Name: Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprende a realizar ensayos mejorados de levadura un híbrido para identificar factores de transcripción que se unen a secuencias de ADN humano. Este método permite evaluar más de 1.000 factores de transcripción en un solo experimento.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R35-GM128625 a J.I.F.B.].

1. preparaciones
<ol><li>
Placas SC −U −H (platos de Petri de 150 mm) Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo de las cepas de levadura DNA-cebo.<ol>
<li>Disolver la mezcla de abandono, levadura nitrógeno base (YNB), hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con 5 M NaOH (aproximadamente 1 mL por litro de media; ver tabla 2 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.</li>
		<li>En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).</li>
		<li>Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.</li>
		<li>Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C en un baño de agua.</li>
		<li>Añadir la leucina y el triptófano a los medios de comunicación. Mezclar bien en un plato de agitar y verter en los platos de Petri estériles de 150 mm (~ 80 mL por plato). Seco de 3 a 5 días a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Placas rectangulares de YAPD Nota: Estas placas se utilizarán para el cultivo del césped para la cepa de ADN-cebo y para acoplarse con la colección de la matriz TF.<ol>
<li>Disolver los polvos (ver tabla 3 para la composición), excepto el agar, en 950 mL de agua en un matraz de 2 L y añadir una barra de agitación.</li>
		<li>En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).</li>
		<li>Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.</li>
		<li>Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco.</li>
		<li>Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C. Vierta los medios de comunicación en las placas rectangulares (ver Tabla de materiales; ~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 6 meses. Nota: Aunque el volumen de los medios sugeridos es 70 mL por placa, puede utilizarse 50 – 80 mL por placa. Los tres temas críticos a considerar cuando las placas de colada son 1) que son nivelados para que los medios de agar tienen el mismo espesor en toda la placa (uso una mesa nivelada o superficie para verter la placa y no vierta en pilas de más de siete placas) 2) para asegurar la ausencia de burbujas en el agar media (burbujas deben hacer estallar usando una aguja estéril) y 3) las placas de sequía durante sólo un día y envolviendo las placas en bolsas de plástico para evitar fallos en la fijación de levadura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
−Trp SC y Sc −U −Trp placas rectangulares Nota: Estas placas se utilizará para el crecimiento de la colección de la matriz TF (Sc −Trp) y seleccionar levadura diploide después de aparearse (Sc −U −Trp).<ol>
<li>Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 920 mL de agua y pH de 5.9 con NaOH 5M (aproximadamente 1 mL por litro de media) (ver tabla 4 para la composición). Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.</li>
		<li>En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 950 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).</li>
		<li>Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.</li>
		<li>Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa, mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.</li>
		<li>Añadir la leucina, histidina y uracilo (omitir el uracilo para las placas de −Trp Sc −U).</li>
		<li>Mezclar bien en un plato de agitar y verter en placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y tubo de 6 mm. Secar por 1 día a temperatura ambiente, envuelva las placas en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío por hasta 3 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp 3Por + placas rectangulares X-gal Nota: estas placas se utilizará como placas de lectura para los ensayos de eY1H.<ol>
<li>Disolver la mezcla de abandono YNB, hemisulfate adenina y sulfato de amonio en 850 mL de agua (véase la tabla 5 para la composición). No no pH. Vierte en un matraz de 2 L y añada una barra de agitación.</li>
		<li>En un segundo matraz de 2 L, añadir el agar a 850 mL de agua (no agregar una barra de agitación ya que producirá el agar a hervir en el autoclave).</li>
		<li>Autoclave durante 40 min a 15 psi en un ciclo líquido.</li>
		<li>Preparar 10 x sales BU (1L) mediante la combinación de 900 mL de agua, 70 g de Na2HPO4∙7H2O y 34,5 g de NaH2PO4∙H2O. mezcla utilizando una barra de agitación para disolver polvos y ajustar el pH a 7.0 con NaOH M 5. Añadir agua para llevar a 1 L y autoclave.</li>
		<li>Preparar la solución de X-gal agregando 3,5 g de polvo de X-gal a un tubo de plástico de 50 mL que contiene 42,5 mL de formamida dimethyl. Añadir polvo de X-gal a dimetil formamida para disolver más fácilmente (esto tarda 30 min). Mantener la solución en la oscuridad (uso opaco 50 ml tubo o cubierta en papel de aluminio). Almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Inmediatamente Vierta el contenido del primer matraz, incluyendo la barra de agitación, en el agar que contiene el frasco. Agregar la glucosa y el 10 x BU sales (véase la tabla 5 para la composición), mezclar bien en un plato de agitar y enfríe a 55 ° C.</li>
		<li>Añadir la leucina, 3AT y X-gal (véase la tabla 5 para la composición).</li>
		<li>Mezclar bien en un plato de agitar y verter en las placas rectangulares (~ 70 mL por placa) mediante una bomba peristáltica (5 mL/seg) y un tubo de 6 mm. Seco de 1 día a temperatura ambiente, envolver en bolsas de plástico y almacenar en el cuarto frío cubierto de papel de aluminio (3Por y X-gal son sensibles a la luz) durante 1 mes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. observación de una variedad TF
<ol><li>
Descongelar la matriz TF-presa
	<ol>
<li>Descongelar la chapa levadura glicerol con la gama TF-presa sobre el hielo. Nota: TF-presa matrices pueden generarse previamente publicados10,12,13,18.</li>
		<li>Suspender la levadura con una pipeta 12 canales dentro de 1 a 3 minutos antes del siguiente paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Manchar la levadura en −Trp Sc placas rectangulares
	<ol>
<li>En el robot de HDA (véase Tabla de materiales), seleccione múltiples bien 96 placas como fuente, 96 placas de agar como blanco y cojines pin largo 96. Nota: PIN pads no son reutilizables y deben ser desechados.</li>
		<li>Seleccione el programa Replicar muchas para hacer dos copias por placa de 96 pocillos. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la posterior contaminación de las reservas congeladas.</li>
		<li>Seleccione la opción de remolino hacia arriba y hacia abajo en la fuente para mezclar la levadura.</li>
		<li>La bolsa la matriz manchada e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generación de matrices de Colonia 384 en placas rectangulares de Sc −Trp
	<ol>
<li>En el robot, seleccione 96 placas de agar como fuente, placa de agar 384 como destino y 96 pastillas pasador corto.</li>
		<li>Seleccione el programa de la matriz 1:4 . De esta manera, placas cuatro 96 Colonia (cada uno con un TF diferentes) se consolidará en la placa de una 384 Colonia. No utilice el reciclaje o revisar opciones para evitar la contaminación entre diferentes placas.</li>
		<li>La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 384-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 2 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generar matrices de Colonia 1.536 en placas rectangulares de Sc −Trp Nota: Esto resultará en arreglos de discos que contiene cuatro colonias para cada presa de TF.<ol>
<li>En el robot, seleccione 384 placas de agar como fuente, las placas de 1.536 agar como blanco y cojines pasador corto 384.</li>
		<li>Seleccione el programa de fuente de análisis de 1:4. El objetivo es copiar cada colonia en cuatro colonias para obtener quadruplicates. Utilizar el reciclaje y revisar opciones de como se trata de copiar cuatro veces cada colonia.</li>
		<li>La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificando la matriz 1.536 Colonia en placas rectangulares de Sc −Trp
	<ol>
<li>En el robot, seleccione 1.536 placas de agar como fuente, 1.536 placas de agar como destino y 1.536 cojines pasador corto.</li>
		<li>Seleccione el programa Replicar muchas replicar copias de 3 – 4. Utilizar el reciclaje y revisar opción pero lanzar la almohadilla cuando se cambia a un plato diferente de la matriz para evitar la contaminación cruzada.</li>
		<li>La bolsa de las placas e incubar el agar manchado matriz 1536-Colonia-hacia arriba a 30 ° C durante 3 días para apareamiento pasos (véase abajo). Después de eso, mantener las placas a temperatura ambiente y copia otra vez después de 7 días para una nueva ronda de cribado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H pantalla
<ol><li>
Preparación de céspedes de cepa de ADN-cebo para el apareamiento
	<ol>
<li>Spot la levadura cepas de ADN-cebo en una placa de Sc −U −H y crecer durante 3 días a 30 ° C.</li>
		<li>Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato adapta a diferentes cepas de 12 – 16. Incubar un día a 30 ° C.</li>
		<li>Raya la levadura en una 15 cm Sc −U −H la placa con un palillo de dientes estéril, para que cada plato ajusta a 4 diferentes cepas. Incubar durante un día a 30 ° C.</li>
		<li>Raspar la levadura usando un palillo de dientes estéril, asegurándose de no raspar cualquier agar y añadir en un tubo de 1,5 con 500 μl de agua estéril.</li>
		<li>Agregar perlas de vidrio estériles de 10 – 15 en una placa rectangular de YAPD. Añadir la suspensión de levadura sobre la placa y agitar bien en todas las direcciones durante 1 min para que la levadura se propaga a través de la placa.</li>
		<li>Invertir la placa inmediatamente y aprovechar para que los granos van a la tapa. Eliminar y reciclar los granos.</li>
		<li>Bolsa de las placas e incubar agar hacia abajo durante 1 – 2 días a 30 ° C. Luego proceder a la etapa de apareamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Apareamiento de levadura DNA-bait y cepas de variedad TF
	<ol>
<li>Transferencia de la matriz TF a una placa rectangular de YAPD con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Cada placa de matriz TF puede utilizarse para transferir a las placas YAPD de 3 a 4 (dependiendo del número de placas en la matriz). Las placas de matriz TF utilizadas para el apareamiento deben ser 2 o 3 días pero no más como apareamiento pueden ser ineficiente.</li>
		<li>Transferir el césped de una cepa de ADN-cebo a las placas YAPD ya que contiene la matriz TF con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa Replicar muchas . Utilizar un desplazamiento aleatorio en la fuente con un radio de ~0.6 m para evitar tomar levadura desde el mismo lugar y mezclar en el objetivo de facilitar el contacto entre las cepas de levadura. Utilizar el césped que contienen las cepas de ADN-cebo (sección 3.1) como fuente y las placas YAPD que contiene la matriz TF en paso 3.2.1 como destino.</li>
		<li>La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C por 1 día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de la levadura diploide
	<ol>
<li>Transferir la levadura acoplada de las placas YAPD placas de −Trp Sc −U con el robot. Seleccione la placa de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar . Mezclar en origen y en destino.</li>
		<li>La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C durante 2-3 días (incubación más largo conduce a actividad de reportero de fondo alta).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferencia a las placas de la lectura
	<ol>
<li>Transferir la levadura diploide de las placas de −Trp Sc −U lectura placas rectangulares Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal con el robot. Seleccione las placas de 1.536 agar como fuente y destino y la almohadilla de 1.536 pasador corto. Seleccione el programa de replicar .</li>
		<li>La bolsa de las placas e Incube agar hacia arriba a 30 ° C hasta por 7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proyección de imagen de las placas de la lectura
	<ol>
<li>ADN-cebo de cepas con actividad de reportero de fondo alta, tomar fotos en los días 2, 3 y 4. De lo contrario, tomar fotos a los 4 y 7 días. Interacciones positivas se identifican por el color azul y el crecimiento de las colonias de levaduras y se pueden determinar manualmente, o puede ser determinado mediante software de análisis de imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Robótica eY1H acoplamiento proyección lo descrito aquí enormemente aumenta el rendimiento para identificar el conjunto de TFs que se unen a una región de ADN de interés, en comparación con la anterior proyección de biblioteca o proyección vestida enfoques basados en transformación. Además, las interacciones de la TF-DNA detectadas por eY1H ensayos son altamente reproducibles como el 90% de las interacciones detectadas positivas para todas las cuatro colonias probados por TF, y 90% de las interacciones vuelva a probar en ...

Un problema central en el campo biomédico es determinar los mecanismos por el que se regula cada gene humano. La transcripción es el primer paso en el control de los niveles de expresión de genes, y es regulado por sistemas de factores de transcripción (TFs) que son únicos a cada gen. Dado que los seres humanos codifican para > 1.500 TFs1,2, identificar el conjunto completo de TFs que controlan la expresión de cada gen sigue siendo un desafío abierto.
Dos tipos de métodos se pueden utilizar para mapear las interacciones TF-DNA: métodos TF-centrado y centrado en la DNA3 (figura 1A). En métodos centrados en el TF, TF de interés es sondeado para atar regiones genómicas de ADN y determinar su especificidad de unión del ADN. Estos métodos incluyen la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguida por secuenciación de alto rendimiento, microarrays de la proteína vinculante y SELEX4,5,6. En los métodos centrados en el ADN, una secuencia de ADN de interés es sondada para determinar el conjunto de TFs que se unen a la secuencia de ADN. El más ampliamente aplicado de tales métodos es los ensayos (Y1H) levadura uno híbrido, en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de la levadura utilizando reporter genes7,8,9.
Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo, promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser evaluado para reportero gene activación9,10 (figura 1B). El cebo de ADN se clona río arriba del reportero dos genes (LacZ y HIS3) y ambos constructos de ADN-bait::reporter se integración en el genoma de la levadura para generar chromatinized 'cepas de ADN-bait'. TF-presa, codificada en un plásmido que expresa un TF fusionados con el dominio de activación (AD) de la levadura Gal4 TF, se introduce en la cepa de ADN-cebo para pescar las interacciones TF-DNA. Si la TF-presa se une a la secuencia de ADN-bait, el anuncio en la TF-presa dará lugar a la activación de ambos genes del reportero. Como resultado, las células con una interacción positiva pueden seleccionadas para el crecimiento en las placas que carecen de histidina, así como la superación de un inhibidor competitivo, de 3-Amino-1,2,4-triazol (3-AT) y visualizadas como colonias azules en presencia de X-gal. Porque el potente Gal4 de la levadura se utiliza AD, Y1H ensayos pueden detectar interacciones con activadores transcripcionales como represores. Además, dado que TF-presas se expresan de un promotor fuerte levadura (ADH1), las interacciones pueden ser detectadas incluso para TFs que tienen niveles de baja expresión endógena, que son difíciles de detectar por ChIP11,12.
Más publicados protocolos para la realización de ensayos de Y1H se basan en introducir TF-presas en el cebo de ADN de levaduras transformando agrupadas bibliotecas TF-presa seguidas por la selección, Colonia selección y secuenciación para identificar la interacción TF, o por transformación de los clones de8,9. Estos son protocolos de tiempo, limitando el número de secuencias de ADN que puede ser probado por el investigador. Una reciente mejora de Y1H ensayos, llamado enhanced Y1H (eY1H), ha aumentado espectacularmente el rendimiento del cribado mediante el uso de una plataforma robótica de alta densidad matriz (HDA) para cepas de levadura DNA-cebo con una colección de cepas de levadura cada uno expresando diferentes TF-presa10,13 (figura 1). Estas pantallas emplean un formato 1.536 Colonia que permite probar TFs más humanas por cuadruplicado, usando solamente tres platos. Además, dado que las interacciones de la TF-ADN se prueban en forma pares, este enfoque permite comparar las interacciones entre DNA-cebos (como dos variantes de los nucleótidos) y entre diferentes TFs o TF variantes11,12 ,14.
Usando análisis de eY1H, hemos delineado el humano más grande y elegans de Caenorhabditis TF centrada en el ADN-ADN interacciones redes hasta la fecha. En particular, hemos identificado 2.230 interacciones entre 246 potenciadores del desarrollo humanos y de TFs 28312. Además, hemos empleado eY1H ensayos para descubrir la alteración Unión TF 109 variantes de cubierta un solo nucleótido asociados con enfermedades genéticas tales como malformación del desarrollo, cáncer y trastornos neurológicos. Más recientemente, utilizamos eY1H para delinear una red compuesta por 21.714 interacciones entre 2.576 promotores de genes de C. elegans y 366 TFs11. Esta red fue clave para descubrir el papel funcional de docenas de TFs de C. elegans .
Los protocolos para generar manchas de ADN-bait y evaluar los niveles de actividad de reportero de fondo han sido divulgado a otra parte15,16,17. Aquí, describimos un gasoducto eY1H que puede utilizarse para cualquier región de ADN genómico humano contra una amplia gama de 1.086 TFs humanas. Una vez que se genera una levadura cepa de ADN-cebo y una matriz de TF-presa es descubierta en las placas correspondientes, el conjunto del Protocolo puede realizarse en dos semanas (cuadro 1). Lo más importante, el protocolo puede ser paralela para que un investigador solo puede pantalla 60 secuencias de ADN-cebo. Para demostrar el protocolo, defendimos a los promotores de los dos genes de citoquinas CCL15 y IL17F. Además, mostramos resultados de fallido pantallas para ilustrar los tipos de problemas que pueden surgir al realizar ensayos de eY1H y cómo solucionarlos problemas.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~95 % TLC Sigma</td><td></td><td>A8056-100G</td><td>Inhibidor competitivo para productos del gen HIS3</td></tr><tr><td>Sulfato de adenina (hemisulfateo), dihidrato</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Necesario para el crecimiento adecuado</td>de</tr><tr><td>la levadura Agar Alta fuerza de gel - Grado bacteriológico</td><td>American International Chemical</td><td>AGHGUP</td><td>Medios nutritivos para el crecimiento de levaduras</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Fuente de nitrógeno en medios de levadura sintética</td></tr><tr><td>D+ Glucosa anhidra</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Necesario para el crecimiento</td></tr> de la levadura <tr><td>Drop-Out Mix menos His, Leu, Tryp y Uracil, rico en adenina sin base de nitrógeno</td> de levadura <td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Medios sintéticos completos necesarios para el borde de crecimiento de la levadura</td></tr><tr><td>Medidor de pH multiparamétrico</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Para medir el pH de medios selectivos</td></tr><tr><td>Palillos de dientes planos 750 ct</td><td>Diamante</td><td></td><td>Para rayar levaduras en placas de Petri</td></tr><tr><td>Cuentas de vidrio</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Para esparcir levadura al hacer césped</td></tr><tr><td>Glicerol &ge; 99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Necesario para hacer caldos de levadura congelados</td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos</td></tr><tr><td>L-Triptófano</td><td></td><td>Sigma T-0254</td><td>Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos</td></tr><tr><td>N, N-dimetilformamida</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Para hacer la solución X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Para dispensar volúmenes precisos de medios en placas Singer</td></tr><tr><td>Peptona, Bacteriológica</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Fuente de proteína necesaria para el crecimiento de la levadura</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Para el cultivo de cebos de levadura para cribado</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Para hacer placas rectangulares de agar para usar con Singer Robot</td></tr><tr><td>Precision Incubadora refrigerada de DBO de baja temperatura</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Para incubar placas de levadura a temperatura constante</td></tr><tr><td>RePads 1.536 cortos</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Para transferir la matriz TF-presa, aparear la levadura y transferir la levadura a las placas de selección y lectura de diploides</td></tr><tr><td>RePads 384 corto</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Para transferir el array TF-prey de 384 a 1.536 en formato de colonia</td></tr><tr><td>RePads 96 largo</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>Para transferir el array TF-prey del caldo de glicerol a la placa de agar</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Para transferir la matriz TF-prey de 96 a 384 colonias en formato</td></tr><tr><td>Singer HDA Robot RoToR</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Para transferir levadura de alto rendimiento</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (pellets/ACS certificado)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Para ajustar el pH de medios selectivos</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Requerido para la actividad reportera de LacZ en X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico monohidratado</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Requerido para la actividad del reportero LacZ en X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Para la selección del crecimiento de la levadura en medios selectivos</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-Dgalactopiranósido)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galactosidasa se vuelve incolora X-gal azul para detectar la interacción proteína-ADN</td></tr><tr><td>Extracto de levadura US</td><td>Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Medio nutritivo para el crecimiento y la propagación de la levadura</td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura (polvo) sin AA, carbohidratos y sin AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Necesario para un crecimiento vigoroso de la levadura</td></tr></tbody></table>

pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el factor de transcripción atar a las secuencias de adn humano

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identificar los conjuntos de factores de transcripción (TFs) que regulan cada gen humano es una tarea de enormes proporciones que requiere la integración de numerosos enfoques experimentales y computacionales. Un tal método es el ensayo levadura uno híbrido (Y1H), en que las interacciones entre el TFs y ADN regiones se prueban en el entorno del núcleo de levadura usando genes del reportero. Y1H ensayos implican dos componentes: un 'ADN-bait' (por ejemplo., promotores, potenciadores, silenciadores, etc.) y un 'TF-presa,' que puede ser examinado para la activación del gen reportero. Más publicados protocolos para realizar Y1H pantallas se basan en transformar cepas de levadura DNA-cebo TF-presa bibliotecas o arreglos de discos. Aquí, describimos un gasoducto, llamado Y1H mejorada (eY1H) de ensayos, donde las interacciones TF-DNA son interrogadas por el apareamiento de las cepas de ADN-cebo con una colección vestida de TF-presa cepas utilizando una matriz de alta densidad plataforma robótica (HDA) que permite la proyección en un 1.536 formato de la Colonia. Esto permite un aumento dramático en el rendimiento (60 secuencias de ADN-cebo contra > 1.000 TFs tarda dos semanas por el investigador) y reproducibilidad. Ilustran los diferentes tipos de resultados esperados analizando secuencias del promotor humano contra una gran variedad de 1.086 TFs humanas, así como ejemplos de problemas que pueden surgir durante la pantallas y cómo solucionarlos problemas.

Tres factores deben considerarse al analizar resultados de pruebas de eY1H: la actividad de reportero de fondo de la cepa de ADN-bait, la fuerza de la actividad de periodista correspondiente a las interacciones TF-DNA y el número de colonias positivas. La actividad del reportero de fondo (es decir, autoactivity) de la cepa de ADN-cebo se refiere al crecimiento y al color de las colonias de levaduras en la placa de la lectura, incluso en la ausencia de un TF-presa general. Lo ideal sería no autoactive cepas muestran un fo...

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de > 1.000 TFs en un solo experimento.

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

El objetivo de los ensayos de un híbrido de levadura mejorada es identificar el conjunto de factores de transcripción que se unen a una secuencia de ADN de interés. La ventaja de esta técnica es que los ensayos de un solo híbrido de levadura mejorada pueden evaluar más de 1000 factores de transcripción en un solo experimento. Por el contrario, la inmunoprecipitación de cromatina evalúa solo un factor de transcripción a la vez.Este método constituye una herramienta clave para la genómica funcional para identificar el repertorio de factores de transcripción que se unen a los promotores y potenciadores de genes e identificar factores de transcripción alterados que se unen a variantes no codificantes. Demostrando el procedimiento será el Dr.Xing Liu un postdoctorado de mi laboratorio. Descongelar las placas de glicerol de levadura con la matriz de presas TF sobre hielo.Resuspender la levadura con una pipeta de 12 canales y proceder al siguiente paso dentro de 1 a 3 minutos. Para detectar la levadura en sc menos placas rectangulares de triptófano, utilice un robot de matriz de alta densidad para seleccionar múltiples 96 placas como la fuente, 96 placas de agar como el objetivo, y 96 almohadillas de pasador largo. Las almohadillas de pasador no son reutilizables y deben desecharse.Seleccione el programa Spot Many para hacer dos copias por cada placa de 96 pozos. No utilice las opciones de reciclaje o revisión para evitar la contaminación posterior de las poblaciones congeladas. Además, seleccione la opción de girar hacia arriba y hacia abajo en la fuente para mezclar la levadura.Siga las instrucciones para dónde y cuándo colocar las placas y permita que el robot detecte la levadura en placas rectangulares Sc menos triptófano. Embolse la matriz manchada e incuba su lado del agar a 30 grados Centígrados durante 2 a 3 días. Para generar 384 matrices de colonias en Sc menos placas rectangulares de triptófano, seleccione 96 placas de agar como fuente, 384 placas de agar como objetivo y 96 almohadillas de pasador cortas.A continuación, seleccione el programa de origen único de la matriz 1:4. De esta manera, cuatro placas de colonia 96 se consolidarán en una placa de colonia 384. No utilice las opciones de reciclaje o revisión para evitar la contaminación entre diferentes placas.Embolsa las placas e incuba el agar de matriz de 384 colonias manchado a 30 grados Celsius durante 2 días. Para generar 1536 matrices de colonias en Sc menos placas rectangulares de triptófano, seleccione 384 placas de agar como fuente, las 1536 placas de agar como el objetivo, y 384 almohadillas de pasador cortas. A continuación, seleccione el programa de código fuente único del ensayo 1:4.El objetivo es copiar cada colonia en cuatro colonias para obtener cuadrúplicas. Utilice las opciones de reciclaje y revisión, ya que esto implica copiar cada colonia 4 veces. Siga las instrucciones del robot y permita que el robot detecte la levadura en las placas antes de embolsarse e incubar el lado del agar de la matriz de colonias 1536 manchado hacia arriba a 30 grados Celsius durante 3 días.Para amplificar la matriz de colonias 1536 en placas rectangulares Sc menos triptófano, seleccione 1536 placas de agar como fuente, 1536 placas de agar como objetivo y 1536 almohadillas cortas de pasador. Seleccione el programa Replicar muchos para replicar de 3 a 4 copias. Utilice la opción de reciclaje y revisión, pero tire la almohadilla cuando cambie a una placa diferente de la matriz para evitar la contaminación cruzada.Permita que el robot amplificar la matriz de colonias 1536 en Sc menos placas rectangulares de triptófano. Finalmente, embolse las placas e incuba el agar de matriz de colonias manchado de lado a 30 grados Celsius durante 3 días para usar para los pasos de apareamiento. Para preparar el césped de cepa de cebo de ADN para el apareamiento, detectar las cepas de cebo de levadura de ADN en un Sc menos uraci y placa de histidina y crecer durante 3 días a 30 grados Celsius.Rayar la levadura en un 15 centímetros Sc menos uraci y placa de histidina utilizando un palillo de dientes estéril para que cada plato se ajuste a 12 a 16 cepas diferentes. Incubar la placa un día a 30 grados centígrados. Al día siguiente, raya la levadura en un Sc menos 15 centímetros y una placa de histidina usando un palillo de dientes estéril para que cada plato se adapte a 4 cepas diferentes.Incubar la placa durante un día a 30 grados centígrados. Después de la incubación, raspar la levadura usando un palillo de dientes estéril, asegurándose de no raspar ningún agar. Añadir la levadura en un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de agua estéril.Ahora agregue de 10 a 15 perlas de vidrio estériles y la suspensión de levadura en una placa rectangular YAPD. Agitar bien en todas las direcciones durante un minuto para asegurar que la levadura se extiende por todo el plato. Invierta la placa inmediatamente y toque para que las perlas vayan a la tapa.Retire y recicle las cuentas. Embolse los platos e incuba el lado del agar durante 1 a 2 días a 30 grados centígrados. A continuación, continúe con el paso de acoplamiento.Para acoplar el cebo de ADN de levadura y las cepas de matriz TF, transfiera la matriz TF a una placa rectangular YAPD con el robot. Seleccione la placa de agar 1536 como la fuente y el objetivo, y la almohadilla de pasador corto 1536. Seleccione el programa Replicar muchos.Seleccione 4 placas de origen y las opciones de reciclaje y revisión. Cada placa de matriz TF se puede utilizar para transferir de 3 a 4 placas YAPD. Las placas de matriz TF utilizadas para el acoplamiento deben tener de 2 a 3 días, pero no más, ya que el acoplamiento puede ser ineficiente.Para transferir el césped de una cepa de cebo de ADN a las placas YAPD que ya contienen la matriz TF, seleccione la placa de agar 1536 como la fuente y el objetivo y la almohadilla de pin corto 1536. Seleccione el programa Replicar muchos. Utilice un desplazamiento aleatorio en la fuente con un radio de aproximadamente 0,6 milímetros para evitar tomar levadura del mismo lugar y seleccione Mezclar en blanco para facilitar el contacto entre las cepas de levadura.Utilice el césped que contiene las cepas de cebo de ADN como fuente, y las placas YAPD que contienen la matriz TF manchada como el objetivo antes de embolsar las placas e incubarlas lado del agar a 30 grados Celsius durante un día. Para seleccionar la levadura diploide, seleccione la placa de agar 1536 como fuente y el objetivo, y seleccione la almohadilla de pasador corto 1536. Seleccione el programa Replicar.Seleccione Mezclar en origen y en destino. Permita que el robot transfiera la levadura apareada de las placas YAPD a las placas Sc menos uraci y triptófano antes de embolsar las placas e incubarlas de lado del agar a 30 grados celsius durante 2 a 3 días. Ahora, seleccione las placas de agar 1536 como la fuente y el objetivo y la almohadilla de pasador corto 1536.Seleccione el programa Replicar. Transfiera la levadura diploide de las placas Sc menos uracilo y triptófano a las placas rectangulares de lectura 3-AT y X-gal utilizando el robot. Embolsa los platos e incuba los agar a 30 grados centígrados durante un máximo de 7 días.Para cepas de cebo de ADN con actividad de reportero de alto fondo, tome fotografías en los días 2, 3 y 4. De lo contrario, tome fotos en los días 4 y 7. Mantenga las placas de la matriz TF a temperatura ambiente y vuelva a copiarlas después de 7 días para una nueva ronda de cribado.Para ilustrar el tipo de resultados que se pueden obtener utilizando ensayos de un solo híbrido de levadura mejorada, las regiones promotoras de los genes CCL15 e IL17F se analizaron contra una serie de 1086 TF humanos. El promotor CCL15 es un ejemplo de un cebo de ADN no automático, donde las interacciones, incluso las débiles, se pueden detectar fácilmente. El promotor IL17F es un ejemplo de un cebo de ADN autoactivo con actividad desigual de reportero de fondo donde se pueden detectar algunas interacciones, mientras que para varios TF, no se sabe si la actividad del reportero es mayor que el fondo.Hay varios problemas que pueden ocurrir al realizar ensayos mejorados de levadura de un solo híbrido. En este caso, las colonias son demasiado pequeñas y no se pueden transferir. Típicamente, aproximadamente el 95% de las colonias de presas TF muestran un crecimiento normal.En este ejemplo, no hay crecimiento de levadura en una porción del plato. Este problema está generalmente relacionado con un fallo en el paso de acoplamiento si la almohadilla de 1536 pines no logra hacer contacto con la levadura en el césped de deformación unión de cebo de ADN, en la matriz TF o en la placa de acoplamiento. En estos dos ejemplos, no se detecta ninguna interacción.Este problema a menudo está relacionado con mutaciones inactivadoras involuntarias en los genes del reportero, en particular LacZ, o con una autoactividad demasiado alta que enmascara las interacciones. En este caso, la placa presenta manchas azules aleatorias que a menudo están relacionadas con la contaminación bacteriana. Lo más importante a tener en cuenta es la preparación adecuada de la placa.Asegurarse de que todos los componentes se agregan y que la altura del agar es uniforme, ya que todos los pasos posteriores dependen de esto. Aunque la mayoría de los reactivos no son peligrosos, es importante usar guantes en todo momento para evitar la contaminación de las muestras y placas. Al igual que con cualquier ensayo de unión al ADN, es importante validar las interacciones identificadas mediante ensayos funcionales como ensayos de reporteros, derribos del factor de transcripción o nocaut, seguidos de la expresión de medición del gen objetivo.Este método ha permitido la identificación de factores de transcripción que regulan los genes implicados en determinados procesos biológicos, así como factores de transcripción con unión alternativa a variantes asociadas a enfermedades no codificantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aquí se describe una pantalla de la sobreexpresión del plásmido...

La levadura de alto rendimiento de la pantalla sobreexpresión plásmido

Hemos modificado la levadura de dos híbridos convencionales de detección, una herramienta eficaz en la identificación genética interacción de proteínas. Esta modificación notable acorta el proceso, reduce la carga de trabajo, y lo más importante, reduce el número de falsos positivos. Además, este método es reproducible y confiable.

Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

En este video, demostramos el ensayo de un híbrido de levadura modificada, que detecta múltiples proteínas que interactúan con el ADN objetivo. Las células de levadura transformadas contienen la secuencia de ADN diana aguas arriba del gen reportero. Además, expresan proteínas factores de transcripción. Cuando las proteínas forman complejos y se unen al ADN diana, el gen reportero se expresa y puede detectarse enzimáticamente.

Ensayo híbrido de levadura y uno modificado para detectar interacciones heteroméricas entre el complejo de proteínas y el ADN

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la construcción rápida de factores de transcripción artificiales (ATFS) con GFP reporteros afines y cuantificación de la capacidad de los ATF para estimular la expresión de GFP mediante citometría de flujo.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Se presenta una estrategia para generar mutaciones en genes de histonas en su ubicación endógena en Saccharomyces cerevisiae.

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.

Un sistema híbrido modificado de levadura-uno para estudios de interacción de ADN complejo-proteína heterotérica

Procesamiento por lotes de pantallas 2-híbrido de levadura permite la comparación directa de los perfiles de la interacción de múltiples proteínas de cebo con un sistema altamente complejo presa de proteínas de fusión. Aquí, describimos métodos de refinado, nuevos reactivos y cómo implementar su uso para esas pantallas.

Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Secuenciación profunda de las poblaciones de levaduras seleccionadas para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos potencialmente produce una gran cantidad de información sobre la interacción de las proteínas de socio. Aquí, describimos el funcionamiento de herramientas bioinformáticas específico y personalizado software actualizado para analizar los datos de la secuencia de estas pantallas.

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

Aprende a realizar ensayos mejorados de levadura un híbrido para identificar factores de transcripción que se unen a secuencias de ADN humano. Este método permite evaluar más de 1.000 factores de transcripción en un solo experimento.

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

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