Name: Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprende a preparar cultivos de rebanadas organotípicas de cerebelo de ratón para estudiar la mielinización mediante inmunohistoquímica. Este método preserva la arquitectura tisular y permite el análisis de procesos de remielinización.

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Agradecemos Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon y Dr. Thomas Roux valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el INSERM, ICM, ARSEP becas R13123DD, R17127DD de la ANR (para DC) y beca FRM, SPF20110421435 (para DC), FDT20170437332 (a M.T.). Agradecemos a las instalaciones de cultura de célula CELIS y la RIC. Plataforma de proyección de imagen de Quant.

Todo trabajo con animales el cumplimiento de las políticas institucionales y lineamientos establecidos por el UPMC, INSERM y el francés y Directiva Comunidad Europea 86/609/CEE.
1. preparación de medio de cultivo y cultura inserta (práctica tiempo ≈ 10-15 min)
Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles
<ol><li>Preparar 40 mL de medio de cultivo, que consiste en 50% BME, solución salina equilibrada de Hank 25% (1 x), 25% inactivado con calor caballo suero, suplementado con 2 mM glutamina derivado, 100 UI/mL penicilina-estreptomicina y 4,5 mg/mL de D-glucosa. Ajustar el pH a 7.4.</li>
	<li>Filtro-esterilizar el medio con filtro 0,22 μm adaptada a una jeringa de plástico de 50 mL. Nota: Medio de cultivo pueden almacenarse a 4 ° C durante por lo menos una semana.</li>
	<li>Para una estándar camada de 6 cachorros, utilizar dos placas de 6 pocillos estériles. Para cada plato, retire la tapa y añada 1 mL de medio de cultivo por pozo.</li>
	<li>Coloque una cultura en cada pozo individual manteniendo el borde plástico con pinzas estériles. Ponga la tapa sobre la placa. Nota: Las rebanadas cerebelosas de un cachorro (6-8) pueden ser despachadas en dos membranas (3-4 rebanadas cerebelosas por inserción de membrana).</li>
</ol>2. preparación del medio de la disección (práctica tiempo ≈ 5 min)
Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles
<ol><li>Preparar 100 mL de medio de disección, que consiste en equilibrada solución de Gey de sal suplementado con 4,5 mg/mL x D-glucosa y 1 penicilina – estreptomicina (100 UI/mL cada uno).</li>
	<li>Filtro-esterilizar el medio a través de una unidad de filtro de 0,22 μm. Nota: El medio de disección puede almacenarse a 4 ° C durante al menos un mes.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio de disección fría en platos de cultivo celular 60 mm. Preparar un plato de cultura celular de 60 mm para cada cachorro ser disecado.</li>
	<li>No los platos de disección en hielo hasta su uso.</li>
</ol>3. preparación del material de disección (Hands-on tiempo ≈ 15 min)
<ol><li>Limpie el Banco con 100% de etanol.</li>
	<li>Esterilizar todas las herramientas de disección, una hoja de afeitar y plataforma plástica de chopper tejido con 100% de etanol.</li>
	<li>Fijar la hoja de afeitar y la plataforma de plástico en la chopper de tejido y ajustar el espesor de corte de 300 μm.</li>
	<li>Asegúrese de que el etanol se evapore antes de comenzar la disección.</li>
</ol>4. CerebellumDissection y preparación de las secciones (Hands-on tiempo ≈ 15-20 minutos por animal)
<ol><li>Coloque uno de los platos de cultivo celular 60 mm que contiene el medio de disección helada bajo el microscopio binocular y retire la placa superior.</li>
	<li>Limpiar la piel de la cabeza con etanol al 70% (evitando tocar los ojos de los animales) y decapitar al animal utilizando unas tijeras afiladas grandes, según el procedimiento aprobado. Nota: Las láminas cerebelosas se generan de P9-P10 ratones sin tensión diagonal o sexo específico.</li>
	<li>Utilice tijeras pequeñas para cortar la piel a lo largo de la línea media de la cabeza a partir del cuello y subiendo hasta la boca del ratón.</li>
	<li>Para sostener la cabeza y exponer el cráneo, pliegue la piel ventral debajo de la cabeza y los dos pliegues de piel entre los dedos una pizca.</li>
	<li>Inserte suavemente las pequeñas tijeras en el foramen magnum y cortar el cráneo haciendo uno lateral incisión hacia el lado y cortar alrededor de la cabeza del cráneo. Mantenga la punta de las tijeras como paralelo y cerca de la calavera como sea posible durante el corte, para evitar dañar el tejido cerebral.</li>
	<li>Recuperar la parte dorsal del cráneo utilizando pinza fina recta. Mientras levanta con cuidado la parte dorsal del cráneo, cortar las meninges adherentes (translúcida membrana irrigada que rodea el tejido cerebral) si es necesario con pequeñas tijeras para no dañar el tejido cerebral.</li>
	<li>Introducir cuidadosamente la pinza fina recta (o alternativamente use una espátula) entre el cerebro y el cráneo ventral, flipan el cerebro y cortar los nervios de trigeminal y óptica con pequeñas tijeras.</li>
	<li>Ayuda al cerebro a dejar caer por gravedad en la placa de cultivo de células de 60 mm que contiene medio de disección fría girando la cabeza hacia abajo sobre el plato y liberar las adherencias pasadas con pequeñas tijeras si es necesario.</li>
	<li>Con unas pinzas finas, orientar el cerebro con el lado dorsal hacia el investigador y el lado ventral en la parte inferior del plato.</li>
	<li>Bajo el microscopio binocular, utilizar el fórceps recto fino para inmovilizar el cerebro en el lado del cerebro anterior y evite tocar el cerebelo, ya que podría dañarse. Separan el cerebelo del resto del cerebro (fore - y el midbrain, ver esquema en figura 1Aa), utilizando pinza fina recta. Para separar el resto del cerebelo el cerebelo, utilice las pinzas finas para cortar los pedúnculos cerebelosos, por debajo del cerebelo (ver esquema en figura 1Aa').</li>
	<li>Una vez aislado el cerebelo, rasgar cuidadosamente a las meninges con pinza fina recta (ver esquema en figura 1Aa').
</li>
	<li>Sostenga el cerebelo suavemente con las pinzas curvas finas y colocarlo con el lado dorsal en la plataforma de plástico perpendicular a la cuchilla del picador (ver esquema en figura 1Bb).</li>
	<li>Aspirar el exceso de medio de disección en el cerebelo usando una punta de pipeta estéril de extremo fino adaptada en un 1 mL pipeta (ver esquema en figura 1Bb).</li>
	<li>Asegúrese de que el cerebelo pone plano, pero no estirado, una vez colocado en la plataforma para obtener rebanadas sagitales óptima durante el seccionamiento (véase esquema en figura 1Bb).</li>
	<li>Cortar 300 μm de espesor secciones sagitales del cerebelo con el picador de tejido (ver esquema en figura 1Bb'). La fuerza y la velocidad de la hoja deben ser optimizada en el sitio.</li>
	<li>Suavemente agregue una gota del medio de la disección en el cerebelo en rodajas. Lentamente utilizando una pipeta de ancha colocada en una pipeta de 1 mL, aspirar el cerebelo en rodajas y transferirlo a la placa de cultivo de células de 60 mm que contiene medio de disección helada (ver esquema en figura 1Bb'').</li>
	<li>Limpiar la plataforma plástica de chopper tejido con etanol al 100% entre cada corte de cerebelo. Que el etanol se evapore antes de colocar el cerebelo próxima a la plataforma.</li>
	<li>Utilizar dos pinzas recto fino (o alternativamente agujas de titanio) para separar sectores individuales y seleccionar 6-8 rebanadas de los vermis (ver esquema en figura 1Cc y 1Cc').</li>
	<li>Tomar una placa de 6 pozos con los partes movibles de la cultura y transferir hasta 4 rebanadas seleccionados en insertar una cultura junto con algún medio de disección, utilizando una pipeta ancha adaptada en una pipeta de 1 mL (ver esquema en figura 1Cc').</li>
	<li>Coloque las rodajas en medio de la inserción de la cultura utilizando el medio de disección o las pinzas para empuje y tire de ellas suavemente en la posición correcta, evitando para estar en contacto entre sí (ver esquema en figura 1Cc').</li>
	<li>Quitar cualquier exceso de medio de disección alrededor de las rebanadas utilizando una pipeta de punta fina. Asegurar que las rebanadas se ponen plana sobre la membrana (ver esquema en figura 1Cc').</li>
	<li>Coloque la placa de 6 pozos en la incubadora inmediatamente después de haber añadido las rebanadas en la membrana.</li>
</ol>5. rodajas de cultura y desmielinización (práctica tiempo ≈ 15-20 min)
Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles
<ol><li>Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL por pozo de medio de cultivo fresco precalentado y tampón cada 3 días después de la preparación de la rebanada.</li>
	<li>Para el demyelination, quitar todo medio de cultivo más abajo la cultura inserta después de 6 días in vitro (DIV) y sustituirla por 1 mL por pocillo del medio de cultivo fresco precalentado con 0.5 mg/mL LPC. Incubar durante 15-17 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar los rellenos colocándolos en una placa Petri 25 mm que contiene 1 mL de medio de cultivo precalentada. Nota: Los insertos deben estar en contacto con el medio, pero no serán cubiertos por él.</li>
	<li>Inmediatamente la transferencia de la cultura inserta en una placa de 6 pozos nuevos con medio fresco de cultivo precalentada.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo con 1 mL de medio de cultivo fresco precalentado cada 2-3 días hasta fijación de láminas.</li>
</ol>6. inmunohistoquímica (tiempo de práctica ≈ 1:30 – 2 h)
Nota: Llevar a cabo los pasos 6.1. 6.3. bajo una campana de humos. Evitar exposición a paraformaldehido (PFA) y consulte la hoja de datos de seguridad de producto para la adecuada manipulación y protección.
<ol><li>Uso de fórceps para levantar cada cultura inserta manteniendo el borde plástico y retire el medio de cultivo por debajo de los insertos de la membrana de cada pozo.</li>
	<li>Arreglar las rodajas cerebelosas por 30 min, añadir 2 mL de 4% PFA en 1 x pH 7,4 de la PBS en los insertos de la membrana. Nota: El momento de la fijación depende de la etapa de mielinización estudiado: DIV 4 corresponde al inicio de la mielinización, 7 DIV a rodajas totalmente mielinizados. En caso de tratamiento de LPC, DIV 9 corresponde al pico de desmielinización, la 11 DIV al inicio de la remielinización y 14 DIV a totalmente remyelinated rodajas.</li>
	<li>Lave los insertos con los trozos de tres veces con 2 mL 1 x PBS durante 10 minutos.</li>
	<li>Separar las rodajas de los insertos de membrana bajo el microscopio binocular con un x 25 a 30 aumentos, empujándolas suavemente con un bisturí o una brocha. Como alternativa, para evitar el riesgo de dañar las rebanadas al desprendimiento de la membrana, usar un bisturí para cortar la membrana con las rebanadas fijadas.</li>
	<li>Transferir los trozos flotantes en los pocillos de una placa de 4 pozos que contiene 1 x PBS, utilizando un cepillo.</li>
	<li>Aspirar el PBS de cada pozo e incubar las rebanadas en etanol al 100% previamente enfriado a-20 ° C durante 15 a 20 minutos. Este paso facilita la penetración del anticuerpo en fibras mielínicas.</li>
	<li>Aspirar el etanol 100% y lavar una vez brevemente con 1 x PBS, luego dos veces en PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar el PBS e incubar las rebanadas durante 30 a 45 minutos con una solución que contiene 1 x PBS 5% NGS, 0.3% de detergente no iónico a temperatura ambiente para bloquear sitios de fijación de anticuerpos no específicos.</li>
	<li>Aspire la solución de bloqueo. No lavado es necesario.</li>
	<li>Incubar durante una noche las rebanadas con los anticuerpos primarios diluidos en el bloqueo de la solución a 4 ° C. Para visualizar la mielina en rebanadas organotypic cerebelosa, utilice MBP (pollo, 1/150 o IGg2b de ratón, Smi99, 1/200) o PLP (rata, hibridoma, 1/5 a 1/10) anticuerpos. Nota: Para descubrir la expresión de más de un antígeno en el mismo segmento, realizar un doble o un triple procedimiento de tinción (ver figura 1 como ejemplo). Para realizar la incubación al mismo tiempo, asegurar anticuerpos primarios se producen en las diferentes especies. A continuación, utilice sus correspondientes anticuerpos secundarios acoplados a diferentes fluoróforos (véase Tabla de materiales nodal y paranodal marcador18 anticuerpos).</li>
	<li>En el segundo día, lavar las rodajas de tres veces en PBS 1 x durante 10 minutos.</li>
	<li>Incubar durante 3 horas con los anticuerpos secundarios diluidos en el bloqueo de solución (dilución 1/500) en la oscuridad a temperatura ambiente. Nota: Optimización del tiempo de disolución y de incubación de anticuerpos puede ser necesario cuando se utiliza otros anticuerpos que las descritas aquí.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS 1 x durante 10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Microscopio binocular, montar los cortes en un portaobjetos de vidrio. Colocar 100 μl de PBS 1 x en la diapositiva y transferir las rebanadas en PBS con un cepillo. Desplegar las rodajas si es necesario y aplanar en la diapositiva. Retire el exceso de PBS. En el caso de la inmunomarcación se lleva a cabo con cortes fijados a membranas, montaje con las láminas hacia el cubreobjetos con la membrana en el portaobjetos de cristal.</li>
	<li>Coloque una gota de medio de montaje directamente sobre el cubreobjetos de vidrio y cubrir ligeramente las rodajas. Diapositivas montadas pueden almacenarse durante varios meses a 4 ° C en la oscuridad.</li>
</ol>

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<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tienen intereses en competencia o conflicto de intereses.

Aquí detallamos un protocolo para generar un ex vivo modelo correspondientes a las culturas de rebanada de ratón organotypic cerebelosa, adaptado de previamente métodos publicados15,16,19 y la mielina posterior inmunotinción de estos preparados. Esta estrategia ofrece la posibilidad de visualizar los componentes de la mielina con una alta resolución en Estados sanos y patológicos.
Cerebelosa organotyp...

Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal1. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en sistema nervioso periférico (PNS). Tanto en el SNC y el SNP, axoglial interacciones conducen a la formación de dominios especializados de axonales: los nodos de Ranvier y sus alrededores de dominios los paranodes y juxtaparanodes2. Los segmentos axonales aislados por mielina o entrenudos, alternas con los nodos de Ranvier, que corresponden a pequeños dominios unmyelinated enriquecidos en canales voltaje-bloqueados del sodio (Nav). La alta concentración y rápida activación de canales de Nav en los nodos de Ranvier permiten la regeneración de los potenciales de acción y junto con las propiedades aislantes de las vainas de mielina, garantizar la eficiente y rápida de saltatoria conducción de la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón3.
Además de su papel en la aceleración de la velocidad de conducción del impulso nervioso, glia myelinating proporciona apoyo metabólico para el axón, preservando su integridad a largo plazo y participar en su supervivencia4,5. Además, ha quedado claro en estos últimos años que esa mielina es modulada dinámicamente a lo largo de la vida, por lo tanto presumiblemente participan en la regulación y plasticidad de diversas funciones del sistema nervioso. Ajustes de la distribución, número, longitud y grosor de las vainas de mielina a lo largo de axones así podrían representar una forma novedosa para ajustar finamente varios redes6,7,8. Por lo tanto, la adquisición evolutiva de la mielina es un proceso clave para las funciones sensoriales, motores y cognitivos y la alteración de la interacción entre los axones y glia es cada vez más considerada como contribuyendo al desarrollo o adquirida neurológica enfermedades9.
Composición de la mielina se ha caracterizado, con la particularidad de una alta proporción de lípidos (70%) en comparación con las proteínas (30%) en contraste con otras10de las membranas celulares. Sin embargo, a diferencia de los lípidos de la mielina, la mayoría de las proteínas de la mielina es específica de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), 2', glicoproteína de nucleótidos 3'-cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP), asociada a la mielina (MAG), glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) y PMP-22, P010. Diversos métodos histológicos para tinción de mielina existen en base a su composición de lípidos, como Luxol fast blue11, Sudán negro B12, de panadero hematina ácida método13, así como14de tinción de plata. Sin embargo, estos enfoques no siempre permiten un adecuado contraste y resolución para visualizar las fibras individuales. Un método alternativo para detectar la mielina es a través de inmunohistoquímica dirigido contra proteínas de mielina. Anticuerpos contra varios antígenos específicos de mielina de destino con una alta especificidad y puede utilizarse rutinariamente para detectar estructuras mielínicas. La interacción antígeno-anticuerpo puede ser revelada aún más usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo dirigida contra el anticuerpo primario y visualizada con microscopía de fluorescencia adecuada. Aquí, describimos un protocolo inmunoquímico para tinción de mielina en ex vivo cerebelosa rebanadas, un modelo que permite una buena conservación de la arquitectura del tejido nervioso. Además, la organización y el tamaño de las células de Purkinje (la única neurona myelinated del cerebelo) hacen un modelo clásico para los estudios electrofisiológicos y son igualmente ideales para realizar estudios de imágenes en vivo o fijados.
Las láminas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10, un tiempo correspondiente al inicio temprano de la mielinización de células de Purkinje, un proceso que se logra sobre todo por una semana ex vivo (6-7 días in vitro DIV)15. Además, este modelo está adaptado para investigar trastornos desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM), como una desmielinización extensa puede ser inducida en rebanadas cerebelosas con el myelinotoxic compuesto lysophosphatidylcholine (o lysolecithin, LPC), que es seguido por una espontánea remyelination16,17. Remielinización endógena ocurre dos días después del retiro de la LPC del medio de cultivo y es casi completa después del tratamiento una semana.
La realización de este protocolo toma aproximadamente 3 semanas, incluyendo el medio día para la preparación de culturas rebanada cerebelosa, a la semana para obtener rebanadas completamente myelinated, seguidos por 2 días en llegar a la cima del demyelination y otra semana para todo su remielinización. Además, la inmunohistoquímica puede completarse en 2 días. El protocolo descrito aquí se adapta a una estándar camada de 6 cachorros de ratones y necesita ser adaptado con respecto al número de animales utilizados para el experimento planeado.

<table><tbody><tr><td>Medio BME</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solución salina equilibrada (10x HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo inactivado por calor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; Estreptomicina (10.000 UI/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s Solución salina equilibrada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de D-glucosa (45%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lisofosfatidilcolina (LPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto (100% etanol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.330</td><td>Enfriado a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Tritón&reg; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10% Suero de Cabra Normal (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>500622</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato</td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP (policlonal, pollo)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>Dilución 1/300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-mielina proteína básica (MBP) (policlonal, pollo)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>Dilución 1/150</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Proteína Básica de Mielina (MBP) (Monoclonal, IgG2b de ratón)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>Dilución 1/200</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-PLP (Rata, Hibridoma)</td><td>Regalo del Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japón</td><td></td><td>Dilución 1/5 a 1/10</td></tr><tr><td>Canal antisódico, anticuerpo Pan (monoclonal, IgG1 de ratón, clon K58/35)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8809</td><td>Dilución 1/150</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Caspr (policlonal, conejo)</td><td>Abcam</td><td>ab34151</td><td>Dilución 1/500</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios de cabra conjugados con Alexa Fluor 488, 594, 647 o 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Picadora de tejidos</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>grandes</td><td>F.S.T</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras pequeñas</td><td>F.S.T</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas-rectas</td><td>F.S.T</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas-finas</td><td>F.S.T</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular (60 mm y 100 mm)</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 4 y 6 pocillos</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo Millicell (0,4 y micro; m, 30 mm de diámetro)</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de</td><td></td><td></td> cultivos <td>celulares 37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de punta fina</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de diámetro ancho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079G</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 o 50 mL</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0.22 &micro; m</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>de</td> cepillo <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> RS France 76 mm x 26 mm x 1,1 mm <tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>RS France</td><td></td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences Tejidos Limpiadores</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> <td>binocular</td></tr></tbody></table>

preparación y el immunostaining de myelinating organotypic rebanada cerebelosa culturas

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

En el sistema nervioso, la mielina es una estructura compleja de la membrana generada por myelinating glial de las células, que axones ensheathes y facilita la conducción eléctrica rápido. Alteración de la mielina se ha demostrado para ocurrir en varias enfermedades neurológicas, donde se asocia con déficits funcionales. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una ex modelo vivo que consiste en rodajas cerebelosa organotypic de ratón, que se pueden mantener en cultivo por varias semanas y aún más ser etiquetado para visualizar la mielina.

Ejemplos de mielina representante immunostainings en rebanadas cerebelosa organotypic obtenidos P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figura 2A), así como de ratones transgénicos de PLP-GFP (figura 2B), junto con la tinción de las células de Purkinje. Myelinate de la materia blanca cerebelosas rebanadas pistas región de las láminas hacia la periferia de la folia y mielinización de las células de Purkinje se obtiene sobre todo después ...

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Este método permite estudiar el mecanismo básico de mielinización y reeyelinación a nivel celular y tisular. Esta técnica está en la encrucijada entre las culturas primarias y los enfoques in vivo. Es un modelo rápido y accesible con la principal ventaja de preservar la arquitectura tisular.Demostrando el procedimiento estarán Melina Thetiot, investigadora postdoctoral y Remi Ronzano, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte unas tijeras pequeñas suavemente en el foramen magnum y corte el cráneo haciendo una incisión lateral hacia el lado, y luego corte todo alrededor del cráneo de la cabeza. Para recuperar la parte dorsal del cráneo, utilice un fórceps fino y recto para levantar cuidadosamente la parte dorsal del cráneo.Luego introduzca cuidadosamente los fórceps entre el cráneo ventral y el cerebro. Voltee suavemente el cerebro y corte los nervios ópticos y trigéminos con tijeras pequeñas. A continuación, gire la cabeza o la parte dorsal del cráneo boca abajo justo por encima de un plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene un medio de disección de frío helado para ayudar al cerebro a caer por gravedad.Usando fórceps finos, orienta el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y el lado ventral acostado. Bajo el microscopio binocular, utilice los fórceps finos y rectos para inmovilizar el cerebro en el lado del antebrazo. Luego, separa el cerebro trasero del resto del cerebro.Cortar los pedúnculos cerebelosos debajo del cerebelo para separar el cerebelo del resto del cerebro trasero. Una vez que el cerebelo esté aislado, utilice fórceps finos y rectos para desgarrar cuidadosamente las meninges. Sujete el cerebelo suavemente con los fórceps finos y curvos y colóquelo con el lado dorsal hacia arriba sobre la plataforma de plástico, perpendicularmente a la cuchilla de afeitar del helicóptero.A continuación, con una punta de pipeta de extremo estéril y delgada unida a una pipeta de un mililitro, aspira cualquier acceso al medio de disección alrededor del cerebelo. Luego, con un helicóptero de tejido, corte secciones saggitales de 300 micrómetros de espesor del cerebelo. A continuación, agregue una gota de medio de disección en el cerebelo en rodajas suavemente.Luego, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, aspira lentamente el cerebelo en rodajas y transfiéralo de nuevo al plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene el medio de disección de frío helado. A continuación, utilice dos fórceps finos y rectos para separar las rodajas individuales. A continuación, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, transfiera hasta cuatro rebanadas seleccionadas del vermis, junto con algún medio de disección en un inserto de cultivo de una placa de seis pozos.Retire cualquier acceso del medio de disección alrededor de las rodajas utilizando una punta de pipeta de extremo fino. Para la desmielinización, retire todo el medio de cultivo por debajo de los insertos de cultivo después de seis días in vitro, y reemplácelo por un mililitro por pozo del medio de cultivo fresco precalentado que contenga 0,5 miligramos por mililitro de LPC. Incubar de 15 a 17 horas a 37 grados centígrados en un 5% de ambiente de dióxido de carbono.Después de la incubación, lave los insertos colocándolos en un plato de 25 mililitros Petri que contenga un mililitro de medio de cultivo precalentó. A continuación, transfiera inmediatamente las inserciones de cultivo en un nuevo plato de seis pozos, que contiene un medio de cultivo fresco y precalentado. Para comenzar la inmunohistoquímica, primero use fórceps para levantar inserciones de cultivo y eliminar el medio de cultivo debajo de ellos.A continuación, agregue dos mililitros de 4%PFA en 1x PBS, ph 7.4, en las inserciones de membrana para fijar las rodajas de cerebeloso. Después de 30 minutos, lave las rodajas tres veces con dos mililitros de 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, bajo el microscopio binocular, usando un aumento de 25x a 30x, utilice un bisturí o un cepillo para separar suavemente las rodajas de las inserciones de membrana.Luego, usa un cepillo para transferir las rodajas flotantes a los pozos de una placa de cuatro pozos, que contiene 1x PBS para limitar el consumo de anticuerpos. Luego, aspirar el PBS de cada pozo e incubar las rodajas en etanol preenfriado 100% a menos 20 grados Celsius durante 15 a 20 minutos. Después de la incubación, aspirar el 100% de etanol y lavar las rodajas brevemente con 1x PBS.Luego, lávelos dos veces a temperatura ambiente con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. Para bloquear sitios de fijación de anticuerpos no específicos, aspire el PBS e incubar las rodajas en una solución que contenga 1x PBS, 5%NGS y 0,3% detergente no iónico a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. A continuación, agregue anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo e incubar las rodajas a cuatro grados centígrados durante la noche.Después de la incubación durante la noche, lave las rodajas tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, agregue los anticuerpos secundarios, diluidos en la solución de bloqueo, en una relación de dilución de uno a 500 e incubar las rodajas a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, lave las rodajas tres veces en 1x PBS en la oscuridad durante 10 minutos cada lavado.A continuación, bajo un microscopio binocular, coloque 100 microleters de 1x PBS en la diapositiva y con un cepillo, transfiera las rodajas en el PBS y aplanarlas en la diapositiva. Quite cualquier acceso de PBS. Por último, coloque una gota de medio de montaje directamente sobre el resbalón de la cubierta de vidrio y cubra suavemente las rodajas.Se observaron inmunotenciones de mielina en rodajas de cerebelosa organotípicas, obtenidas de los días post natales 9 a 10 C57 negros seis ratones de tipo salvaje a los 11 días in vitro con nodos de ronviae enriquecidos en canales de sodio cerrados por tensión, flanqueados por el dominio de unión axoglial paranodal. Se observaron los mismos resultados para los ratones transgénicos PLP-GFP. La mielinización de las células parkengy se logra principalmente después de una semana en el cultivo.El tratamiento con LPC desmielina completamente las rodajas, que remilinan espontáneamente y están completamente mielinadas seis días después de la desmielinización. Este procedimiento debe tardar 25 minutos como máximo. Es realmente el punto más crítico.El cultivo de rebanadas organotípicas es adecuado para el estudio por imágenes en vivo de la dinámica de mielinización. También se puede utilizar para apuntar a experimentos de detección de drogas. Esta técnica permite un enfoque fácil y cuantitativo para estudiar los procesos de mielinización y reeyelinación.Los experimentadores deben seguir los procedimientos básicos de seguridad que se aplican al bienestar animal, la mielinización excesiva y aguda.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

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