Name: Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a desarrollar un modelo ortotópico murino de carcinoma escamoso de cabeza y cuello mediante inoculación intramucosa. Este método permite estudiar el microambiente tumoral y evaluar respuestas al tratamiento.

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Animales todos los procedimientos fueron realizados según un aprobado animales uso y cuidado Comité (IACUC) protocolo institucional de la Universidad de Colorado Denver (protocolo 00250 #).
1. tumor de la célula cultura
Nota: Las líneas celulares B4B8 y LY2 se utilizaron para generar tumores HNSCC ortotópico: B4B8 las células del tumor fueron derivadas de queratinocitos mucosa transforma carcinógeno (de ratones BALB/C)11. Las células del tumor LY2 se derivaron de las metástasis de nodo de linfa de un transformado espontáneamente ratones BALB/C queratinocitos línea (Pam 212)12,13. Ambas líneas celulares fueron amablemente proporcionados por Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
<ol><li>Uso mediana F/12 (DMEM modificado Eagle de Dulbecco) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% reactivo antimicrobiano para el mantenimiento de la línea de celular. Mantener estas líneas de células en una incubadora estéril a 37 ° C y 5% CO2. Células puede usarse para la inoculación antes de más de 15 pasos.</li>
	<li>Placa de 2 x 106 4 x 106 células en frascos de cultivo de células de 175 cm2 . Nota: Las células sean menos del 90% confluente para evitar inducir una respuesta de estrés.</li>
	<li>Cuando las células son 70% confluente (~ 48 h), retire el matraz de la incubadora y lavar las células 3 x con frío solución salina con tampón fosfato (PBS).</li>
	<li>Separar las células del frasco usando tripsina 0.25%, suficiente para cubrir la superficie de la placa.<ol>
<li>Para ello, pipetear 4 mL de tripsina en un matraz de2 175 cm 70% células confluentes. Incubar las células con tripsina para 3-4 min en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Visualizar las células bajo un microscopio para asegurar la separación de la célula.</li>
		<li>Agregar 12 mL de medio DMEM F/12 que contiene FBS para neutralizar la actividad de la tripsina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire la suspensión de células y colóquelo en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Agitar el tubo que contiene las células invirtiendo x-4 3 x.</li>
	<li>Opcionalmente, mezclar una alícuota de 10 μl de suspensión celular con 10 μl de azul tripán en un tubo de microcentrífuga y contar las células usando un hemocitómetro. Determinar viabilidad celular restando el número de células de Trypan-blue-positivos del número total de células y dividir por el número total de células.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspender las células en DMEM libre de suero y antibióticos, en un volumen adecuado para que 1 x 106 células están presentes en 50 μl de los medios de comunicación. Nota: Basado en la agresividad de la línea de células in vivo (determinada empíricamente), 1 x 106 células por sitio de inyección por ratón se consideraba apropiado para las células B4B8 y LY2.</li>
	<li>Coloque el frasco que contiene la suspensión de células en el hielo.</li>
	<li>Coloque la matriz de la membrana del sótano previamente descongelados en hielo. Nota: La matriz de la membrana del sótano fue descongelada durante la noche a 4 ° C.</li>
</ol>2. células de inyección en ratones
<ol><li>Prepare una mezcla 1:1 de la matriz de la membrana de las células: sótano (50 μL).</li>
	<li>Añadir las células primero; Luego, poco a poco pipetear la matriz de la membrana del sótano. Evitar la introducción de burbujas de aire. Asegúrese de que la mezcla se hace inmediatamente antes de la inyección del animal. Adición de células a matriz de la membrana del sótano para un período prolongado de tiempo puede resultar en celular en la mezcla de matriz, lo que dificulta la mezcla agitar rigurosamente. Esto provocará una considerable variabilidad en el tamaño del tumor entre ratones.</li>
	<li>Mezclar suavemente. Asegúrese de que todos los pasos que involucra la matriz se realizan en el hielo. Matriz de la membrana basal se polimerizan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar jeringas para la inoculación.</li>
	<li>Jeringas de insulina 0,5 mL (23 G) de la carga con 100 μl de la solución de matriz de la membrana basal de la célula.</li>
	<li>Mantenga las jeringas en hielo para evitar la polimerización de la matriz de la membrana del sótano.</li>
	<li>Anestesiar ratones colocándolos en una cámara con isoflurano y el oxígeno (2,5%).</li>
	<li>Asegúrese de que los ratones son profundamente anestesiados antes de realizar la inyección (asegurándose de que la falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie).</li>
	<li>Inserte la aguja en la región bucal derecha o izquierda. Esto se realiza a través del espacio abierto disponible a ambos lados de la boca.</li>
	<li>Asegúrese de que lengua del ratón no está en el camino. Nota: Es fácil de meter la lengua, que se traducirá en tumores de la lengua. Mover la lengua hacia el lado opuesto si es necesario.</li>
	<li>Mantenga la jeringa paralela a la región bucal dentro de la cavidad bucal.</li>
	<li>Cuando esté listo para inyectarse, retire la jeringa y lentamente Inserte la jeringa en un ángulo de 10°.</li>
	<li>Inyectar 100 μl de la suspensión de matriz de la membrana celular basal durante un período de 5 s.</li>
	<li>Sostenga la jeringa en lugar de un adicional 5 s para asegurar todo el material es inyectado. Nota: Para los ratones de control nontumor-cojinete, inyectar una mezcla de medios libres de suero y de la matriz (como se describe anteriormente) sin las células del tumor.</li>
	<li>Retire la jeringa cuidadosamente.</li>
	<li>Seguir el procedimiento anterior con los ratones restantes.</li>
	<li>Permitir 1 semana hasta que los tumores comienzan a aparecer grueso (50 – 200 mm3 de las células B4B8 y LY2).</li>
</ol>3. seguimiento del ratón
<ol><li>Realizar la primera medición usando pinzas en 1 semana después de la inyección de células de tumor. Para calcular el volumen de tumor usando calibradores externos, determinar el diámetro longitudinal mayor (longitud) y el mayor diámetro transversal (ancho) y utilizar la fórmula elipsoidal modificado14,15. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59195/59195eq1.jpg">
</li>
	<li>Seguir para llevar a cabo medidas pinza regular para el volumen del tumor (x x-2 1 por semana a intervalos regulares).</li>
	<li>Medir el peso de los animales para evaluar los efectos del crecimiento del tumor en la alimentación.</li>
</ol>4. recolección de tumores
<ol><li>Cuando se alcanza el extremo experimental, eutanasia a los animales usando las medidas apropiadas (por ejemplo, CO2 asfixia, decapitación o la dislocación cervical). Nota: En este estudio, el punto final fue alcanzado si los ratones se convirtieron moribundos (con una pérdida de peso &gt; 15% de su peso inicial, falta de aseo, caquexia) o si el tamaño de tumor alcanza 1.000 mm3.</li>
	<li>
Comenzar la disección del animal mediante la creación de una larga incisión a través de la línea media en la región del cuello.
	<ol>
<li>Uso de fórceps romos para agarrar la piel y afiladas tijeras para cortar la piel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Introducir tijeras suavemente debajo de la piel que cubre el tumor y crear bolsas de aire, empujando las tijeras a través y en la piel.</li>
	<li>Una vez que la piel esté suficientemente separada del tumor, identificar los nodos de linfa de drenaje (DLNs) e impuestos especiales para evitar que el tejido del tumor confundido por la presencia de ganglios linfáticos. Nota: Tumores grandes pueden alcanzar o cubrir la DLN. Dependiendo del tipo de ensayo se realiza, el aislamiento de los ganglios linfáticos intactos es esencial para evitar el derramamiento de las células inmunes en el tumor, que darán lugar a sesgar los resultados del ensayo.</li>
	<li>Corte a través de las fronteras del tumor hasta que se extrae todo el volumen.</li>
</ol>5. tumor de procesamiento para aplicaciones posteriores
<ol><li>Para la examinación histologic aguas abajo, coloque los tumores en formalina al 10% a temperatura ambiente. Para evitar overfixation, sustituir el formol con etanol al 70%. Para el análisis de citometría de flujo, proceso de los tumores como se describe a continuación. Nota: El tejido puede conservarse en formol durante 72 h antes de overfixation puede ser problemático para algunos tipos de manchas.</li>
	<li>Cortar el tumor en 1-2 mm-tamaño de piezas usando una hoja de afeitar estéril o unas tijeras afiladas.</li>
	<li>Colocar las piezas de corte del tumor en un tubo cónico de 50 mL con colagenasa III (4.250 unidades por muestra), DNasa I (0.1 mg por muestra) y el inhibidor de tripsina (1 mg por muestra).</li>
	<li>Incubar a 37 ° C durante 30 min con agitación cada 10 minutos. Nota: Las muestras pueden colocarse en una bolsa resellable, esterilizados con etanol al 90% y colocado en una incubadora de cultivo celular.</li>
	<li>Después de 30 min, añadir 20 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS) y centrifugado a 300 x g durante 5 minutos. Nota: HBSS está compuesto por cloruro de potasio, cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico y glucosa.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 – 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr). Pipeta con rigor. Nota: Tampón de lisis RBC se compone de disodio, cloruro de amonio y bicarbonato de sodio.</li>
	<li>Incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Nota: Incubación más largo puede ser tóxico para otras poblaciones de la célula.</li>
	<li>Añadir 20 mL de la HBSS para neutralizar el efecto de tampón de lisis.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS.</li>
	<li>Pasar la solución a través de un limitador de nylon 70 μm y centrifugar a 300 x g durante 5 min descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Repita los pasos 5.8, 5.10 y pasar la suspensión celular a través de un limitador de nylon de 40 μm para garantizar que cualquier escombro adicional se quita de la suspensión.</li>
</ol>6. células de tinción y adquisición de datos
<ol><li>Resuspender el precipitado de células en 1 mL de HBSS.</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado, tal como se describe en el paso 1.7</li>
	<li>
Determinar el número de células totales y concentración adecuada para la tinción. Nota: la concentración celular ideal para tinción de citometría de flujo es de 1 millón de células. Por ejemplo, si la coloración se realiza en una placa de 96 pocillos y hay 10 millones de células, Resuspender la muestra en 1 mL y la placa de 100 μL para 1 millón de células por pozo.</li>
	<li>
Añadir bloque Fc (CD16/CD32) a una concentración de 1: 100 con el fin de evitar la fijación específica de nonantigen de las inmunoglobulinas a los receptores FcγIII y FcγII. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Centrifugar y resuspender el precipitado de células en 100 μl de células de citometría de flujo tampón de tinción (compuesto de solución salina que contiene 5% SFB, 2% EDTA y 1% HEPES).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realizar la superficie de la célula tinción según las instrucciones proporcionadas por el proveedor (añadiendo cada anticuerpos en la dilución). Incubar por 60 min a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Centrifugar y resuspender el precipitado de células en 100 μl de HBSS. Repita 2 x para deshacerse del exceso del anticuerpo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ejecutar ejemplos en un citómetro de flujo apropiado.
	<ol>
<li>Si analizando marcadores intracelulares (por ejemplo, foxp3), realizar permeabilización celular y tinción según las instrucciones del proveedor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bonner, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+cetuximab+for+locoregionally+advanced+head+and+neck+cancer%3A+5-year+survival+data+from+a+phase+3+randomised+trial%2C+and+relation+between+cetuximab-induced+rash+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival.</a> The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+EphB4-Ephrin-B2+Signaling+Enhances+Response+to+Cetuximab-Radiation+Therapy+in+Head+and+Neck+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+radiosensitization+in+EphB4+receptor-expressing+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 6, 38792(2016).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+radiation+and+immunotherapy%3A+a+new+systemic+therapy+for+solid+tumors%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors?</a> Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).</li>
<li>Oweida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+radiotherapy+and+PD-L1+blockade+is+mediated+by+TIM-3+upregulation+and+regulatory+T-cell+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration.</a> Clinical Cancer Research. , (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Riguroso análisis y caracterización del microambiente tumoral representan una estrategia importante para los mecanismos de comprensión del desarrollo del tumor, la progresión y la metástasis y para el desarrollo de terapias efectivas. Cáncer de cabeza y cuello es una enfermedad compleja que puede originar de múltiples sitios anatómicos en la región de cabeza y cuello. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas de células de ratón murino que se aseme...

HNSCC es la malignidad más común en quinto lugar a nivel mundial, con más de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. A pesar del tratamiento agresivo con quimioterapia y radioterapia (RT), la tasa general de supervivencia (SG) para pacientes HNSCC sin infección humana del papillomavirus (HPV) sigue siendo inferior al 50% después de 5 años2. Esto se atribuye principalmente a un microambiente tumoral compleja como pueden originar tumores de varios sitios anatómicos distintos dentro de la región de cabeza y cuello, incluyendo la mucosa bucal, lengua, piso de la boca, cavidad nasal, cavidad oral, faringe, Oropharynx y hypopharynx. Además, la región de cabeza y cuello es altamente vascularizada y contiene casi la mitad de todos los nodos de linfa en el cuerpo3. La mayoría de estudios que investigan la biología tumoral de cabeza y cuello se basan en modelos de tumores en la región de flanco. Tales modelos pueden ofrecer visión de mecanismos intrínsecos de tumor, pero la falta del microambiente natural de cabeza y cuello puede afectar significativamente el potencial traslacional de tales resultados. Un método que se ha utilizado para inducir tumores orales es a través de la exposición al carcinógeno 9, 10-Dimetil-1, 2-benzanthracene (DMBA)4. Sin embargo, este método está asociado a un proceso largo, induce tumores en ratas y hamsters pero no en ratones, y los tumores resultantes no poseen muchas de las características histológicas de SCCs diferenciados5,6. La introducción de la carcinogen4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), un derivado de la quinolona soluble en agua, resultaron en tumores orales de ratón cuando se aplica por vía oral pero también sufrió de tiempos de exposición largos (16 semanas) y una limitada tome velocidad dentro y entre lotes de ratones7,8,9. Para desarrollar modelos clínicamente relevantes, varios grupos utilizaron modelos transgénicos que implican la manipulación de oncogenes de controlador o genes supresores de tumores, incluyendo TP53, TGFB, KRAS, HRAS y SMAD410. Estos modelos pueden ofrecer información sobre tumores con genes de la conductor conocido pero no recapitular la compleja heterogeneidad de HNSCCs humanas.
En este trabajo se demuestra la viabilidad de realizar una inoculación intramucosal de carcinoma de células escamosas células en ratones. Células inoculadas se convierten en tumores agresivos dentro de 1 semana de la inyección. Similar a la humanas HNSCCs, los tumores metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Caracterizar las características histológicas y clínicas de la enfermedad y proporcionar la penetración en el microambiente inmunológico del tumor. Proponemos que este modelo ortotópico de HNSCC tiene aplicaciones en Biología del cáncer, Inmunología tumoral y estudios preclínicos. Mecanismos de evasión inmune, resistencia al tratamiento, progresión tumoral y metástasis representan áreas de significación clínica que se puede abordar utilizando el modelo propuesto.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa III</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS004183</tr><tr><td>DNasa I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS006328</tr><tr><td>Bloque Fc (CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>&nbsp; Clonar 2.4G2&nbsp;</td></tr><tr><td>tampón de tinción para citometría de flujo</td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175079</td><td>calcio, sin magnesio, sin fenotipo rojo</td></tr><tr><td>Citómetro de masas Helois</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matriz de membrana</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CB-40234B</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de resonancia magnética</td><td>Bruker</td><td>NA</td><td>7.4 Tesla</td></tr><tr><td>Tampón de lisis RBC</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td></td>LS002830</tr></tbody></table>

intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del tumor y tratamiento evaluación de respuesta

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es una enfermedad debilitante y mortal con una alta prevalencia de repetición y fracaso del tratamiento. Para desarrollar mejores estrategias terapéuticas, comprensión tumor microambiental los factores que contribuyen a la resistencia al tratamiento es importante. Un impedimento importante para entender mecanismos de la enfermedad y mejorar la terapia ha sido la falta de líneas celulares murinas que se asemejan a lo agresivo y metastásico de HNSCCs humanas. Además, la mayoría de modelos murinos emplear implantes subcutáneos de los tumores que carecen de funciones fisiológicas importantes de la región de cabeza y cuello, incluyendo la alta densidad vascular y vasculatura linfática extensa flora residente mucosa. El propósito de este estudio es desarrollar y caracterizar un modelo ortotópico de HNSCC. Contamos con dos líneas celulares murinas genéticamente distintos y tumores establecidos en la mucosa bucal de ratones. Optimizar métodos de digestión de tumor de base de colagenasa para la recuperación óptima de las células de tumores establecidos. Los datos aquí presentados muestran que ratones desarrollan tumores altamente vascularizados que metastatizan a los ganglios linfáticos regionales. Análisis de citometría de masas multiparamétrico unicelular muestran la presencia de diversas poblaciones inmunes con células mieloides que representan a la mayoría de todas las células inmunes. El modelo propuesto en este estudio tiene aplicaciones en la biología del cáncer, Inmunología tumoral y desarrollo preclínico de nuevas terapias. El parecido del modelo ortotópico de características clínicas de la enfermedad humana le brindan una herramienta para la traducción mejorada y mejora los resultados del paciente.

La evaluación in vitro de la proliferación celular LY2 y B4B8 mostraron que ambas líneas celulares tienen tiempos de duplicación similares (21 h y 23 h, respectivamente). In vivo, ambas líneas celulares forman una masa única, visible y palpable dentro de 1 semana de inoculación (figura 1A). En ratones tumores LY2, la mandíbula fue desplazada por 3 semanas debido a la carga del tumor (figura 1A). Ratones control que no recibió las...

Aquí presentamos un método reproducible para el desarrollo de un modelo Murino ortotópico de cabeza y cuello de células escamosas. Tumores demuestran clínicamente relevantes características histopatológicas de la enfermedad, como necrosis, pobre diferenciación, metástasis ganglios, infiltración inmune. Ratones con tumores síntomas clínicamente relevantes incluyendo disfagia, desplazamiento de la mandíbula y pérdida de peso.

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Los cánceres de la región de la cabeza y el cuello son cada vez más frecuentes. Sin embargo, hay una comprensión limitada del microambiente tumoral y los mecanismos de resistencia al tratamiento en esta región. Esta técnica se puede utilizar para recapitular el microambiente nativo de tumores de cabeza / cuello de una manera accesible y produce manifestaciones clínicas similares a las observadas en los seres humanos.Cuando el cultivo celular tumoral haya alcanzado el 70% de confluencia, lave las células tres veces con PBS frío por lavado y conecte las células con suficiente 0,25% de trippsina para cubrir la superficie inferior del matraz de cultivo. Después de tres a cuatro minutos en la incubadora de cultivo celular, confirme el desprendimiento bajo un microscopio ligero y neutralice la trippsina con 12 mililitros de DMEM F12 medio, complementado con suero bovino fetal. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros y mezcle las células de tres a cuatro veces por inversión.Luego recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en suero y DMEM libre de antibióticos en un uno por 10 a las sextas células tumorales por cada 50 microlitros de concentración media en hielo. Inmediatamente antes de la inyección, mezcle las células en una unidad de matriz de membrana de una a una a una célula tumoral en hielo. Cargue una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 23 con 100 microlitros de células por animal receptor.Coloque las jeringas sobre hielo y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro. A continuación, inserte la aguja en la región bucal derecha o izquierda a través del espacio abierto disponible a ambos lados de la boca manteniendo la jeringa paralela a la región bucal mientras está dentro de la cavidad oral para facilitar la inyección del volumen completo de 100 microlitros de la suspensión de la matriz de membrana del sótano celular durante un período de cinco segundos. Mantenga la jeringa en su lugar durante cinco segundos adicionales para asegurarse de que todo el material se ha inyectado antes de retirar la jeringa suavemente.Los tumores se volverán muy visibles en aproximadamente una semana. Una semana después de la inyección, utilice pinzas para medir la longitud y el ancho de cada tumor para determinar el volumen tumoral de una a dos veces por semana. Y medir el peso de cada animal para evaluar los efectos del crecimiento tumoral en la alimentación.En el punto final experimental adecuado, utilice tijeras afiladas y fórceps contundentes para hacer una incisión cutánea a través de la línea media en el cuello. E inserte las tijeras suavemente debajo de la piel que cubre el tumor para crear bolsas de aire empujando las tijeras a través y en la piel. Una vez que la piel está lo suficientemente desprendida del tumor, extirpa los ganglios linfáticos drenantes para evitar que el tejido tumoral se confunda por la presencia de tejido linfático y atraviesa los bordes del tumor hasta que todo el volumen se desprende.Para procesar el tumor para el análisis aguas abajo, corte el tumor en trozos de uno a dos milímetros y coloque las piezas en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga colagenasa tres, DNA uno e inhibidor de la trippsina. Después de incubar las piezas tumorales a 37 grados Celsius durante 30 minutos, con temblores cada 10 minutos, añadir 20 mililitros de HBSS al tubo y pasar la suspensión que contiene las piezas tumorales a través de un colador de nylon de 70 micrómetros verter. Utilice un émbolo de jeringa de cinco mililitros para triturar las piezas tumorales en el colador y añadir 10 mililitros adicionales de HBSS a través del colador.Gire las células por centrifugación. Re-suspender el pellet en dos o tres mililitros de tampón de lysis de glóbulos rojos con pipeteo riguroso, neutralizando la lelisis con 20 mililitros de HBSS fresco después de dos minutos a temperatura ambiente. Luego vuelva a suspender las células en 20 mililitros adicionales de HBSS para otra centrifugación y tensar las células a través de un filtro de vertido de 40 micrómetros para eliminar cualquier residuo final de la suspensión de la célula tumoral.Los tumores LY2 crecen a una tasa más alta, en comparación con los tumores B4B8. Y los ratones que presentan desplazamiento de la mandíbula desarrollan rápidamente pérdida de peso, debido a la disfagia. La mediana de supervivencia en ratones LY2 también es inferior a la mitad que se observó para ratones portadores de tumores B4B8.La resonancia magnética de ratones portadores de tumores muestra tumores bien demarcados que se extienden a la capa interna de la mucosa bucal, pero no a la lengua u otros órganos cercanos. El examen histológico indica que todos los ratones portadores de tumores LY2 desarrollan carcinoma de células escamosas mal diferenciados, mientras que los ratones con tumores B4B8 desarrollan carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciadas. Todos los ratones con tumor LY2 también tienen necrosis confirmada histológicamente, y la mayoría demuestra necrosis de moderada a grave.En este experimento representativo, un tumor LY2 fue cosechado y procesado tres semanas después de la inyección de células tumorales de la región bucal, como se demostró. Las células inmunitarias CD45 positivas representaron el 7,3% de la población total de células tumorales. Las células mieloides CD11b positivas representaron el 37,8% de todas las células positivas CD45, la mayoría de las cuales se determinó que eran macrófagos positivos a F480, y también se observaron pequeñas poblaciones de neutrófilos y células supresoras derivadas de mieloides.Las células T comprendieron el 15,9% de la población de células inmunitarias CD45 positivas, de las cuales el 53,4% eran células T reguladoras de FoxP3 positivas CD4. Las células asesinas naturales comprendían menos del 2% de todas las células cd45 positivas. Es importante practicar la inyección para desarrollar confianza y comodidad en la sujeción de la aguja y el ratón receptor y en la exposición de la boca del animal.Una vez que el procedimiento se ha realizado con éxito, se pueden realizar experimentos que impliquen la evaluación de la respuesta tumoral a la terapia o la evaluación del tumor de factores intrínsecos y microambientes. Esta técnica ha allanado el camino en el diseño de un ensayo clínico iniciado por el investigador, evaluando los efectos de la combinación de radioterapia con terapia anti-PL1 en pacientes con cáncer de cabeza y cuello.

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Un modelo ortotópico de cáncer de ovario seroso en ratones inmunocompetentes para In vivo Imágenes y seguimiento de tumores de las respuestas inmunitarias del tumor

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

En este video, desarrollamos un modelo murino de cáncer ortotópico de cabeza y cuello mediante la inoculación intramucosa de la línea celular de carcinoma de células escamosas. El ratón portador de tumores mostraría semejanza con los síntomas clínicamente relevantes de la enfermedad humana y, por lo tanto, se puede utilizar para estudiar la progresión del cáncer y descubrir nuevas estrategias terapéuticas.

Inoculación intramucosa de células cancerosas en un modelo murino: un procedimiento para establecer un modelo ortotópico de cáncer de cabeza y cuello en ratones

Este video muestra un ensayo de vacunación tumoral basado en células. Un ratón, inyectado por vía intradérmica con células de melanoma B16-F10 para la formación de tumores, es vacunado con células B16-F10 que secretan citocina Flt3L cerca del tumor desarrollado. El Flt3L secretado por la vacuna promueve la maduración y proliferación de las células dendríticas que luego presentan antígenos tumorales a las células T en los ganglios linfáticos, desencadenando una respuesta inmunitaria antitumoral...

Implantación tumoral e inyección de una vacuna tumoral en un modelo de ratón

Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.

Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Este estudio se centra en la inducción subcutánea in vivo de células luminiscentes de cáncer colorrectal en un modelo murino y la posterior medición de la luminiscencia mediante un sistema de imagen. El procedimiento tiene como objetivo establecer un modelo de crecimiento tumoral reproducible para el seguimiento en tiempo real y la evaluación terapéutica.

Inyección subcutánea de células de cáncer colorrectal humano en ratones desnudos atímicos para evaluar la eficacia antitumoral

Aquí se muestra un método único para resecar quirúrgicamente tumores de carcinoma escamoso oral establecido en la cavidad oral.

Modelo de resección tumoral relevante para traslacionalmente para modelos preclínicos de murino de carcinoma escamoso oral

Con el creciente interés en la inmunoterapia intratumoral, es esencial seleccionar modelos tumorales accesibles y prácticos. Los tumores subcutáneos son fáciles de establecer pero difíciles de visualizar y manipular. En este protocolo, describimos métodos para generar tumores intradérricos que proporcionan mejor visibilidad y accesibilidad.

Implantación de tumores intradérmicos como modelo robusto para estudios de inmunoterapia intratumoral del cáncer de murino

Aprenda a desarrollar un modelo ortotópico murino de carcinoma escamoso de cabeza y cuello mediante inoculación intramucosa. Este método permite estudiar el microambiente tumoral y evaluar respuestas al tratamiento.

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta (Video) | JoVE Journal

Intramucosal inoculación de células escamosas células en ratones para perfilar inmune del Tumor y tratamiento evaluación de respuesta

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