Name: Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a sembrar e implantar un injerto traqueal biosintético en modelo murino para estudiar mecanismos celulares de regeneración y evaluar el papel de las células mononucleares de médula ósea en la integración del injerto.

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Nos gustaría reconocer Robert Strouse y la división de innovaciones en el Hospital de niños en todo el país por su apoyo y soluciones de información de investigación en diseño gráfico. Este trabajo fue financiado por una subvención del NIH (NHLBI K08HL138460).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital de niños en todo el país.
1. fabricación de andamios
<ol><li>Preparar una solución de precursor de nanofibras de polímeros por: 1) disolver 8 wt % PET 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol y calentar la solución a 60 ° C y disolviendo 2) 3% wt PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una vez enfriado, se combinan las soluciones para crear una mezcla final del polímero de PET y PU (20:80).</li>
	<li>Electrospin la solución PU PET+ en una varilla de acero inoxidable (1 mm de diámetro) utilizando una aguja de punta Roma de 20 G en una jeringa de 60 mL llena con la solución de PET:PU utilizando un juego de suministro eléctrico de alto voltaje DC a + 14 kV en la aguja, otra corriente de alto voltaje de la fuente conjunto a -3 kV , un caudal de 5 mL/h y una distancia de punta a substrato de 20 cm. Gire la varilla a 350 rpm durante la deposición de la fibra.</li>
	<li>Continuar electrospinning hasta logra el espesor deseado andamio de 300 μm. Deslice el andamio de la varilla, luego sostenga bajo vacío durante la noche para quitar cualquier solvente residual.</li>
	<li>Esterilizar el andamio con una dosis de luz ultravioleta de 350 mJ/cm2 antes de la implantación.</li>
</ol>2. médula ósea de células mononucleares (MNC-BM) cosecha
<ol><li>Eutanasia a un 6-8 semanas ratón viejo, mujer, C57BL/6 con un cóctel de ketamina (200 mg/kg) y xilacina (20 mg/kg), ketoprofeno (10 mg/kg). Compruebe la eutanasia completa por el método de cola-pinch. Asegúrese de seguir las pautas locales para eutanasia.</li>
	<li>Bajo condiciones estériles, retirar la piel sobre los fémures y tibias para exponer hueso con tijeras finas y pinzas de Adson micro. Use pinzas Dumont #5 y pinzas Dumont #5/45 para quitar la fascia y los tendones. Separar los huesos y cortar cada uno de ellos en los extremos. Usando una jeringa de 5 mL y una aguja de 25G, lavar la médula ósea en una placa Petri que contiene 30 mL de medio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI). Filtrar esta RPMI con médula ósea a través de un tamiz de celular 70 μm de nylon en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad, coloque 5 mL de polysurcrose y sodio Diatrizoato en un tubo de 15 mL. Suavemente agregar el RPMI conteniendo las células mononucleares de médula ósea por el lado del tubo para evitar la mezcla de las dos capas. Centrífuga a 461 x g por 30 min con "freno de 1" a 24 ° C. Nota: En nuestra centrífuga, soportes de freno 1 para el más largo ejecutan a tiempo durante la desaceleración.</li>
	<li>De las tres capas formadas, descartar la capa superior (rosa) de plasma y recoger la capa del medio (clara) que consiste en las células mononucleares de médula ósea. Descarte el precipitado de células de sangre rojas.</li>
	<li>Diluir las células mononucleares de la médula (BM-MNC) en tampón fosfato salino (PBS) en una proporción 1:1 y centrifugar a 461 x g por 10 min con "freno de 9" a 24 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y diluir el sedimento con 5 mL de PBS. Centrífuga a 461 x g por 10 min con "freno de 9" a 24 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y diluir el sedimento con ~ 10 mL de RPMI.</li>
	<li>Diluir 10 μl de la solución de BM-multinacional con un volumen igual de tripano 0.4% azul en un tubo de 1 mL. Lugar 10 μl de la solución en una celda de diapositivas cámara de conteo. Contar las células usando un contador de células automatizado. Repita el paso y calcular el número medio de células. Nota: Un recuento celular promedio de 1 X 108 células se obtuvo de la utilización de dos ratones de donantes. Esto sería equivalente a dos fémur y dos tibias que la médula del hueso se aísla de.</li>
	<li>Centrifugue la solución BM-MNC a 461 x g por 10 min con el "Freno de 9" a 24 ° C. Quite el sobrenadante y diluir la concentración de células a 107 células/injerto. Nota: Hemos estudiado la siembra rendimiento entre 1, 10 y 100 millones de células y encontró que 10 millones de células por injerto produce la mayor eficiencia de la siembra.</li>
</ol>3. siembra en los injertos de células
<ol><li>Medir las longitudes de los andamios y si es necesario, cortar a una longitud de 5 mm.</li>
	<li>Humedezca previamente el andamio con 5 μl de RPMI 5 minutos Retire el RPMI.</li>
	<li>Añadir 5 μl de la solución de BM-MNC a la luz del andamio durante 10 minutos.</li>
	<li>Pasar una aguja de 21G a través del lumen del injerto e incubar el injerto en 1000 μl de RPMI durante la noche a 37 ° C en una incubadora.</li>
</ol>4. implantación de injerto
Nota: Se debe tener cuidado para mantener la técnica aséptica durante el procedimiento de implantación de injerto.
<ol><li>Utilizar ratones C57BL/6 femeninos 6-8 semanas de edad como receptores de los injertos de células sembradas. Inyectar la enrofloxacina (10mg/kg) subcutáneamente 24 h antes de la cirugía y justo antes de la incisión.</li>
	<li>Peso del ratón y administrar una dosis de 0,1 mL/10 g de Cóctel anestésica de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), ketoprofeno (5 mg/kg) como analgesia por vía intraperitoneal.</li>
	<li>Compruebe si el plano de la anestesia se ha logrado por el método de cola-pinch. Confirmando el nivel de sedación, aplique un ungüento oftálmico estéril a los ojos y clip de pelo en el sitio quirúrgico desde la barbilla a las clavículas. Coloque el animal en una plataforma en una posición decúbito dorsal. Desinfectar el sitio quirúrgico usando primero una almohadilla de preparación de povidona-yodo seguida de una almohadilla de la preparación del alcohol (alcohol al 70%) y una vez más una almohadilla de preparación del povidone-yodo.</li>
	<li>Colocar el animal con el microscopio de disección con la cabeza del cirujano. Haga una incisión de línea media que van desde las clavículas hasta el hueso hioides con la ayuda de tijeras finas y pinzas de Adson micro. Limpie la fascia con Dumont #5 y Dumont #7 Pinzas finas, junto con un hisopo de algodón estéril si es necesario y colocar un retractor auto retención de Colibri.</li>
	<li>Abrir los músculos de la correa (figura 3A) con unas pinzas finas Dumont #5 y #7 Dumont para exponer el cartílago tiroides, cartílago cricoides y la tráquea. Sin rodeos, separar la tráquea de los nervios laríngeos recurrentes, paralela a cada lado, seguido por separación circunferencial de la tráquea del esófago (figura 3B).</li>
	<li>Utilizando una aguja de 20G y marcador quirúrgico, mancha de la porción anterior de la tráquea.</li>
	<li>Identificar la tráquea y hacer una incisión por debajo del tercer anillo del cartílago traqueal y transecto la tráquea usando un par de tijeras de Vannas-Tubingen primavera y un par de Pinzas finas Dumont #7. Sujetándola con las pinzas curvas finas, asegure la tráquea distal al esternón mediante estéril sutura de nylon 9-0 para crear una traqueotomía temporal (figura 3C). Nota: Un material de sutura alternativos que puede utilizar es el 9-0 PDS para reapproximation de implantación y el músculo traqueal.</li>
	<li>Con una aguja de 20G y un marcador quirúrgico, mancha el injerto para representar la porción anterior.</li>
	<li>Implante del injerto inserción proximal-posterior, lateral proximal y suturas proximal anterior, en ese orden con sutura de nylon estéril de 9-0 (figura 3D), Dumont #7 fina pinzas y un sostenedor de la aguja.</li>
	<li>Gire el animal 180° para colocar la cola del cirujano. Comunicado de la traqueotomía temporal. Incompleto es transversalmente la tráquea distal para permitir el uso del segmento resecado como un tocón para retracción. Cuando ya no sea necesario, el segmento de tráquea de 5 MM se elimina completamente.</li>
	<li>Completar la anastomosis distal mediante la colocación de las suturas en la manera similar como la anastomosis proximal.</li>
	<li>Volver a aproximar la posición del injerto y los músculos de la correa. Cerrar la incisión con suturas de nylon estéril de 9-0 en un patrón de marcha.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea 0,1 mL de buprenorfina (0.1 mg/kg) y coloque el animal en una jaula de recuperación a una almohadilla de calefacción sin otros animales en la jaula.</li>
	<li>Observar el ratón hasta que es consciente y capaz de andar, luego transferir el ratón a una nueva jaula con ropa de cama blanda, húmeda chow y agua medicada (ibuprofeno, 30 mg/kg) durante 48 h. Después de este período de tiempo, volver el ratón en una jaula normal con otros ratones. Nota: Ratones que mantienen la dificultad respiratoria o disminución de la actividad después de la implantación son observados por personal de laboratorio o animales en una incubadora de 32 ° C. Si esto continúa por más de 48 h, los ratones deben ser sacrificados.</li>
</ol>5. histología e inmunohistoquímica
Nota: Manchas Hematoxylin y la eosina se realizaron mediante técnica estándar por núcleo de morfología de Hospital de los niños en todo el país. Immunohistochemistry fue realizado según los pasos siguientes.
<ol><li>Desparafinizar las diapositivas usando 1) xileno para 5 min, 2) xileno durante 5 min, etanol 3) 100% por 5 min, etanol 4) 90% por 5 min, etanol al 5) 70% por 5 min, 6) destilada de H2O (dH2O) durante 5 minutos.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos en solución tampón de citrato y colocar en olla a presión llena de agua. Calentar durante 10 minutos y luego deje que se enfríe a temperatura ambiente. Lavar con seroalbúmina bovina al 0.1% en PBS (BSA-PBS) durante 5 minutos enjuague con dH2O. Nota: Calefacción puede hacerse también con un baño de agua caliente o microondas durante 15 minutos.</li>
	<li>Incube los portaobjetos con suero de cabra normal del 3% en PBS por 1 h a temperatura ambiente. Lave con 0.1% BSA-PBS por 5 min incubar en anticuerpo primario con concentraciones de queratina 5 (1: 1000)6, queratina 14 (1: 250)6 y F4/80 (1: 100)7 h 18 durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar con 0.1% de BSA-PBS dos veces 10 minutos cada lavado. Incubar con el anticuerpo secundario apropiado en concentración de 1: 500 para K5/K14 y 1:300 F4/80 por 1 h a temperatura ambiente. Lavar con 0.1% de BSA-PBS dos veces 10 minutos cada lavado.</li>
	<li>Montaje con 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) que contiene montaje cubreobjetos de vidrio y medios de comunicación. Dejar para reposar 30 minutos antes de la proyección de imagen.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
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<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
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<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

El desarrollo de un modelo de ratón para traquear de ingeniería tisular es esencial en la comprensión de los factores que han limitado la traducción clínica de las TETGs; es decir, colapso del injerto, estenosis y epitelización retardada4. Algunos factores que contribuyen a estas limitaciones incluyen la selección del material de injerto, proceso de fabricación, diseño de andamio y célula siembra protocolos. Este modelo permite la más rápida evaluación de estos factores para entender los mecanismo...

Defectos traqueales de segmento largo se presentan como condiciones congénitas raras como anillos traqueales completos y agenesia traqueal, así como traumatismo, malignidad e infección. Cuando superior a 6 cm en adultos o 30% de la longitud traqueal en niños, estos defectos no pueden ser tratados por la reconstrucción quirúrgica. Intentos de sustituir las vías respiratorias con tejido autólogo, trasplante cadavérico y construcciones artificiales han sido plagados por infección crónica, granulación, falla mecánica y la estenosis.
Ingeniería tisular traqueales injertos (TETGs) potencialmente pueden abordar estos problemas, evitando la necesidad de inmunosupresión de por vida. En la última década, TETGs han sido probadas en modelos animales y utilizado clínicamente en raras ocasiones de uso compasivo1,2,3. En estudios animales tanto y grandes, recuperación postoperatoria de reemplazo de ingeniería tisular de la vía aérea requiere numerosas intervenciones a la estenosis de combate (definido como > enangostar luminal de 50%) y mantener la permeabilidad de las vías respiratorias. Trabajo adicional del TETG ha intentado reducir la estenosis a través de la evaluación de la función de célula siembra elección, vascularización y diseño de andamios. Andamio diseño dirigido a restaurar la tráquea nativa estructura/función y opciones de siembra de células se han enfocado principalmente en las células epiteliales respiratorias y condrocitos sembrados en varios andamios reabsorbibles y no reabsorbibles y decellularized. Como vascularización probablemente juega un papel importante en el desarrollo de estenosis, otros grupos se han centrado en optimizar en vitro o heterotópicos modelos para agilizar la revascularización o neoangiogenesis4. Sin embargo, lograr éxito vascularización manteniendo también un TETG mecánicamente competente y funcional sigue siendo un desafío. A pesar de los avances recientes, minimizando la estenosis sigue siendo un obstáculo crítico para la traducción clínica.
Para investigar la respuesta histopatológica a TETG implantación en vivo, hemos desarrollado un modelo ovino de ingeniería tisular reemplazo traqueal. El injerto fue compuesto de una mezcla de polietileno tereftalato (PET) y poliuretano andamio de electrospun (PU) sembrado con células mononucleares de médula ósea (BM-multinacionales). En esta cohorte pequeña, demostramos que empresas multinacionales BM autólogas sembradas aceleraron la reepitelización y retrasó estenosis5. Aunque la siembra con autólogo BM-multinacionales mejoradas la supervivencia, el mecanismo celular por el cual BM-MNCs modulan la formación de neotissue funcional sigue siendo confuso.
Investigación sobre el desarrollo requiere nivel celular de un modelo murino de tejido había diseñado reemplazo traqueal. Similar al estudio ovino, utilizamos un andamio de electrospun PET:PU con BM-MNCs. en concordancia con el modelo ovino, estenosis TETG desarrollado a lo largo de las dos primeras semanas tras la implantación1,2,3 ,5. Esto sugiere que el modelo murino recapituló la patología observada anteriormente, permitiéndonos además interrogar los mecanismos celulares subyacentes a la estenosis de la vía aérea.
En este informe, detallamos nuestro protocolo para ingeniería de tejidos reemplazo traqueal en el modelo de ratón incluyendo la fabricación de andamios, aislamiento BM-MNC, injerto siembra e implantación (figura 1, figura 2).

<table><tbody><tr><td>Inyección de cloruro de sodio al 0,9%</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>pipeta serológica de 10 cc</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1,5 pulgadas. Aguja</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25cc pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 pulg. Aguja</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>tubo 50cc</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Baytril (enrofloxacina)</td><td>Bayer Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de monofilamento de poliamida negra, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/ 6, mujeres</td><td>Jackson laboratories</td><td>664</td><td>6-8 semanas de edad</td></tr><tr><td>Tampón de citrato pH 6.0 20x concentrado</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Retractores Colibri</td><td>F.S.T</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Citoqueratina 14 Anticuerpo monoclonal</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45</td><td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Pinzas finas</td><td>F.S.T</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Anticuerpo anti-ratón para ratas</td><td>Bio-Rad MCA497R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas- Afiladas-romas</td><td>F.S.T</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Cover Glasses</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Medios de montaje con DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG anti ratón cabra Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti conejo IgG Secundario Anticuerpo Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti rata IgG Secundaria Anticuerpo Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofeno</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de yodo</td><td>Desechables profesionales international, Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de queratina 5, BioLegend purificado</td><td></td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de ketamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Micro-Adson</td><td>F.S.T</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas no tejidas</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra Productos veterinarios</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (Polietileno Tereftalato & Andamios de poliuretano)</td><td>Soluciones</td><td></td> de nanofibras <td>Placa</td></tr><tr><td>de Petri</td> ordenada a medida <td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH Portaagujas/Pinzas</td><td>Micrinas</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Tijeras de resorte bingen</td><td>F.S.T</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Recirculador de agua tibia</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Solución estéril de xilacina</td><td>Akorn salud animal</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Opciones de tratamiento para los defectos traqueal congénita o secundaria larga del segmento históricamente han limitado debido a una incapacidad para reemplazar tejido funcional. Ingeniería de tejidos es muy prometedor como una posible solución con su capacidad para integrar las células y moléculas de señalización en un andamio de 3 dimensiones. Trabajo reciente con ingeniería tisular traqueal injertos (TETGs) ha visto cierto éxito, pero su traducción ha estado limitada por la estenosis del injerto, injerto el colapso y retrasa la epitelización. Con el fin de investigar los mecanismos de conducción de estas cuestiones, hemos desarrollado un modelo de ratón para la implantación de prótesis traqueal de ingeniería tisular. TETGs fueron construidos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) y poliuretano (PU) en una mezcla de PET y PU (20:80 peso de por ciento). Andamios entonces fueron sembrados utilizando células mononucleares de médula ósea aisladas de 6-8 semanas-viejos ratones C57BL/6 por centrifugación del gradiente. 10 millones de células por injerto fueron sembradas en el lumen del andamio y permitir incubar durante la noche antes de la implantación entre el tercer y séptimo traqueal. Estos injertos eran capaces de recapitular los resultados de la estenosis y retrasa la epitelización según lo demostrado por análisis histológico y la falta de queratina 5 y 14 de queratina las células epiteliales basales en la inmunofluorescencia. Este modelo servirá como una herramienta para la investigación de los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la remodelación de la sede.

La figura 1 muestra un esquema de TETG siembra e implantación. La médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6 y cultivadas en vitro. BM-multinacionales fueron aisladas por centrifugación de densidad y sembradas en el TETG. TETGs sembrados fueron implantados en un ratón receptor syngeneic de C57BL/6.
Figura 2 es un resumen del andamio TETG PET:PU proceso de fab...

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Las aplicaciones clínicas de la tráquea con ingeniería tisular han sido limitadas debido a la estenosis del injerto y la epitelización tardía. Un modelo de ratón de reemplazo ortotópico traqueal permite el estudio de los mecanismos celulares que impulsan la regeneración. Los defectos de segmento largo de las vías respiratorias pueden exceder lo que las terapias actuales son capaces de curar.La tráquea con ingeniería tisular ofrece el potencial de crear un órgano de reemplazo para estas condiciones. Este modelo se puede aplicar a animales con propiedades transgénicas y de trazado de linaje. A continuación, podemos modular los factores del huésped que contribuyen a la regeneración del injerto.Uno de los desafíos clave en la producción de los andamios será medir y determinar que los parámetros de electrospinning son los mismos cada vez. Así que cada vez que se produce un andamio, es necesario medir la distancia de punta a colector, la humedad y la temperatura para asegurar que los andamios son los mismos cada vez. Crítico para el éxito de este modelo es el refinamiento de las técnicas microquirúrgicas y el mantenimiento del plano correcto de la anestesia para permitir la ventilación espontánea durante todo el procedimiento.Dado que la tráquea huésped tiene un diámetro interno de alrededor de un milímetro, el manejo del tejido nativo y el manejo del tejido nativo y la colocación de la sutura son importantes y se demuestran mejor visualmente. Comience por disolver el tereftalato de polietileno ocho por ciento, o PET, en hexafluoroisopropanol y calentar la solución resultante a 60 grados Celsius. Mientras se calienta la solución, disolver tres por ciento de peso de poliuretano, o PU, en hexafluoroisopropanol, combinando las soluciones una vez que la solución PET se haya enfriado.Cargue una jeringa de 60 mililitros equipada con una aguja de punta contundente de calibre 20 con la mezcla de polímeros. Utilice la jeringa y una fuente de alimentación de CC de alto voltaje establecida en 14 kilovoltios positivos en la aguja, otra fuente de alimentación de CC de alto voltaje establecida en menos tres kilovoltios, una velocidad de flujo de cinco mililitros por hora y una distancia de 20 centímetros de punta a sustrato para electrospiner el polímero en una varilla de acero inoxidable de un milímetro de diámetro girando a 350 rotaciones por minuto. Continúe electrospinning hasta que se alcance un espesor de pared de andamios de 300 micrómetros.A continuación, deslice el andamio de la varilla, coloque el andamio al vacío durante la noche para eliminar cualquier disolvente residual y esterilizar el andamio con una dosis de luz ultravioleta de 350 milólios por centímetro cuadrado durante unos 15 minutos. En condiciones estériles, retire la piel de las extremidades traseras de un ratón C57-Black/6 de seis a ocho semanas de edad con tijeras finas y fórceps micro-Adson, y utilice los fórceps Dumont número cinco y los fórceps Dumont número 5/45 para eliminar la fascia y los tendones. Separe los huesos para permitir que cada uno de ellos se corte en ambos extremos, y utilice una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25 para lavar la médula ósea en un plato de Petri que contenga 30 mililitros de medio RPMI.Cuando todos los huesos hayan sido lavados, filtre la médula ósea a través de un colador de células de nylon de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y transfiera el tubo a un gabinete de bioseguridad. Agregue suavemente la solución celular mononuclear filtrada por el lado de un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de polisucina y diatrizoato de sodio sin mezclar las capas, y separe el plasma de los glóbulos blancos y rojos por separación de gradiente de densidad. Al final de la centrifugación, recoger la capa transparente media que consiste en las células mononucleares de la médula ósea, y lavar las células mononucleares de la médula ósea en una proporción de uno a uno en PBS por centrifugación.Resuspender el pellet en cinco mililitros de PBS para un segundo lavado, seguido de resuspensión en 10 mililitros de medio DE RPMI fresco para el recuento. Luego, recoger las células con una centrifugación adicional, y diluir las células a una por 10 a las siete células por cinco microlitros de concentración de RPMI fresca. Antes de sembrar el andamio, corte el polímero a una longitud de cinco milímetros según sea necesario, y moje el andamio con cinco microlitros de RPMI medio durante cinco minutos.Al final de la incubación, retire el exceso de medio y cargue el lumen del andamio con cinco microlitros de la solución de célula mononuclear de médula ósea durante 10 minutos. A continuación, inserte una aguja de calibre 21 a través del lumen del andamio y coloque el injerto en un mililitro de RPMI medio durante la noche en una incubadora de grados Celsius de 37 grados. Después de la inducción de la anestesia general, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del ojo en el animal receptor, y aplique un ung ón en los ojos del animal.Sujeta el cabello en el sitio quirúrgico de la barbilla a las clavículas, y coloca el animal en una almohadilla quirúrgica en una posición dorsal reclinado. Usando una técnica aséptica, desinfecte el sitio quirúrgico con un povidona-yodo secuencial, 70%etanol, serie de toallitas de yodo povidona, y mueva el ratón bajo un microscopio diseccionado con la cabeza a las 12 en punto. Utilice tijeras finas y fórceps micro-Adson para hacer una incisión de línea media desde las clavículas hasta el hueso hioides, y utilice Dumont número cinco y el número siete fórceps finos y un hisopo de algodón estéril para limpiar la fascia antes de insertar un retractor Colibri autoconservable en la incisión.Usa los fórceps para abrir los músculos de la correa para exponer el cartílago tiroideo, el cartílago cricoide y la tráquea, y separa la tráquea de los nervios laríngeos recurrentes que corren paralelos a ambos lados del tejido, seguidos de la separación circunferencial de la tráquea del esófago. Usando una aguja de calibre 20 y un marcador quirúrgico, manche la porción anterior de la tráquea. Haga una incisión debajo del tercer anillo de cartílago traqueal usando un par de tijeras de resorte Vannas-Tubingen y un par de fórceps finos número de Dumont para resecar una sección de tres anillos de la tráquea.Sosteniendo la tráquea con los fórceps curvos finos, utilice una sutura de nylon estéril 9-0 para asegurar el extremo distal de la tráquea al esternón para crear una traqueotomía temporal, y utilice la aguja del calibre 20 y el marcador quirúrgico para manchar la porción anterior del injerto anterior. Para implantar el injerto, utilice una sutura de nylon estéril 9-0, Dumont número siete fórceps finos, y un soporte de aguja para insertar los puntos posteriores proximales, laterales proximales y proximal-anteriores, y gire el animal 180 grados. Cuando el ratón esté en posición, suelte la traqueotomía temporal y haga una incisión lateral a cinco milímetros de distancia de la parte anterior del injerto para facilitar la anastomosis distal.Para completar la anastomosis distal, coloque las suturas de manera similar a la anastomosis proximal, y vuelva a aproximar la posición del injerto y los músculos de la correa. Luego, cierre la incisión con suturas de nylon estériles 9-0 en un patrón de carrera, y coloque el animal solo en una jaula de recuperación colocada en una almohadilla de calentamiento con monitoreo hasta la recuperación completa. Dos semanas después de la implantación, algunas células epiteliales basales pueden observarse mediante queratina de células basales cinco y 14 manchas en secciones de tejido de injerto traqueal con ingeniería tisular.Las células basales también se detectan en la superficie luminal del injerto a los siete días después de la implantación. Tras la explantación y el análisis histológico, la estenosis del injerto se ha identificado como el principal factor que contribuye en ratones implantados por injertos que demuestran signos de dificultad respiratoria y estridor. Tenga en cuenta que el telescopio del injerto y la tráquea nativa es un hallazgo común como resultado de la técnica quirúrgica.La tinción de F4/80 revela macrófagos host dentro de la región estenótica del injerto junto con la presencia de las células epiteliales basales. Evite la manipulación de los nervios laríngeos recurrentes y asegúrese de que las suturas proximales y distales estén en su lugar para permitir un sello hermético en la anastomosis. Como este protocolo trata de células mononucleares de médula ósea derivadas de ratones agente de nivel de bioseguridad de un agente, es importante llevar un equipo de protección personal adecuado para evitar la contaminación.

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Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal

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