Name: Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende un ensayo de cribado de granos para evaluar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en maíz transgénico. Este método permite monitorear la infección fúngica en tiempo real.

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Agradecemos a David Meints, Universidad de Arkansas para su asistencia en el desarrollo y análisis de maíz transgénico durante las primeras generaciones. Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto de USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. Mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura. Política de igual oportunidad de empleo (EEO) de USDA-ARS exige igualdad de oportunidades para todas las personas y prohibe la discriminación en todos los aspectos de las políticas de personal, prácticas y operaciones de la Agencia.

1. construcciones plásmidos y transformación de maíz
<ol><li>PCR amplificación Lablab AILP insertar usando los cebadores 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'y 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s (paso 1), seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 10 s (paso 2), recocido a 55 ° C para 30 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 31 ciclos del paso 2 al paso 4 , y una elongación final a 72 ° C por 5 min clon el producto PCR en un modificado pCAMBIA 1.300 vector con XbaI y PstI sitios de restricción. Secuencia el vector del destino final de la planta para confirmar la orientación y la secuencia del gen clonado de IABP en el vector.</li>
	<li>Como anteriormente descrito 16transformar la Agrobacterium cepa EHA101 con la construcción final del vector (figura 1).</li>
	<li>Uso transformado Agrobacterium que contiene el vector de destino final de la planta a transformar embriones inmaduros de maíz (Zea mays L. Hi-II) (realizados en la instalación de planta de transformación de la Iowa State University) 16.</li>
	<li>T0 plantas en el invernadero (26 – 29 ° C, fotoperíodo de 16/8 h con Na-lámparas de alta presión) y autofecundarse repetidamente para obtener T6 generación para lograr la calidad de homozigoto para el rasgo transgénico.</li>
</ol>2. ensayo de germinación de esporas de
<ol><li>Las muestras de hojas de la cosecha y almacenar a-80 ° C. Moler las muestras de hojas con un mortero y una maja con nitrógeno líquido. Pesar 0.5 g en tubos de microcentrífuga de 2 mL, Añadir 17 μl de inhibidor de la proteasa y coloque los tubos en hielo.</li>
	<li>Centrifugar los tubos durante 10 min a 16.000 x g. Transferencia de 225 μL de extracto de la planta a tubos de microcentrífuga de 0, 5 mL y coloque en hielo.</li>
	<li>En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare una suspensión 5 mL de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP en caldo de dextrosa de papa de 1% (p/v). Vórtice y ajustar la concentración de esporas a 10 esporas/mL,5 con un hemocitómetro. PRECAUCIÓN: A. flavus produce aflatoxinas, todo el trabajo con este hongo debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Incubar en PDB a 28 ° C hasta que la cultura logra 50% inicio de la germinación de las esporas según lo indicado por abultamiento de las esporas.</li>
	<li>Vórtice y alícuota 25 μl solución, espora a la planta 225 μL del extracto. Incubar las muestras durante 20 horas a 28 ° C con agitación intermitente.</li>
	<li>Alícuota de 25 μl de solución de esporas en un portaobjetos de microscopio y mida la longitud del germen tubos esporas mediante el software de la cámara digital. Utilizar un mínimo de 20 mediciones replicadas de cada línea. Nota: En esta etapa, coloque todas las culturas a 4 ° C para detener el crecimiento de la colonia hasta que esté listo para contar.</li>
</ol>3. núcleo investigación ensayo (KSA)
<ol><li>Construir tapas de KSA pegando 4 snap caps (22 mm) en caja Petri 60 x 15 mm. Permitir el pegamento se seque durante 48 H antes de usar gorras. Cada tapa KSA constituye un representante (figura 2).</li>
	<li>En un estéril gabinete de seguridad biológica, rocíe una bandeja cuadrada bioensayo (24 cm x 24 cm) con 70% etanol: H2O (v/v) y deje secar al aire. Añadir papel de cromatografía estéril a la bandeja. Aerosol 9 casquillos KSA con etanol al 70%, deje que el aire seque y coloque en la bandeja del bioensayo.</li>
	<li>Para cada línea de maíz transgénico está probando, seleccione 20 núcleos indemnes y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Añadir etanol al 70% y dejar reposar durante 4 minutos. Agitar suavemente los tubos durante la esterilización. Retirar los granos etanol y enjuague tres veces en estéril desionizada H2O.</li>
	<li>Preparar una suspensión de esporas de Aspergillus flavus 70-GFP17 de una cultura de 6 días de edad cultivadas en medio V8 (5% jugo V8 agar al 2%, pH 5.2).<ol>
<li>Añadir 20 mL estéril 0.02% Triton X-100/desionizada H2O (v/v) y desechos de las esporas con un asa estéril. Pipeta el inóculo y el lugar en un vaso de precipitados estéril 300 mL.</li>
		<li>Preparar una dilución de 5-fold con 0,02% Tritón X-100, luego realizar un conteo de esporas con un hemocitómetro. Diluir más si es necesario para obtener 100 mL con una concentración de 4 x 106 esporas/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar los granos en un vaso de precipitados estéril 300 mL con una barra de agitación. Añadir el inóculo en el vaso. Atención: Agregar granos a inóculo se causa solución a splash. Coloque el vaso en un plato mezclar durante 3 minutos. Después de 3 minutos, vierta de inóculo en un vaso de precipitación vacío.</li>
	<li>Usando un fórceps, coloque los granos en el plato de prueba (1/tapadera). Añadir 30 mL agua a la parte inferior de cada bandeja de prueba e incubar a 31 ° C en la oscuridad durante 7 días.</li>
	<li>Preparar los granos para la fotografía.<ol>
<li>Dejar reposar 4 núcleos de cada línea para análisis microscópico y la fotografía. Nota: Los granos pueden almacenarse a 4 ° C durante no más de 5 días antes de completar la fotografía.</li>
		<li>Tomar fotografías de granos después de siete días de la inoculación con a. flavus (figura 3).</li>
		<li>Limpieza exterior de granos con un tejido blando y agua desionizada. Realizar secciones longitudinales de núcleos y fotografiar inmediatamente bajo el microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de núcleos para análisis.<ol>
<li>Limpieza exterior de núcleos restantes con un tejido blando y agua desionizada.</li>
		<li>Colocar 4 núcleos, constituyendo 1 rep, en un policarbonato de tapón de rosca 15 mL vial que contiene 2 bolas de acero inoxidable. Congelar inmediatamente los frascos en nitrógeno líquido y conservar a-80 ° C hasta el posterior procesamiento y análisis.</li>
		<li>Saque los frascos del congelador de-80 ° C y moler los granos en un homogeneizador a 1.500 rpm durante 3 minutos. Nota: Mantenga los núcleos congelados con nitrógeno líquido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. proyección PCR de granos de maíz transgénicos
<ol><li>Utilice el kit de aislamiento de DNA para aislar ADN genómico (gDNA) de granos de maíz pulverizados infectados por a. flavus según las instrucciones del fabricante. Añadir brevemente, 280 μl de tampón de F 20 proteasa μl y 3 μl dithiothreitol (DTT) a 10-15 mg de granos de maíz pulverizados. Incubar y agitar en un Termomezcladores (56 ° C, 1.200 rpm, 30 min). Centrifugar a 10.000 x g durante 1 min y transferir el sobrenadante a la columna equilibrado. Incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos y centrifugar a 700 x g durante 1 min eluir gDNA.</li>
	<li>Tomar 0,8 μl de gDNA extraído para configurar un 20 μl PCR la reacción para cada muestra usando un kit PCR. Siga las condiciones de termociclaje rápido como se recomienda en el protocolo del fabricante. Las condiciones PCR incluyen un paso de desnaturalización inicial a 98 ° C por 5 min (paso 1) seguido de la desnaturalización a 98 ° C durante 5 s (paso 2), recocido a 55 ° C durante 5 s (paso 3), elongación a 72 ° C por 20 s (paso 4), 40 ciclos de paso 2 al paso 4 y a un paso de elongación final a 72 ° C durante 1 minuto (paso 5).</li>
	<li>Use primer forward 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' y primer 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' para confirmar la presencia de Lablab AILP gene en los granos de maíz transgénicos.</li>
</ol>5. aislamiento RNA, síntesis de cDNA y RT-PCR semicuantitativa
<ol><li>Tomar homogeneizada a. flavus infectados los granos de maíz previamente almacenados a-80 ° C para la extracción de RNA. Extracto de RNA utilizando un kit de aislamiento de RNA total según protocolo del fabricante pero con ligera modificación18. Después de agregar 50 mg de polvo del núcleo de maíz homogeneizada en el buffer de extracción, mezcla bien (sin Vortex) usando una punta de la pipeta de 1 mL y dejarla en hielo durante 5-6 minutos antes de proceder a realizar los siguientes pasos como se describe en el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Preparar el cDNA usando un cDNA síntesis kit según protocolo 18 el fabricante.</li>
	<li>Utilizar 0,5 μl de cDNA sin diluir por reacción de polimerización en cadena para RT-PCR semicuantitativa como anteriormente descrito18. Usar primers de avance y retroceso qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' y qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivamente para detectar genes de IABP Lablab y adelante y atrás iniciadores qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ y qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ respectivamente para la expresión del gen de estructural ribosomal maíz (costilla), GRMZM2G02483819 como un gen de mantenimiento de la casa.</li>
</ol>6. cuantificación de GFP
<ol><li>Preparar 50 mL de cada una de 0.2 M de fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) y 0.2 M fosfato sódico dibásico (Na2HPO4·7H2O) desionizada H2O.</li>
	<li>Hacer 100 mL de tampón de fosfato de pH 7.0 Sorenson. Para pH 7.0, agregue 19,5 mL NaH2PO4 acción, 30,5 mL NaHPO4·7H2O existencia y 50 mL desionizada H2O.</li>
	<li>Pesar 25 mg de núcleo triturado (peso fresco, FW) y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,0 mL. Añadir 500 μl de tampón de fosfato al tubo de centrífuga y vortex durante 30 s.</li>
	<li>Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 16.000 x g. Sobrenadante en una placa bien negro 96 en Pipetee 100 μl. Leer las muestras con un fluorómetro (excitación 485 nm, emisión 528 nm).</li>
</ol>7 análisis de aflatoxina total
<ol><li>Extracción procesamiento y aflatoxina muestra<ol>
<li>Muestras de núcleo seco en un horno de aire forzado durante 2 días a 60 ° C. Pesar las muestras y colocar en un matraz de Erlenmeyer con un tapón de vidrio de 50 mL.</li>
		<li>En una campana de humos, añadir cloruro de metileno 25 mL en cada matraz. PRECAUCIÓN: Cloruro de metileno es muy volátil y se considera peligroso (irritante, cancerígeno). Guantes de látex ni de nitrilo son seguras para trabajar con cloruro de metileno. Utilice guantes de alcohol polivinílico resistentes solventes orgánicos mejorado.</li>
		<li>Agitar las muestras durante 30 minutos en un agitador de acción de la muñeca. Después de 30 min, verter lentamente el extracto a través de un círculo de papel de filtro estriado en un vaso de precipitado de 80 mL. Dejó la vasos seque durante la noche en una campana de humos.</li>
		<li>Al día siguiente, squirt cloruro de metileno (aproximadamente 5 mL) en el interior del borde de los vasos secos, Remolino alrededor y verter en frascos de vidrio de 2 dram. Dejar los frascos abrirán para que se seque durante la noche en una campana de humos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de aflatoxinas<ol>
<li>Añadir 4,0 mL 80% metanol: desionizada H2O (v/v) viales.</li>
		<li>Uso un kit de extracción de aflatoxinas para purificar solución de metanol con la columna proporcionada. Analizar los niveles de aflatoxina total con un fluorómetro, según las instrucciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores no tienen conflicto de interés.

Pérdidas de rendimiento en cultivos agrícolas debido a patógenos y plagas es un problema global de20. Actualmente, la aplicación de plaguicidas y fungicidas sintéticos es el medio predominante para controlar patógenos y plagas, pero toxicidad residual de estos productos bioquímicos en los alimentos y los piensos puede representar grave amenaza para la salud humana y animal21. Teniendo en cuenta la importancia económica del maíz como alimento y cultivo de alimento, reducción...

Contaminación por micotoxinas de los géneros de hongos, Alternaria , Aspergillus, Penicilliumy Fusariumes un problema importante de los alimentos y cultivos en todo el mundo1,2,3. Entre estos hongos fitopatógenos, Aspergillus tiene el mayor impacto adverso en el valor de cultivos y salud humana y animal. Aspergillus flavus (A. flavus) es un patógeno oportunista de la planta que infecta cultivos ricos aceite tales como semilla de algodón, maíz y maní y produce el potente carcinógeno, aflatoxinas, así como numerosos metabolitos secundarios tóxicos (SMs). Maíz es un alimento importante y alimenta de cultivo en todo el mundo y es altamente susceptible a la contaminación por a. flavus. El impacto económico de la contaminación por aflatoxinas en pierde y valor reducido en el maíz puede ser tanto como $ 686,6 millones/año en los Estados Unidos2 con los cambios previstos en el clima global, el impacto de las aflatoxinas podría resultar en mayores pérdidas económicas en maíz con estimaciones tan altas como $ 1,68 billones/año en el futuro cercano2. Teniendo en cuenta los efectos adversos de la económicos y la salud de las aflatoxinas en los seres humanos y ganado, control de aflatoxinas antes de la cosecha de maíz podría ser la manera más eficiente para prevenir la contaminación por aflatoxinas en los alimentos y productos comestibles.
El enfoque de control previo a la cosecha principal de resistencia de aflatoxina en el maíz que se ha utilizado ampliamente en las últimas décadas es principalmente a través de la crianza, que requiere una cantidad significativa de tiempo4. Recientemente, el control biológico ha tenido cierto éxito en la reducción de aflatoxina en gran escala campo aplicaciones5,6. Además de biocontrol, aplicación de vanguardia herramientas moleculares como 'Host inducida por el silenciamiento del gen"(HIGS) a través de RNAi y expresión transgénica de proteínas asociadas a resistencia ha tenido cierto éxito en la reducción del crecimiento de a. flavus y aflatoxina producción en estudios de laboratorio y de campo a pequeña escala. Estos enfoques están siendo optimizados actualmente además de identificar nuevos blancos potenciales del gene de a. flavus para la futura manipulación.
Además de genes que están directamente involucrados en la producción de micotoxinas como potenciales blancos de estrategias para el control transgénicos, amilasas fúngicas han demostrado jugar un papel crítico en mantener la producción exitosa de la patogenesia y micotoxinas durante las primeras etapas de la infección de la planta del anfitrión. Algunos ejemplos incluyen Pythium pleroticum (agente causal de la pudrición del rizoma de jengibre), Fusarium solani (agente causal de la marchitez de la coliflor), donde una correlación positiva entre la actividad y expresión de la patogenicidad y la α-amilasa se observaron 7,8. Inhibición de la actividad de la α-amilasa por golpe de gracia del gene o enfoques precipitación afecta negativamente el crecimiento fungicida, producción de toxina. Un mutante de octavos de final de la α-amilasa de a. flavus fue incapaz de producir aflatoxinas cuando se cultiva en almidón sustrato o degermed granos de maíz9. Del mismo modo, en Fusarium verticillioides una cepa de octavos de final de la α-amilasa no fumonisina B1 (micotoxinas) durante la infección de granos de maíz10. En un estudio más reciente, Gilbert et al., (2018) demostró que una basada en RNAi derribar de la expresión de α-amilasa de a. flavus a través de HIGS redujo significativamente el crecimiento y aflatoxina producción de a. flavus durante la infección del maíz núcleo11 .
Inhibidores específicos de la actividad de la α-amilasa también han producido resultados similares, obtenidos de la abajo-regulación de la expresión de α-amilasa. El primer informe sobre el papel de un inhibidor de la α-amilasa en resistencia fungicida vino desde el aislamiento y la caracterización de un inhibidor de la tripsina-α-amilasa de 14 kDa de líneas de maíz resistentes a . flavus12. Mayor proyección de varios centenares de especies de plantas por Fakhoury y Woloshuk conducido a la identificación de una proteína de tipo inhibidor de la α-amilasa 36 kDa (IABP) de las semillas de frijol Jacinto, Lablab purpureus L.13. La secuencia del péptido de lectinas de IABP se asemejó a perteneciente a la familia de lectinas – arcelin-α-amilasa inhibidor en común registrados haba14,15. IABP purificada no exhibe ninguna actividad inhibidora de tripsina mamífero y mayor caracterización in vitro demostrada una inhibición significativa del crecimiento de a. flavus y la germinación de conidios13. Los informes presentados aquí claramente muestra la α-amilasa puede servir como un destino en los enfoques de control para restringir patógenos o plagas que dependen de la movilización de la almidón (a través de la actividad de la α-amilasa) y adquisición de azúcares solubles como fuente de energía durante su interacción patógena con plantas hospederas.
Alpha-amilasa es conocida por ser crítico en a. flavus patogenicidad9,10,11y dada la importancia de la AILP como un potente anti-a. flavus agente (inhibición de la α-amilasa/antigrowth)13, hemos generado plantas de maíz transgénicas expresando Lablab AILP gene bajo el promotor CaMV 35S constitutivo. El objetivo era investigar si la expresión heteróloga de este inhibidor de la α-amilasa en maíz es eficaz contra a. flavus producción patogenia y aflatoxinas durante la infección del núcleo de maíz. Nuestros resultados demuestran que granos de maíz transgénicos expresando AILP significativamente reducción a. flavus crecimiento y aflatoxina la producción durante la infección del núcleo.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Caisson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amazing Marine Goop</td><td>Productos</td><td></td><td></td>Eclécticos</tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 Sistema en Tiempo Real</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Placas de cultivo de tejidos Falcon, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424 Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer con tapón, 50 mL</td><td>Ace Glass</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroQuant Afla</td><td>Romer Labs</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>Círculos de papel de filtro cualitativo estriado, 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>Horno de aire forzado</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Guantes Mejorados PoliVinilAlcohol Orgánico Resistente a Solventes</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 Incubadora</td><td>Shaker Brunswick</td> Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>de baja forma Griffin Vasos, 100 mL</td><td>DKW Life Sciences</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>de metileno</tr><tr><td>Nexttec Kit de aislamiento de ADN de 1 paso para plantas</td><td>Microscopio Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 con cámara Nikon DS-Qi1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Nikon SMZ25 con iluminador episcópico C-HGFI y cámara Andor Zyla 4.2 sCMOS</td><td></td> Platos de bioensayo cuadrados Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Kit</td> de PCR directo de <td>ThermoFisher Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Viales</td> de policarbonato <td>ThermoFisher Scientific</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>, 15 ml</td><td>OPS Diagnostics</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>Patata Tapón</td> a presión de <td></td><td></td><td></td>caldo de dextrosa</tr><tr><td>, 22 mm</td><td>DKW Life Sciences</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich Kit de</td> ARN total de la planta de espectro Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de molienda de acero inoxidable, 3/8''</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td>de agitación</tr><tr><td>Synergy 4 Fluorímetro</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 jugo</td><td>Campbell's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Hojas lisas de grado cualitativo, grado 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de muñeca</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inhibición del crecimiento de aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de lablab purpureus l.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Contaminación por aflatoxinas en los cultivos de alimentos y piensos es un grave problema en todo el mundo. Las aflatoxinas, producidas por el hongo Aspergillus flavus (a. flavus) son potentes carcinógenos que reducen sustancialmente el valor de la cosecha de maíz y otros cultivos ricos del aceite como maní además de amenaza grave para la salud humana y animal. Diferentes enfoques, incluyendo la cría tradicional, expresión transgénica de proteínas de resistencia asociada y ARN de interferencia (ARNi)-basado en el silenciamiento génico inducido por el anfitrión del crítico a. flavus objetivos gene, están siendo evaluados para aumentar resistencia a aflatoxinas en cultivos susceptibles. Últimos estudios han demostrado un papel importante de α-amilasa en la producción de patogenesia y aflatoxina a. flavus , sugiriendo a este gen enzimático es un blanco potencial para reducir el crecimiento de a. flavus y la producción de aflatoxina. En este sentido, el actual estudio fue emprendido para evaluar expresión heteróloga (bajo control del CaMV 35S promotor constitutivo) de una proteína Lablab purpureus L. como inhibidor de la α-amilasa (IABP) en maíz contra a. flavus. IABP es una proteína de 36 KD, que es un inhibidor competitivo de la enzima α-amilasa de a. flavus y pertenece a la familia de proteínas lectin-arcelin-α-amilasa inhibidor en común haba. Estudios in vitro antes de los trabajos actuales han demostrado el papel de la IABP en la inhibición de la actividad de la α-amilasa de a. flavus y crecimiento del hongo. Crecimiento fúngico y la producción de aflatoxina en granos maduros fueron monitoreados en tiempo real utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus . Este núcleo investigación ensayo (KSA) es muy fácil de configurar y proporciona datos fiables y reproducibles en la infección y el grado de extensión que podría cuantificarse para evaluación de germoplasma y de líneas transgénicas. La fluorescencia de la cepa de la GFP es crecimiento estrechamente correlacionada a hongos y, por extensión, está bien correlacionada con valores de aflatoxina.  El objetivo del presente trabajo fue implementar este conocimiento previo en un cultivo comercialmente importante como el maíz para aumentar la resistencia de la aflatoxina. Nuestros resultados muestran una reducción del 35% – 72% en a. flavus crecimiento expresando AILP transgénicos granos de maíz que, a su vez, traducido en una reducción de 62% a 88% en los niveles de aflatoxina.

Transformación de maíz y detección molecular de las plantas transgénicas
Embriones inmaduros de maíz líneas Hi-II fueron transformados usando la cepa EHA101 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de destino final planta expresando el Lablab purpureus AILP gen bajo el control del CaMV 35S promotor. Cinco líneas de maíz transformadas independientemente fueron avanza...

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Aquí presentamos un ensayo simple de cribado del núcleo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de Aflatoxina en granos de maíz que expresan una proteína antifúngica. Usando una proteína fluorescente verde que expresa la cepa Aspergillus flavus, monitoreamos la infección y propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. Este ensayo simple proporciona un medio confiable para evaluar la capacidad del grano de maíz para resistir la infección por Aspergillus flavus y la producción de Aflatoxina.Los resultados de este ensayo de laboratorio realizado en condiciones controladas en núcleos maduros se correlacionan bien con los resultados de la infección en condiciones de campo. Demostrando el procedimiento estará el Dr.Rajtilak Majumdar, un postdoctorado de nuestro laboratorio, junto con Christine Sickler y David Ambrosio, técnicos de ciencias biológicas también de nuestro laboratorio. Para empezar, pega 20 tapas de presión de dos mm en una placa Petri para crear tapas KSA.Deje secar el pegamento durante 48 horas antes de usar las tapas. En un armario de seguridad biológica rocía una bandeja de bioensayo cuadrada con 70% de etanol en agua. Deje que la bandeja se seque al aire.Agregue papel de cromatografía estéril a la bandeja seca. Rocíe nueve de las tapas KSA con 70% de etanol y déjelas secar al aire. A continuación, coloque las tapas en la bandeja de bioensayo.Para cada línea de maíz transgénico que se está probando, seleccione 20 granos sin daños y colóquelos en un tubo centrífugo de 50 ml. Usando un microscopio estéreo de mesa seleccione sólo kernels no dañados para el ensayo. Los granos dañados son más susceptibles para el ataque de Aspergillus y producen más Aflatoxina, sesgando así los resultados y no representando los verdaderos rasgos antifúngicos o antimicrobianos de la variedad.Añadir 70% de etanol a cada tubo. Deje que los granos se esterilizan durante cuatro minutos mientras ocasionalmente los agitan suavemente. Después de esto verter suavemente el etanol y enjuagar suavemente los granos en agua estéril desionizada tres veces.Obtenga un cultivo de seis días de Aspergillus flavus mancha 70 expresando GFP cultivado en el medio V8. Añadir 20 ml de estéril 0,02%Tritón X-100 en agua desionizada. Y usa un lazo estéril para raspar las esporas.Pipetear el inóculo y transferirlo a un vaso estéril de 300 ml. Prepara una dilución de cinco veces con 0.02%Triton X-100 y usa un hemocicómetro para realizar un recuento de esporas. Diluir de nuevo si es necesario para obtener 100 ml con una concentración de cuatro millones de esporas por ml.Vierte el inóculo en un vaso vacío. Coloque los granos en un vaso de precipitados estéril de 300 ml con una barra de agitación y revuelva durante tres minutos. Usando fórceps transfiera los granos a la placa de bioensayo, asegurándose de colocar sólo un núcleo en cada tapa.Añadir 30 ml de agua desionizada al fondo de cada bandeja de bioensayo. E incubar a 31 grados centígrados durante siete días. Después de siete días de inoculación con A.flavus, tome fotos de cuatro kernels que fueron designados para el análisis microscópico y la fotografía.Luego use un tejido blando y agua desionizada para limpiar el exterior de los granos. Realice secciones longitudinales de los granos e inmediatamente tome fotografías bajo el microscopio fluorescente. Para preparar los granos para el análisis, limpie el exterior de los granos restantes con un tejido blando y agua desionizada.Coloque cuatro granos, que constituyen un rep, en un vial de policarbonato de tapa de tornillo de 15 ml que contenga dos bolas de acero inoxidable. Congele inmediatamente los viales en nitrógeno líquido y guárdelos a 80 grados centígrados hasta que estén listos para continuar con el procesamiento y análisis. Cuando esté listo, retire los granos del congelador y utilice un homogeneizador para molerlos a 1500 rpm durante tres minutos.Utilice los mismos materiales de suelo para el análisis de GFP, la determinación de Aflatoxinas y el análisis molecular, de modo que todos los valores sean representativos de las muestras. Mientras que se recomienda un mínimo de tres réplicas, más siempre es mejor dependiendo de la disponibilidad de kernels de buena calidad. En este estudio, los embriones inmaduros de las líneas HI-II de maíz se transforman utilizando la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA101 que contiene el vector de destino de la planta final que expresa el gen Lablab purpureus AILP bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de coliflor.La amplificación de PCR del gen AILP objetivo mostró un amplón de 548 bp observado sólo en las líneas de maíz transgénico. El gen AILP mostró expresión en las líneas transgénicas, mientras que no se observó ninguna expresión AILP en las plantas de control. Las esporas germinantes en etapa temprana se exponen a extractos de hojas crudas de plantas jóvenes de maíz transgénico durante 20 horas.La alta longitud completa de las esporas expuestas a extractos de hojas transgénicas muestran una reducción de 58 a 80% en comparación con el control negativo. La cepa A.flavus utilizada contiene un reportero de GFP que permite el monitoreo y cuantificación del crecimiento de hongos en tiempo real. Se observa una reducción significativa de la fluorescencia de la GFP en los granos transgénicos de AILP en comparación con el control negativo isogénico.Se observa una reducción significativa en el crecimiento de hongos para las líneas AILP cuatro y cinco, 69% y 72%, respectivamente. Las otras líneas muestran una reducción de 35 a 60% de reducción en comparación con los núcleos de control. Se observó una reducción del 62 al 88% en el contenido de Aflatoxina en los núcleos AILP en comparación con el control.Se considera que la línea cuatro tiene el contenido más bajo de Aflatoxina en 486 ng por g, seguido de otras líneas que van que tenían contenidos que oscilaban entre 640 y 1498 ng por g en los granos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales, como el uso de un fluorómetro para cuantificar la GFP y como su crecimiento fúngico. Los kits comerciales inmunoso o HPLC o EPLC se pueden utilizar para realizar la cuantificación de Aflatoxina.La disponibilidad de KSA proporciona un medio rápido y sencillo para determinar la resistencia a la contaminación por Aflatoxina. Las diferentes líneas de reproducción de maíz se pueden evaluar rápidamente utilizando esta técnica. Si bien el ensayo de cribado del núcleo no es peligroso, el operador debe protegerse de la exposición a las esporas de Aspergillus flavus, utilizar el equipo de protección adecuado.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

Se describe el uso de un método de inyección con aguja para inocular plantas de maíz y teosinto con el patógeno biotrófico Ustilago maydis.  El método de inoculación por inyección de agujas facilita la entrega controlada del patógeno fúngico entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria. Este método es altamente eficiente, permitiendo inoculaciones reproducibles con U. maydis.

Un método rápido y eficiente para evaluar la patogenicidad de Ustilago maydis en las líneas de maíz y teosinte

Se demuestra un método para el análisis de aflatoxinas y expresión de los transgenes en semillas de maní que contienen señales de interferencia de ARN para silenciar genes aflatoxina-síntesis en el hongo Aspergillus flavus. Control de RNAi mediada de micotoxinas en las plantas no se ha informado anteriormente.

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.

Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

Los genes morfogénicos de las plantas se pueden utilizar para mejorar la transformación genética de los genotipos recalcitrantes. Aquí se describe un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium(QuickCorn) para tres importantes líneas de maíz público endogámico.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Para lograr la supresión de la población de Aedes aegypti utilizando el sistema RIDL® (Liberación de Insectos Portadores de un Letal Dominante), es necesario liberar un gran número de mosquitos machos. Esto requiere el uso de técnicas y tecnología de cría masiva para proporcionar sistemas confiables para obtener el máximo número de mosquitos machos de alta calidad.

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

Procedimientos basado en una microplaca se describen para el análisis colorimétrico o fluorométrico de la actividad enzimática extracelular. Estos procedimientos permiten el rápido ensayo de tal actividad en un gran número de muestras del medio ambiente dentro de un marco de tiempo manejable.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Aprende un ensayo de cribado de granos para evaluar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en maíz transgénico. Este método permite monitorear la infección fúngica en tiempo real.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L. (Video) | JoVE Journal

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

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