Name: Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprende a inducir hepatitis autoinmune por fármacos en ratones BALB/c para estudiar mecanismos patógenos y diferencias sexuales. Este modelo reproducible permite analizar respuestas inmunes y progresión de la enfermedad hepática.

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El Dr. Njoku desea agradecer al Dr. Noel R. Rose, MD PhD, por su orientación y discusiones perspicaces que resultaron en la formulación de este modelo.

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La fuerza de este protocolo radica en su reproducibilidad; por lo tanto, es fundamental cumplir con los pasos sugeridos. La formulación del inmunógeno puede ser una barrera para algunos; sin embargo, hemos reproducido nuestro modelo utilizando el epítopo descrito en nuestro documento, que elimina la necesidad de aislar la fracción S100 del hígado. Es probable que se puedan alterar epítopos o proteínas adicionales e inducir hepatitis después de las inmunizaciones; sin embargo, describimos aquellas proteínas que hemos util...

El propósito de este método es describir un modelo de ratón de hepatitis autoinmune inducida por fármacos que se desarrolla in vivo y demostrar cómo se puede utilizar para investigar las bases moleculares, inmunológicas y genéticas de esta enfermedad. El objetivo a largo plazo de nuestros estudios es descubrir mecanismos responsables del desarrollo de inflamación y lesión hepática crónica mediante el estudio de la DIH en pacientes susceptibles. La enfermedad hepática y la cirrosis constituyen la sexta causa más común de muerte en adultos entre las edades de 25 y 64 años. El DILI idiosincrásico, a veces denominado hepatitis autoinmune inducida por medicamentos (DIH, por sus siglas en inglés) es la tercera causa más común de insuficiencia hepática aguda en los Estados Unidos. DiH es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente 9 a 12% de los pacientes con hepatitis1 autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres 2,3,4. Un tipo de DIH se desarrolla en individuos susceptibles después de la administración de anestésicos volátiles halogenados como isoflurano, sevoflurano, desflurano o halotano. Estos anestésicos se unen covalentemente a las proteínas hepáticas con productos reactivos de su metabolismo, creando así nuevos autoantígenos capaces de provocar respuestas alérgicas o autoinmunes5.
El estudio de los mecanismos patógenos involucrados en el desarrollo de anestésicos y cualquier forma de DIH se ha visto obstaculizado previamente por la falta de un modelo animal que imite de cerca la inducción de la enfermedad humana. Hemos desarrollado un modelo murino experimental de DIH con características que se asemejan a DILI inmunomediado en pacientes. La hepatitis es inducida por la inmunización con uno de los dos autoantígenos que han sido modificados covalentemente por el metabolito cloruro de trifluoroacetilo (TFA) que se forma después del metabolismo oxidativo del anestésico por la enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)5. Un autoantígeno es la fracción hepática citosólica S100 hepática, que es una mezcla de varias proteínas6, y el segundo autoantígeno es un epítopo de CYP2E1 que es reconocido por sueros de pacientes con DILI7 inmunomediado con anestesia. Mediante el uso de ratones BALB/c, que son relativamente resistentes a la hepatitis autoinmune experimental, distinguimos nuestro modelo del modelo de inmunización inducido por S100 de hepatitis autoinmune en ratones C57Bl/6J8.
Debido a sus diversas presentaciones clínicas, la DIH es difícil de estudiar en pacientes. Los modelos experimentales traslacionales ofrecen la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad in vivo e in vitro. En la actualidad, no existen otros métodos alternativos para inducir diH que examinen completamente las respuestas inmunes adaptativas o innatas in vivo o in vitro sin el uso de animales. Además, dado que la trifluoroacetilación de S-100 o del epítopo CYP2E1 no parece producir un inmunógeno irritante, y estamos induciendo DIH mediante la inmunización con proteínas alteradas por TFA, estos animales no recibirán éter, ningún anestésico halogenado, barbitúrico o alcohol antes de la inmunización u otros procedimientos, considerando que estos agentes pueden alterar los parámetros que estamos estudiando. Aun así, hemos disminuido nuestro uso de ratones mediante el uso de simulación por computadora para confirmar las preferencias de unión de nuestro epítopo CYP2E1descubierto 9 y hemos reflejado el DIH humano que implica el sexo femenino al demostrar que los ratones hembra BALB / c desarrollan un DIH10 más severo.
A pesar de las diversas presentaciones de DIH en pacientes y los desafíos en el estudio de la enfermedad clínica, la modificación post-traduccional de proteínas nativas por metabolitos reactivos de fármacos es un mecanismo clave aceptado en la patogénesis DIH que sigue a los anestésicos halogenados11. Los investigadores también aceptan que cyp2E1 es un autoantígeno importante en este proceso12,13. El papel de las células T CD4+reguladas por la interleucina (IL)-4-upregulated que reconocen un CYP2E1 modificado post-traduccionalmente y otras proteínas hepáticas es un iniciador aceptado de DIH anestésico al atraer neutrófilos, eosinófilos y mastocitos al hígado14, y este mecanismo se ha confirmado en muchas formas de DIH15,16. Las células T CD4+CD25+(Tregs) que expresan FoxP3 inducidas reducen la gravedad de la DIH, y las deficiencias relativas de estas células en el bazo empeoran la DIH 10,7. Por lo tanto, la mayoría de los avances en la comprensión de la DIH han sido posibles mediante la utilización de modelos de ratón in vivo para evaluar los mecanismos genéticos, metabólicos e inmunológicos de la DIH tanto in vivo como in vitro.
Debido a que nosotros y otros investigadores hemos descubierto roles para IL-4, neutrófilos y eosinófilos en el inicio de DIH utilizando diferentes modelos de ratón, creemos que esta observación apoya nuestra afirmación de que, independientemente del modelo DIH utilizado, la hepatitis y las lesiones son inducidas por IL-4. La fuerza de nuestro protocolo radica en la utilización de la metodología in vivo, tanto en ratones machos como hembras, y la repetición de histología, ensayos de proliferación de células T CD4+ y citoquinas. La fuerza de nuestro uso de estudios in vitro es que reducen el número de ratones necesarios al tiempo que proporcionan la metodología para aislar las interacciones celulares que impulsan la DIH. Recomendamos el uso de ratones machos y hembras porque esto reduce la posibilidad de sesgo inconsciente en la interpretación de los resultados y fortalece el potencial de traducción de nuestros estudios, ya que la incidencia, prevalencia y gravedad de la DIH es mayor en las mujeres17. Recomendamos que los ratones se obtengan de un solo proveedor; sin embargo, si esto no es posible, obtenga controles de pareja de camada o ratones de tipo salvaje del mismo proveedor que los ratones genéticamente alterados.

<table><tbody><tr><td>0,1% 2,4,6-trinitrobenceno ácido sulfónico (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Kit de sustrato</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c ratones</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Kit de proliferación celular CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR Reactivo bloqueante</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento general</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; células criopreservadas</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Vivo/Muerto Reparable Kit de tinción Aqua Dead Cell &nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Millipore Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lista de toxinas para la tos ferina</td> Productos <td>biológicos</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Inhibidor de la proteasa Mini comprimidos, sin EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)</td><td>Millipore Sigma 177474</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casetes de diálisis Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade; Solución SDS, 10 %</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones balb/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

La hepatitis autoinmune inducida por fármacos (DIH) es el proceso de hipersensibilización inducido por fármacos hepáticos más común observado en aproximadamente el 9 al 12% de los pacientes con hepatitis autoinmune. La abrumadora mayoría de los pacientes con DIH son mujeres. Los mecanismos subyacentes de estas diferencias de sexo en la prevalencia no están claros debido a la escasez de modelos animales que imitan la enfermedad humana. Aun así, se cree ampliamente que los mecanismos subyacentes están asociados con los haplotipos de antígenos leucocitarios humanos y las hormonas sexuales. En contraste, utilizando un modelo de ratón DIH, hemos descubierto que las células T CD4 + iniciadas por IL-4 dirigidas contra un epítopo del citocromo P450 2E1 inducen la afluencia de neutrófilos, macrófagos y mastocitos en los hígados de ratones hembra BALB / c. Usando este modelo, también hemos demostrado que las células T reguladoras FoxP3 + inducidas por IL-33 confieren protección contra DIH en ratones hembras y machos. Este modelo de DIH es inducido por la inmunización de ratones con un epítopo de CYP2E1 que ha sido alterado covalentemente con un metabolito del fármaco que se ha asociado con DIH. Este epítopo es reconocido por pacientes con DIH. Nuestro método induce hepatitis y autoanticuerpos robustos y reproducibles que se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de la DIH. Si bien los estudios in vivo pueden causar dolor y angustia indebidos en ratones cuando se realizan incorrectamente, la ventaja de un modelo in vivo es la capacidad de evaluar la patogénesis de la enfermedad en un gran número de ratones. Además, los efectos biológicos de las proteínas hepáticas alteradas se pueden estudiar mediante procedimientos invasivos. La adición de estudios in vitro al diseño experimental permite una rápida repetición y análisis mecanicista a nivel celular. Por lo tanto, demostraremos nuestro protocolo modelo y cómo se puede utilizar para estudiar los mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

El calendario de inmunización utilizado para inducir diH que se muestra en la Figura 1 representa las dos inmunizaciones requeridas en la base del cuello (día 0) y la base de la cola (día 7). La Figura 2 muestra datos representativos de proliferación obtenidos en el día 14 utilizando CFSE en respuesta a CYP2E1, JHDN5, el epítopo CYP2E1 y el metabolito trifluoroacetilo (TFA) de los anestésicos. La Figura 3 muestra la estrategia de ga...

Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

La enfermedad hepática y la cirrosis son la sexta causa más común de muerte en adultos de entre 25 y 64 años. La DILI idiosincrásica, a veces denominada hepatitis inducida por fármacos, autoinmune o inmunomediada, es la tercera causa más común de insuficiencia hepática aguda en los Estados Unidos y es el proceso de hiposensibilización hepática inducido por fármacos más común. Este proceso ocurre en aproximadamente el 9 al 12% de los pacientes con hepatitis autoinmune, y esta forma de hepatitis es la razón más común por la que un medicamento se retira del mercado comercial.La inmensa mayoría de los pacientes con hepatitis inducida por fármacos son mujeres. Este protocolo describe las características críticas observadas en los pacientes, como la hepatitis, los autoanticuerpos y las diferencias de sexo. La principal ventaja de esta técnica es su reproducibilidad en un modelo de ratón in vivo, lo que da a los científicos la oportunidad de observar el desarrollo de la enfermedad y sus secuelas.Usando este protocolo, descubrimos un epítopo común en la hepatitis anestésica y viral que es un epítopo dominante en pacientes con hepatitis anestésica, y se asocia significativamente con fibrosis en pacientes con hepatitis viral. Creemos que esta información se puede utilizar para desarrollar pruebas diagnósticas específicas para la hepatitis viral o inducida por medicamentos o la fibrosis asociada que, con suerte, pueden predecir individuos en riesgo de desarrollar esta enfermedad o sus secuelas. Las técnicas escritas pueden ser abrumadoras porque siempre utilizamos varios controles y equilibrios para garantizar la reproducibilidad de nuestros resultados.La primera vez que hagas el experimento, date el tiempo suficiente. Después de la primera vez, va bastante rápido. Después de la eutanasia del ratón BALB/c, use una incisión en la línea media para exponer el contenido intraabdominal con tijeras microquirúrgicas y haga una pequeña incisión en la vena cava inferior para extraer la sangre.A continuación, coloque un angiocatéter de calibre 24 en la vena porta. Mantenga el PBS en un baño de agua a cuatro grados centígrados y use una bomba peristáltica para profusar el hígado con 40 mililitros de PBS a razón de 10 mililitros por minuto. Con unas microtijeras, libere con cuidado el hígado del abdomen y péselo en un bote de pesaje tarado.Corta el hígado en pedazos pequeños de 10 a 15 milímetros. Agregue las muestras de hígado, así como el tampón de homogeneización, cuatro veces el peso de un hígado de ratón, a un tubo de polipropileno de 15 mililitros y complemente con tabletas completas de cóctel de inhibidores de proteasa, según el manuscrito. Utilice un homogeneizador de tejidos de laboratorio general a velocidad media para homogeneizar las muestras en hielo hasta que queden suaves.Centrifugar el hígado homogeneizado a 1.500 veces G durante 10 minutos y luego verter el sobrenadante citosólico S100 Después de la centrifugación nuevamente a 100.000 veces G, congele el sobrenadante citosólico S100 en hielo seco y congele el tubo a menos 80 grados Celsius. Para comenzar la trifluoroacetilación, descongele el S100 a temperatura ambiente. Luego, en un matraz Erlenmeyer, diluya 20 miligramos de ratón S100 a 10 mililitros con agua desionizada.Con el medidor de pH, ajuste el pH a 10 con 1-hidróxido de potasio normal. En una campana extractora, agregue 4,7 milimoles de S-ETFA a la solución. Mantenga el pH entre 9,9 y 10,0 administrando hidróxido de potasio 1-normal en forma de gotas durante aproximadamente una hora.Registre el volumen total de hidróxido de potasio para cada reacción. Transfiera las soluciones a casetes de diálisis separados. Coloque los casetes en cuatro litros de agua desionizada para dializar durante 72 horas con tres cambios por día.Después de la diálisis, registre el volumen final de trifluoroacetilado S100 y luego alícuota en tubos marcados. Congele los tubos en hielo seco y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Con la concentración de proteína determinada de acuerdo con el manuscrito, si es superior a un miligramo por mililitro, agregue un miligramo de cada proteína nativa y alterada con TFA a un mililitro de agua desionizada en tubos de bala separados.Prepare una bala en blanco en el tubo de bala con un mililitro de agua desionizada. En una placa de 96 pocillos, agregue 50 microlitros de las proteínas en blanco, nativas y alteradas cada una, por duplicado. Luego, agregue 50 microlitros de solución de bicarbonato de sodio al 4% seguidos de 50 microlitros de ácido sulfónico al 0.1%2, 4, 6-trinitrobenceno a cada pocillo.Incubar la placa a 40 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de SDS al 10% a cada pocillo, seguidos de 25 microlitros de ácido clorhídrico 1-normal. Después de la inmunización y anestesia del ratón, use tijeras microquirúrgicas para exponer la cavidad intraabdominal.Identifica el bazo. Corte el bazo en el pedículo y colóquelo en una placa de Petri con PBS que contenga un 2% de suero de ternera fetal. Para liberar las células, coloque el bazo entre dos portaobjetos de vidrio esmerilado y frótelos.Utilice una pipeta electrónica para transferir las células a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros. Para lavar, agregue PBS que contenga 2%FCS al tubo para alcanzar el volumen de 50 mililitros y centrifugue a 335 veces G usando una centrífuga refrigerada de sobremesa. Vierta el sobrenadante y repita el paso de lavado.Agregue un mililitro de tampón de lisado ACK en el tubo para lavar durante un minuto para eliminar los glóbulos rojos. A continuación, repita el paso de lavado con PBS suplementado con FCS. Después de marcar las células con CFSE durante 30 minutos, agregue 10 microgramos por mililitro de citocromo-P450 2E1, JHDN5 u ovoalbúmina trifluoroacetilada para estimular las células marcadas durante 72 horas a 37 grados Celsius en la incubadora.Después de la incubación, tiñir las células con CD4 marcado con aloficocianina en una proporción de 1:100 durante 30 minutos en hielo. Después de la laparotomía del ratón inmunizado como se describe en el manuscrito, se canuló la vena porta con una aguja de calibre 25 y luego se cortó la vena cava inferior por debajo de las venas renales. En un baño de agua a 37 grados centígrados, perfunja cada hígado con 40 mililitros de PBS a un caudal de 10 mililitros por minuto.Después de la perfusión, con tijeras microquirúrgicas, corte el hígado en el pedículo hepático, extirpe la vesícula biliar y luego corte el hígado en el hilio. En un tamiz de acero inoxidable de malla 300, use un mortero de jeringa estéril de 20 mililitros y PBS frío para alterar el hígado. Con la criba, filtre la suspensión celular resultante en tubos de centrífuga preesterilizados de 50 mililitros.Lleve cada suspensión a 50 mililitros usando PBS frío y luego lave la suspensión por centrifugación durante 10 minutos a 370 veces G Deseche el sobrenadante y luego combine los gránulos por tratamiento en nuevos tubos de 50 mililitros. Suspender los pellets combinados en 45 mililitros de Percoll al 35% en PBS y 100 unidades internacionales por mililitro de heparina. Luego, gire cada tubo a 500 veces G durante 10 minutos a 20 grados centígrados.Deseche el sobrenadante y suspenda el pellet en cinco mililitros de PBS y luego agregue un mililitro de tampón de lisado ACK a cada pellet y almacene en hielo durante 10 minutos. Después de lavar nuevamente con PBS por centrifugación a 370 veces G, deseche el sobrenadante y luego lave las células con PBS suplementado con FCS por centrifugación durante 10 minutos a 370 veces G. Utilice un hemocitómetro electrónico para contar las células. En este experimento, las respuestas inmunitarias de las células CD4+T se determinaron mediante citometría de flujo.Los datos representativos de proliferación se obtuvieron el día 14 utilizando CFSE en respuesta al metabolito del trifluoroacetilo, el citocromo-P450 2E1, el epítopo del citocromo-P450 2E1, JHDN5. Se utilizaron pocillos sin antígeno como controles. En comparación con el control, los ratones BALB/c desarrollaron proliferación en respuesta a la ovoalbúmina trifluoroacetilada y al citocromo-P450 2E1, pero no a JHDN5.Tres semanas después de la emulsión de TFA en la inmunización adyuvante completa de Freund, los ratones hembra BALB/c desarrollaron más hepatitis autoinmune inducida por fármacos en comparación con los ratones BALB/c machos. El análisis histológico de los tejidos hepáticos también muestra una inflamación más grave de la hepatitis en los ratones hembra que en los ratones macho. El número de células hepáticas CD4+CD8+NK+ y NKT+ fue significativamente mayor en las mujeres que en los hombres.si bien no se observaron diferencias en las células B entre estos ratones Recuerde que, aunque es un día largo, esta formulación durará mucho tiempo. Este procedimiento también se puede realizar para trifluoroacetilar el epítopo. Este procedimiento permitió a los investigadores diseccionar el curso temporal del desarrollo de la enfermedad hepática y aumentar el potencial de nuevos descubrimientos de proteínas y vías.El acetato de S-etiltrifluorotioacetato es tóxico y debe manipularse en una campana extractora. Además, se recomiendan encarecidamente las buenas prácticas y técnicas de laboratorio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

La infección de ratones con un adenovirus que expresan el autoantígeno humano importante del citocromo P450 2D6 (hCYP2D6) reconocidos por los sueros de los pacientes con tipo 2, los resultados de hepatitis autoinmune en una forma persistente de la enfermedad hepática autoinmune mediada por la hepatitis se caracteriza por una amplia fibrosis, y la generación de un CYP2D6 la respuesta inmune específica.

El CYP2D6 Animal Modelo: cómo inducir a la hepatitis autoinmune en ratones

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación colónica en ratones mediante la transferencia adoptiva de células Taltas CD4 + CD45RB singénicas a receptores deficientes de células T y B. Las características clínicas e histopatológicas imitan las enfermedades inflamatorias intestinales humanas. Este método permite estudiar el inicio de la inflamación colónica y la progresión de la enfermedad.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Este manuscrito describe los métodos para la inducción y puntuación del modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE), junto con la evaluación de la distribución de células inmunitarias y los niveles de citocinas de ARNm en ganglios linfáticos, bazo, sangre y médula espinal mediante citometría de flujo y PCR cuantitativa, respectivamente, en varias fases de la enfermedad.

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Aquí, se muestra un enfoque enzimático para aislar hepatocitos primarios de ratones adultos, y se describe la cuantificación de una respuesta inflamatoria mediante ELISA y PCR en tiempo real.

La inducción de una respuesta inflamatoria en la Primaria hepatocitos culturas de ratones

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

La encefalomielitis autoinmune experimental es uno de los modelos murinos de esclerosis múltiple más utilizados. En el protocolo actual, los ratones C57BL/6J de ambos sexos son inmunizados con el péptido glicoproteico de los oligodendrocitos de mielina, lo que resulta principalmente en paresia ascendente de la cola y las extremidades. Aquí discutimos el protocolo de inducción y evaluación de EAE.

Modelización de la esclerosis múltiple en los dos sexos: encefalomielitis autoinmune experimental inducida por MOG35-55

Aprende a inducir hepatitis autoinmune por fármacos en ratones BALB/c para estudiar mecanismos patógenos y diferencias sexuales. Este modelo reproducible permite analizar respuestas inmunes y progresión de la enfermedad hepática.

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

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