras a dos tubos de reacción mililitros llenos de acetona. Ajuste el microondas a 250 vatios durante 40 segundos e inicie el microondas para lavar las muestras y repetir cuatro veces.
Pipetear un mililitro de 1%solución tiocarbohydrazide en el tubo de reacción y ponerlo en el microondas. Encienda la función de vacío con dos minutos encendido y dos minutos de apagado, iterando durante un total de 14 minutos y establézcalo en 150 vatios. Arranca el microondas.
Lave la muestra cuatro veces en acetona como antes. Pipetear un mililitro de 2%solución de tetróxido de osmio en el tubo de reacción. Coloque la muestra en el microondas y utilice los mismos ajustes de microondas que con la tiocarbohidrazida.
Lave la muestra cuatro veces en acetona como antes. Pipetear un mililitro de 25% de resina en acetona en el tubo de reacción y ponerlo en el microondas. Encienda la función de vacío durante tres minutos y establézcala en 250 vatios.
Arranca el microondas. Utilice un palillo de dientes para extraer el nervus tibialis del tubo de reacción y colóquelos en un pedazo de película de plástico. Coloque una lámpara halógena cerca de las muestras para calentar la resina.
Con un palillo de dientes, empuje suavemente la muestra sobre la película de plástico hasta que no se detecte resina restante. Coloque la película de plástico con la muestra en la parte superior en el horno y ajuste la temperatura a 60 grados Celsius para polimerizar las muestras durante al menos 48 horas. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar las muestras polimerizadas junto con la película de plástico en un tamaño que se ajuste al talón SEM.
Utilice un palillo de dientes para añadir resina de plata conductora en los talones SEM y adjunte las muestras cortadas a él. Y luego añadir resina alrededor de las muestras. Ponga los talones SEM en el horno para polimerizar a 60 grados Celsius durante al menos 4 horas o durante la noche.
Después de la polimerización, coloque los talones SEM en una recubridora. Ajuste la cubierta de pulverización a 35 miliamperios y aplique un recubrimiento o una capa de oro grueso de 10 nanómetros durante un minuto. Después del recubrimiento, coloque los talones SEM dentro del microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado.
En este estudio, se realizó un protocolo mejorado para nervus tibialis del ratón, así como C.elegans para ilustrar la preservación óptima y el contraste para realizar imágenes de volumen 3D con un microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado. Los protocolos estándar a menudo sufren de una falta de contraste de membrana donde como el protocolo mejorado proporciona un fuerte contraste de membrana. Las imágenes de sección transversal de C.elegans con protocolo mejorado y protocolo estándar muestran una diferencia distintiva.
Además de para las imágenes de sección transversal de nervus tibialis, el protocolo mejorado ayuda a mostrar un contraste de membrana más fuerte en comparación con el protocolo estándar. Después del postprocesamiento, los datos del microscopio electrónico se visualizan utilizando IMOD, un programa de procesamiento y modelado de imágenes. El área resaltada en azul muestra los axones segmentados.
El área resaltada en rojo muestra los paquetes de Remak. Las áreas de color amarillo y naranja muestran vainas de mielina. Y el área turquesa muestra mitocondrias.
La reliquia virtual y el modelo tridimensional ilustran la arquitectura de tejido fino y ayudan a entender su función. Se pueden utilizar otros métodos de microscopía electrónica de barrido de volumen, como la microscopía electrónica de barrido de bloques serie y la tomografía por matriz. Este protocolo también se puede utilizar para la microscopía electrónica de transmisión y otros tipos de muestras como muestras del sistema nervioso central.
El tetróxido de osmio, la tiocarbohidozida y el acetato de uranilo son sustancias químicas tóxicas y deben utilizarse con cuidado. La resina también es dañina y debe utilizarse con cuidado. El equipo de protección personal, como guantes y bata de laboratorio, debe usarse para el protocolo completo.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo mejorado de preparación de muestras que combina la congelación a alta presión y el procesamiento asistido por microondas para lograr una mejor conservación de la ultraestructura y contraste en la obtención de imágenes. Utilizando el nervio tibial de ratón y Caenorhabditis elegans como sistemas modelo, la técnica demuestra ventajas significativas frente a los protocolos estándar en cuanto al contraste de membranas y las capacidades de obtención de imágenes en 3D.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Microscopía
- Técnicas de obtención de imágenes
- Preparación de muestras
Antecedentes
- La preservación de la ultraestructura es fundamental para una visualización eficaz.
- Los protocolos estándar a menudo no proporcionan contraste adecuado para tejidos específicos.
- La combinación de múltiples técnicas puede mejorar los resultados de la imagen.
Métodos Utilizados
- Congelación por alta presión y procesamiento de muestras asistido por microondas
- Nervio tibial de ratón y Caenorhabditis elegans
- Microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocado (FIB-SEM)
Resultados principales
- El protocolo mejorado proporciona un contraste de membrana superior en comparación con los métodos estándar.
- Las imágenes de sección transversal muestran diferencias notorias en la visualización estructural.
- Los hallazgos respaldan la eficacia del protocolo para la obtención de imágenes detalladas de volúmenes en 3D.
Conclusiones
- Este estudio demuestra que combinar técnicas de procesamiento específicas mejora significativamente la calidad de la imagen.
- El protocolo es relevante para diversas muestras biológicas y puede ayudar a comprender la arquitectura tisular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo aborda un vacío crítico en la obtención de imágenes ultraestructurales, donde la congelación estándar por alta presión no proporciona contraste suficiente para la obtención de imágenes volumétricas en FIB-SEM. Al mejorar el contraste de las membranas mediante tinción asistida por microondas e inclusión mínima en resina, permite la reconstrucción tridimensional confiable de tejidos neuronales. Esto apoya la validación de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista en las líneas de descubrimiento en neurociencia, al proporcionar datos estructurales predictivos y de alta fidelidad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la preservación de la ultraestructura y el contraste mejorado de membranas en tejidos nerviosos.
- Valor operativo: Reduce la ambigüedad en estudios de interacción con el objetivo al proporcionar una visualización clara de las arquitecturas axonal y de mielina.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con resultados ultraestructurales cuantitativos para cribado de compuestos posteriores.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante una potenciación del contraste consistente y una inclusión mínima en resina.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización relacionada con enfermedades al preservar la arquitectura tisular fina en muestras del sistema nervioso central.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la generación reproducible de datos tridimensionales de volumen.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la evaluación preclínica, particularmente para programas centrados en neurociencia que requieren validación estructural.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver estructuras subcelulares críticas para la función neuronal.
- Selección: Proporciona muestras reproducibles y de alto contraste, adecuadas para flujos de trabajo automatizados de imágenes FIB-SEM, listas para ensayos.
- Análisis: Genera mediciones morfométricas cuantitativas (por ejemplo, diámetro del axón, grosor de la mielina) que permiten análisis comparativos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de la arquitectura tisular relacionada con los mecanismos de enfermedad en las neuropatías.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la validación ultraestructural en múltiples programas de objetivos neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en la ultraestructura neural.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la preparación de muestras para campañas de imágenes de alto volumen.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de continuar/no continuar mediante biomarcadores estructurales confiables, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas en programas del SNC.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de dianas neuronales basada en fenotipos ultraestructurales validados.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en congelación a alta presión, procesamiento asistido por microondas y microscopía electrónica.
- Es esencial el acceso a congeladores de alta presión, procesadores por microondas, FIB-SEM y cubiertas metálicas por pulverización catódica (sputter coaters).
- La estandarización entre equipos de histología, imagen y unidades de análisis de datos es necesaria para obtener resultados consistentes.
- La adaptación entre sistemas modelo (por ejemplo, ratón, C. elegans, tejido humano) requiere la optimización de los tiempos de tinción e inclusión.
- Las limitaciones prácticas incluyen el manejo de reactivos tóxicos (tetraóxido de osmio, acetato de uranilo) y tiempos prolongados de procesamiento para la sustitución por congelación y la polimerización.
