Name: Mediciones automatizadas de sueño y actividad locomotriz en mexicano Cavefish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Aprenda a medir el comportamiento locomotor y los patrones de sueño en peces ciegos mexicanos bajo condiciones de alojamiento social. Este protocolo automatizado permite estudiar neurociencia y etología en peces de cueva.

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Este trabajo fue apoyado por NIGMS GM127872 ACK, NINDS Premio 105072 ERD y ACK y Premio NSF 1656574 ACK.

Nota: Establecer sistemas para el seguimiento conductual en larvas y adultos.
1. construir un sistema de descanso para las larvas
Nota: El sistema de monitoreo para seguimiento de larva a través de peces menores de edad 4 días post fecundación (dpf) a través 30 PD a. mexicanus requiere varios equipos incluyendo iluminación infrarrojos (IR), difusores de acrílico IR ligeros, automatizado luz controles (temporizadores), computadoras, cámaras y materiales secundarios como cableado y reguladores de potencia (figura 1A). Las siguientes instrucciones le informará cómo construir un sistema de seguimiento preciso comportamiento locomotor para estudio de sueño y ritmos circadianos en larvas mexicanus a.
<ol><li>Construir un sistema de iluminación que consiste en IR y blanco diodos electroluminosos (LED): colocar tres luces de IR en un triángulo aproximadamente 7.62 cm unos de otros en un disipador térmico de plataforma metálica delgada de 30,5 x 30,5 cm. Luces de serie del alambre con alambre eléctrico y conectar a una fuente de energía.</li>
	<li>Coloque una sola luz blanca LED en el centro de las tres luces de IR y conectar a la fuente de alimentación.</li>
	<li>Conecte la fuente de alimentación para el LED a un temporizador de luz para un tiempo circadiano estándar.</li>
	<li>Construir una plataforma para el sistema de seguimiento de larvas. Utilice 0,33 cm gruesa muestra blanca de acrílico para todos los componentes de la plataforma.</li>
	<li>Coloque la plataforma de grabación sobre el disipador térmico del cuadrado iluminado en que arenas que contienen peces residirá durante seguimiento conductual.</li>
	<li>
Coloque un segundo acrílico dentro de la caja entre las luces y los animales para difundir el IR para una óptima iluminación y contraste. Nota: las dimensiones de la caja de luz larval es el siguiente: dos de 18 x 8,5 cm y dos 17 x 8,5 cm LEDs que están químicamente enlazados juntos para formar un 18 x 18 cm cuadrados es de 8,5 cm de altura. Además, acrílico puede ser fácilmente cortado o perforado usando las herramientas adecuadas para el tamaño modificado para requisitos particulares.<ol>
<li>Coloque el todo seguimiento larval etapa y la instalación de la iluminación dentro de un tubo de plástico cerrado y luego coloque la cámara en la parte superior del tubo. Nota: Es importante evitar reflexiones de luz aparezcan en el video de seguimiento, como esto va afectar a la exactitud del seguimiento. La colocación de cámaras en la parte superior un tubo que rodea la plataforma mejora la iluminación y la nitidez de las cámaras que se utilizan para estos experimentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manipular una webcam (véase Tabla de materiales) para la grabación basada en IR. Retirar la lente fabricante usando una herramienta giratoria (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Quite los tornillos de plata pequeñas en los lados detrás de la cámara para retirar la carcasa interior.</li>
	<li>Quite los tornillos negro pequeño dentro del cuerpo de la cámara para aflojar el resto de la lente. Utilice un destornillador pequeño para quitar las porciones de la cubierta de la lente que queda después de cortar la lente.</li>
	<li>Quitar el azul LED en la parte superior de la carga junto a viviendas de dispositivo (CCD).</li>
	<li>Armar la cámara hacia atrás colocando la cubierta interior a su orientación original y atornillar los dos tornillos de plata regresa a su posición original.</li>
	<li>Ruta del interior de la cámara con una pequeña sierra con un poco de enrutamiento plástico redondeado. Lisa hacia abajo el plástico extra hasta que puede caber un adaptador de lente.</li>
	<li>Instale un filtro de paso IR dentro de la cámara tan cerca de la CCD como sea posible sin hacer contacto directo con la cámara. Nota: Tenga cuidado para no dañar el chip CCD en la carcasa de la cámara. Asegúrese de que el corte más plana posible. Selle cualquier espacio abierto entre el exterior del filtro IR y el cuerpo de la cámara para impedir que la luz de alcance CCD sin filtrarla.</li>
	<li>Conecte la cámara a un lente de 35 mm fijada (véase Tabla de materiales) atornillando el adaptador en el frente de la cámara en la parte posterior de la lente.</li>
	<li>Coloque la cámara y la lente en el orificio perforado en la tapa en la parte superior del tubo que contiene el escenario y las luces y conectar el USB al PC de que se registrará a los animales. Nota: Coloque el pescado en una sala del comportamiento que es independiente de donde se encuentran peces stock para garantizar mínimas interrupciones durante la grabaciones de comportamiento. Tenga cuidado para reducir al mínimo las fluctuaciones en la temperatura y ventilación que puede confundir los experimentos conductuales.</li>
</ol>2. sistema de dormir para adultos
<ol><li>Construir un sistema de iluminación IR para el seguimiento de peces adultos cortando tiras IR a intervalos de aproximadamente 46 cm. Una tira de 46 cm es suficiente para cada tanque de 10 L comportamiento.</li>
	<li>Cada tira juntos en una serie, cada tira de alambre eléctrico DC de soldadura de alambre y coloque en una fuente de alimentación de 9 V.</li>
	<li>Fije cada tira de IR a una pieza de 51 cm x 5,1 cm de aluminio que actúa como un disipador de calor.</li>
	<li>Coloque una 46 cm x 5 cm, 0,32 cm 9% muestra blanca luz paso hoja de acrílico gruesa directamente en frente de cada tira de la luz IR para difundir el IR ligero.</li>
	<li>Coloque todos los tanques en un rack compatible con iluminación IR montado atrás.</li>
	<li>Utilizar separadores de plástico opacos en tanques de cristal de 10 L para crear arenas individuales. Nota: El tamaño de la arena puede variar basado en el número de divisores utilizados y el tamaño del tanque. Tamaño de arena impacta actividad locomotriz y el sueño en la cueva y peces superficie23.</li>
	<li>Montaje de las cámaras aproximadamente 4-6 metros de los tanques. Cada cámara puede grabar normalmente de 3 tanques a la vez para proporcionar suficiente resolución para el seguimiento. Nota: Grabaciones de comportamiento adulto generalmente no requieren un sistema de iluminación blanco separado para controlar cambios de día de noche. Simplemente utilizando lámparas de techo estándar en una habitación comportamiento conectado a un contador de tiempo es probable que sea suficiente.</li>
</ol>3. registro actividad locomotriz
Nota: Todas las grabaciones del comportamiento se realizan con un ordenador estándar portátil o escritorio con una fuente de batería de respaldo. Debido al tamaño de archivo grande de un 24 h de grabación (60-100 GB), guardar todas las grabaciones en discos duros externos.
<ol><li>Aclimatar los peces 4-30 años PD para 18-24 h antes de iniciar grabaciones. Alimentar larvas peces con Artemia viva estando primero en la cámara de grabación y 1 h antes de comenzar la grabación. Aclimatar a los peces adultos 4-5 días antes de la grabación de comportamiento y alimentación una vez al día con el alimento de la escama o con blackworms vivo. Nota: Asegúrese de colocar peces larvas en agua dulce antes de la grabación, como camarón de salmuera sobrante hará seguimiento problemas durante el análisis posterior. Co-cultivo con rotíferos proporciona una opción alternativa, como su pequeño tamaño no interfiere con el seguimiento.</li>
	<li>Coloque el pescado entre 4-6 PD en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Pescado de casa años 20-30 PD en placas de cultivo de tejidos 12-bien para la grabación.</li>
	<li>Adultos récords en depósitos de 10 L forma con separadores para dar cabida a cinco peces alojados individualmente, o sin división registro y actividad en un entorno social. Nota: Tenga cuidado para enfocar la cámara antes de iniciar la grabación con el fin de maximizar la precisión de seguimiento. No abrir el diafragma de la lente de la cámara demasiado lejos, ya que al hacerlo reducirá dramaticamente la nitidez de la imagen. Hay un equilibrio, sin embargo; Si el iris se cierra demasiado, la velocidad de fotogramas del vídeo se sitúe por debajo de 15,00 fps. Es esencial para un análisis posterior que la velocidad de fotogramas sigue siendo 15,00 marcos por s para su uso con algunos script de sueño medida23,24.</li>
	<li>Programar/brillo de iluminación iluminación de fondo.</li>
	<li>Optimizar la iluminación antes del comienzo de la grabación. Siempre mantener el contraste en el nivel más alto posible y usar el brillo y la Iluminación de fondo para ajustar el brillo hasta que los animales son más claros.</li>
	<li>Peces discos por 24 o 48 horas. Nota: Paquetes de batería de emergencia que potencia la iluminación, Computadoras y cámaras deben comprarse en caso de cortes de energía. Todos los paquetes de batería deben también conectarse a tomas de corriente de emergencia, si es posible. Las baterías generalmente no potencia el equipo por más de unos minutos a una hora en la mayoría y servir de puente entre perder el poder principal y transferencia al sistema de energía de emergencia.</li>
</ol>4. Análisis de la actividad locomotriz en individual encuentra peces usando automatizado de Software de seguimiento
<ol><li>Para comenzar el análisis del comportamiento, abra el software de seguimiento, seleccione el Nuevo experimento de plantillay seleccione aplicar una plantilla de Pre-Defined.</li>
	<li>Como el programa le preguntará ahora qué especie de pista, seleccione peces. Utilice el menú desplegable para seleccionar ya sea Las larvas de pez cebra de Pez cebra adulto dependiendo el paradigma experimental.</li>
	<li>Establecer los ámbitos en que cada animal será rastreado. Las larvas, seleccionar bien la placa, bien redondo y Plantilla de zona No. Para adultos, uso de campo abierto, Plaza con Plantilla de zona No. Luego determinar el número apropiado de arenas, uno para cada animal que se rastrean en el video.</li>
	<li>Seleccione el modelo para el óptimo seguimiento, haga clic en seguimiento de punto central de , y asegúrese de que está seleccionado el color del animal a ser más oscuro que el fondo. Aplicar el tipo de marco en el que el vídeo fue adquirido. El software de seguimiento debería detectar automáticamente esto.</li>
	<li>Dibujar a escala para calibrar la distancia del mundo real de un objeto para determinar con precisión el comportamiento locomotor de los peces utilizando la Configuración de la Arena.</li>
	<li>Editar los campos para asegurarse de que toda la zona que los peces están en será rastreada; de lo contrario las muestras se perderán durante la adquisición. Nota: Tenga cuidado al configurar zonas. Especialmente peces larvales son sensibles a errores de seguimiento si las arenas son demasiado grandes o pequeños. Mala iluminación en el experimento también puede crear sombras en las paredes de placas de pozos, que el programa puede pensar que es un animal, creando un falso positivo.</li>
	<li>Haga clic en avanzadas. Bajo el método de Ajuste de la detección, seleccione Resta dinámica, luego haga clic en fondo y seleccione Iniciar el aprendizaje. Ajustar la relación de señal/ruido de contraste oscuro hasta los animales se rastrean bien, y el fondo no es la causa del seguimiento saltar. Nota: Calidad de vídeo puede variar entre los experimentos, cada ensayo puede necesitar usar configuraciones diferentes, por consiguiente. Usando las características Objeto de contorno y Tamaño del sujeto puede mejorar significativamente el seguimiento de resultados.</li>
	<li>Seleccione lista de ensayo y los parámetros apropiados de la carga antes de comenzar a grabar los datos en el programa.</li>
	<li>Haga clic en la ficha de adquisición , seleccione Pista de todos los ensayos previstos y haga clic en el botón de grabación.</li>
	<li>Bajo Perfil de análisis, asegúrese de distancia, tiempo y movimiento están seleccionadas. Nota: En orden para su posterior análisis de sueño, es fundamental que estos ajustes son correctos, como el .perl archivo debe leer estos datos en el orden correcto para calcular el sueño.</li>
	<li>En exportación, seleccionar Datos, exportar los datos como texto Unicode.</li>
</ol>5. seguimiento social encuentra peces
<ol><li>Siga los pasos 4.1-4.4 configurar el experimento en el software de seguimiento.</li>
	<li>En el menú desplegable, seleccione cuántos animales a la pista para el experimento.</li>
	<li>En configuración de la Arena , dibujar la escala correcta para calibrar la distancia del mundo real.</li>
	<li>En configuración de la detección , uso Dinámico de la substraccióny ajustar el contraste oscuro para seguir mejor el animal.</li>
	<li>Ajuste el tamaño del sujeto en la configuración de detección, para que sólo una porción muy pequeña del animal se realiza un seguimiento. Nota: Mediante el seguimiento de sólo una pequeña parte del animal, esto reducirá la cantidad de conmutación entre los animales cuando cruzan durante la adquisición.</li>
	<li>Una vez que se adquieren las pistas, utilice el Editor de pistas para fijar manualmente veces donde pueden cruzar peces.</li>
</ol>6. extracción de los datos de sueño de la actividad locomotriz
Nota: La definición de comportamiento del sueño en larvas y adultos de a. mexicanus es 1 min o más de inactividad. Esta definición se determinó utilizando experimentos de umbral de excitación, donde un mayor estímulo sensorial es necesaria para iniciar una respuesta conductual en un estado de hibernación (> 60 s) comparado con el despertar14,17. Para tener en cuenta para que pequeños movimientos y común a la deriva para la pesca de especies, se aplican límites de velocidad para segregar el movimiento real de ruido o deriva. Estos umbrales son derivados de cómputo mediante la comparación de las correlaciones entre la distancia y duración del sueño para encontrar los valores más altos de R-squared; determinando la velocidad más exacta para el movimiento y el sueño. Peces larvales, los límites superiores e inferiores son ambos 12 mm/s ya que es poco o no deriva. Para peces adultos el límite inferior es de 2 cm/s con un límite superior de 4 cm/s a cuenta de la deriva.
<ol><li>Instalar Cygwin en el equipo de análisis para llevar a cabo la ejecución de las secuencias de comandos escritas a medida para extraer el aparato locomotor y dormir comportamiento.</li>
	<li>Crear una nueva carpeta de experimento, dentro del directorio home de Cygwin.</li>
	<li>Importar los datos de Unicode sin formato de software de seguimiento y ejecutar el archivo .sh en Cygwin para convertir la codificación de UTF-16, UTF-8.</li>
	<li>Ejecute el archivo de .perl en Cygwin para extraer los datos de sueño.</li>
	<li>Abra el archivo de macro y siga las instrucciones en la hoja de cálculo para finalizar el análisis de los datos como se desee. Nota: Un nivel básico de la codificación de línea de comandos será necesario llevar a cabo esta parte del análisis. Comandos general Linux serán suficiente. Si hay problemas con los programas de lectura de los datos correctamente, compruebe los datos de seguimiento de software en cualquier editor de texto libre para asegurarse la codificación y orden es correcta para los archivos ejecutables escribir correctamente.</li>
</ol>

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 <a target="_blank" href="http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1">http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1</a> (1994).</li>
<li>Seehausen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+cichlid+fish%3A+a+model+system+in+adaptive+radiation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+Biological+Sciences%2FThe+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research.</a> Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).</li>
<li>Basolo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+preference+predates+the+evolution+of+the+sword+in+swordtail+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish.</a> Science. 250, 808-810 (1990).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Este protocolo describe un sistema de medida para cuantificar el sueño y la actividad locomotriz en larvas y adultos cavefish. Cavefish ha surgido como un líder modelo para el estudio de la evolución del sueño que se puede utilizar para investigar la base genética y de los nerviosas de sueño Reglamento1. Los pasos críticos en este protocolo incluyen la optimización de la iluminación y calidad de vídeo para asegurar un seguimiento preciso es necesaria cuantificar el sueño. El sistema de adquisición...

Sueño se conserva altamente en todo el reino animal en los niveles fisiológicos, funcionales y conductuales1,2,3. Mientras sueño en los animales mamíferos de laboratorio normalmente se evalúa mediante electroencefalogramas, las grabaciones electrofisiológicas son menos prácticas en sistemas pequeños modelo genéticamente susceptibles y así dormir normalmente se mide en base a comportamiento3 , 4. características de comportamiento asociadas con el sueño están muy conservadas a lo largo del reino animal e incluyen umbral de excitación creciente, reversibilidad con estimulación y prolongada inactividad conductual5. Estas medidas se pueden utilizar para caracterizar el sueño en los animales que van desde el gusano nematodo C. elegans, a través de los seres humanos6.
El uso de quietud conductual para caracterizar el sueño requiere software de rastreo automatizado. Con software de seguimiento, se determinan periodos de actividad e inmovilidad durante varios días y largos períodos de inactividad se clasifican como dormir7,8. En los últimos años se han desarrollado múltiples sistemas de seguimiento para la adquisición de datos de actividad entre una diversidad de sistemas de la pequeña modelo genéticamente susceptibles; como gusanos, moscas de la fruta y pescado9,10,11. Estos programas van acompañados de software que permite el seguimiento automatizado del comportamiento animal, incluyendo freeware de código abierto y software disponibles en el mercado7,12,13,14 . Estos sistemas difieren en su flexibilidad y permitan la eficiente detección y caracterización de los fenotipos de sueño en numerosos modelos genéticamente modificable.
Investigación genética del sueño en el pez cebra, Danio rerio, ha llevado a la identificación de numerosos genes y circuitos neuronales que regulan el sueño15,16. Mientras que esto ha proporcionado un sistema poderoso para investigar la base neural del sueño en un animal de laboratorio vertebrados, es mucho menos conocida sobre cómo evoluciona el sueño y cómo natural variación contribuye a dormir Reglamento. El mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), han evolucionado las diferencias dramáticas en el sueño, la actividad locomotriz y ritmos circadianos17,18. Estos peces existen ojos superficie peces que habitan en los ríos de México y sur de Texas y al menos 29 cueva las poblaciones de la región de la Sierra Del Abra del noreste de México19,20,21. Notablemente, muchas diferencias conductuales, incluyendo la pérdida de sueño, parecen haber emergido independientemente en varias poblaciones de cavefish14,22. Por lo tanto, cavefish proporciona un modelo para la investigación de la evolución convergente de sueño, circadiano y comportamientos sociales.
Este protocolo describe un sistema para medir el sueño y el comportamiento locomotor en A. mexicanus de larvas y adultos. Un sistema de grabación basado en infrarrojos a la medida permite la grabación de vídeo de animales bajo condiciones de luz y oscuridad. Software disponible comercialmente puede utilizarse para medir la actividad y macros personalizadas se utilizan para cuantificar varios aspectos de inactividad y determinar periodos de sueño. Este protocolo también describe modificaciones experimentales para el seguimiento de la actividad de múltiples animales dentro de un tanque, proporcionando la capacidad de examinar las interacciones entre el sueño y comportamientos sociales. Estos sistemas pueden aplicarse a la medida de sueño y comportamiento circadiano locomotor actividad en especies de peces adicionales incluyendo el pez cebra y espinosos.

<table><tbody><tr><td>Adaptador de corriente de 12 V</td><td>Luces ambientales</td><td>Fuente de alimentación de 24 vatios y 12 V CC Separadores</td><td></td></tr><tr><td>acrílicos (adultos)</td><td>TAP Plastic Hojas</td><td></td><td>de pedido en tamaños según sea necesario</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de luz infrarroja para adultos</td><td>Luces ambientales Fuente de</td><td></td><td></td>alimentación de 24 vatios y 12 V CC</tr><tr><td>Paquete de baterías</td><td>CyberPower</td><td>CP850PFCLCD</td><td></td></tr><tr><td>Lente de la cámara (adultos)</td><td>Navitar Zoom 7000</td><td>Zoom 7000</td><td></td></tr><tr><td>Lente de cámara (larval)</td><td>Fujian 35mm f/1.7</td><td>B01CHX7668</td><td>Comprar en Amazon</td></tr><tr><td>Adaptador de lente de cámara</td><td>d</td><td>1524219</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de cámara</td><td>CowboyStudio Super Clamp</td><td>B002LV7X1K</td><td>Comprar en Amazon</td></tr><tr><td>Pecera</td><td>Deep Blue Professional</td><td></td> ADB11006 <td></td></tr><tr><td>Disipador de calor (adulto)</td><td>M-D Productos de construcción</td><td>SKU: 61085</td><td>Corte a medida</td></tr><tr><td>Disipador de calor (larval)</td><td>M-D Productos de construcción</td><td>SKU: 57000</td><td>Corte a medida</td></tr><tr><td>Luces infrarrojas (adultos)</td><td>Luces ambientales Infrarrojos 850 nm 5050 tira de LED</td><td>irrf850-5050-60-reel</td><td>Cortado a medida</td></tr><tr><td>Luces infrarrojas (larval)</td><td>LED World</td><td></td><td>B00MO9H7H4 Comprar en Amazon</td></tr><tr><td>Acrílico difusor de infrarrojos</td><td>TAP Plástico</td><td></td><td>Ordene hojas en tamaños según sea necesario</td></tr><tr><td>Computadora portátil/computadora</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cualquier computadora portátil funcionará.</td></tr><tr><td>Luz LED</td><td>Chanzon 10 Chip LED de alta potencia 3W Blanco (6000K-6500K / 600mA-700mA / DC 3V-3.4V / 3 vatios)</td><td>B06XKTRSP7</td><td>Úselo con Chanzon 25 piezas 1 W, 3 W, 5 W Disipador de calor LED (2 pines negros) Placa base de aluminio Temporizador</td></tr><tr>de<td>luz</td> del panel <td>Temporizador mecánico enchufable de 24 horas del siglo</td> Soporte de pared de plástico con conexión a tierra <td></td><td></td></tr><tr><td>para tablero</td><td>de clavijas de plástico IR Everbilt</td><td>Modelo # 17961</td><td></td></tr><tr><td>Cable</td> <td>de alimentaciónBNTECHGO Alambre de silicona de calibre 22</td><td>B01K4RPE0Y</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>Rapid LED</td><td>MOONLIGHT DRIVER (350MA)</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos</td><td>Fisherbrand</td><td>12 pocillos (FB012928) 24 pocillos (FB012929)</td><td></td></tr><tr><td>Trípode Cabeza de bola</td><td>Demon DB-44</td><td>B00TQ54CZO</td><td>Comprar en Amazon</td></tr><tr><td>USB Hardrive</td><td>Seagate 3TB copia de seguridad</td><td>STDT3000100</td><td></td></tr><tr><td>USB Webcam</td><td>Microsoft LifeCam</td><td>Q2F-00014</td><td>Compra en Amazon Soporte</td>de</tr><tr><td>pared para cámara</td><td>LDR Industries 1/2" Tubo de acero</td><td>307 12X36</td><td>Montado en pared con Brida y codo de tubo de 90&grados. También podría usar un trípode para sostener la cámara.</td></tr></tbody></table>

mediciones automatizadas de sueño y actividad locomotriz en mexicano cavefish

Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish

A través de phyla, sueño se caracteriza por características de comportamiento altamente conservadas que incluyen umbral de excitación elevados, rebotan tras privación de sueño y consolidaron períodos de inmovilidad conductual. El mexicano cavefish, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), es un modelo para estudiar la evolución del rasgo en respuesta a la perturbación ambiental. A. mexicanus existen ojos formas de superficie y varias poblaciones cavernícolas ciegas que tienen diferencias morfológicas y de comportamiento robustas. La pérdida de sueño ha ocurrido en múltiples poblaciones cavefish evolucionó independientemente. Este protocolo describe una metodología para la cuantificación de sueño y actividad locomotriz en cueva a. mexicanus y peces de superficie. Un sistema de vigilancia de video rentable permite la conducta la proyección de imagen de peces adultos o larvas alojadas individualmente por períodos de una semana o más. El sistema puede aplicarse a los peces de 4 días post fertilización hasta la edad adulta. El enfoque puede ser adaptado también para medir los efectos de las interacciones sociales en sueño registrando varios peces en una sola arena. Tras grabaciones de comportamiento, datos se analizaron usando automatizado de software de seguimiento y análisis de sueño es procesado usando scripts personalizados que cuantifican variables múltiples de sueño incluyendo duración, longitud de pelea y pelea número. Este sistema puede aplicarse a medida sueño y comportamiento circadiano locomotor actividad en casi cualquier especie de peces como el pez cebra y espinosos.

Edad de las larvas que DPF 4-30 puede ser confiablemente registrado en el sistema cerrado de la medida descrito en la figura 1. El sistema incluye IR y luz visible para permitir grabaciones en condiciones de luz y oscuridad, bajo diferentes condiciones de luz visibles (figura 1A). Los videos son luego analizan utilizando el software de seguimiento (figura 1BC) y post procesaron utili...

Este protocolo detalla la metodología para cuantificar el comportamiento locomotor y sueño en el mexicano cavefish. Análisis anteriores se extienden para medir estos comportamientos en pescados ubicado socialmente. Este sistema puede ser ampliamente aplicado para el estudio de sueño y actividad en otras especies de peces.

Mediciones automatizadas de sueño y actividad locomotriz en mexicano Cavefish

Across phyla, sleep is characterized by highly conserved behavioral characteristics that include elevated arousal threshold, rebound following sleep ...

Este protocolo se puede utilizar para cuantificar el sueño y la actividad en cualquier población de peces y tiene el potencial de ampliar el número de sistemas modelo utilizados para estudiar la regulación del sueño. La ventaja de esta técnica es su flexibilidad. Por ejemplo, los peces pueden ser rastreados en una variedad de tamaños de arena o en experimentos alojados en grupo o solos.Una fuerza de medición del sueño en este sistema es la capacidad de la aplicación del método para el cribado genético o de fármacos de alto rendimiento. Hemos aplicado este método al estudio de la evolución del sueño en dos poblaciones diferentes de peces cavernosos que demuestran fenotipos de sueño dramáticamente diferentes. Aunque puede ser difícil establecer un sistema de imágenes conductuales, nuestro sistema proporciona un método rentable para estudiar larvas y peces adultos.Para construir el sistema para rastrear con precisión el comportamiento locomotor para estudiar el sueño y los ritmos circadianos en A.mexicanus larvarios, utilice acrílico de signo blanco de 0,33 centímetros de espesor para construir una plataforma para el sistema de rastreo larvario. Coloque la plataforma de grabación en la parte superior del disipador de calor cuadrado iluminado en el que residirán las arenas que contienen peces durante los experimentos de seguimiento del comportamiento, y coloque un segundo acrílico dentro de la caja entre las luces de la carcasa del animal para difundir el infrarrojo para una iluminación y contraste óptimos. Coloque toda la etapa de rastreo larval y la iluminación establecida dentro de un tubo de plástico cerrado.Utilice una herramienta giratoria para quitar la lente de una cámara web experimentalmente adecuada. Retire los pequeños tornillos de la parte posterior de la cámara para quitar la carcasa interior y retire los pequeños tornillos dentro del cuerpo de la cámara para aflojar el resto de la lente. Utilice un destornillador pequeño para quitar cualquier porción de la carcasa de la lente que quede después de cortar la lente.Y retire el diodo azul emisor de luz en la parte superior del dispositivo acoplado a carga o la carcasa CCD. A continuación, vuelva a colocar la carcasa interior en su orientación original antes de volver a atornillar los dos tornillos exteriores en sus posiciones originales. Utilice una pequeña sierra para enrutar el interior de la cámara para permitir que la cámara esté equipada con una broca de enrutamiento de plástico redondeada que suaviza el plástico adicional hasta que pueda acompañar a un adaptador de lente.Instale un filtro de paso infrarrojo dentro de la cámara lo más cerca posible del CCD sin hacer contacto directo con la cámara, y atornille el adaptador de una lente fija de 35 milímetros en la parte delantera de la cámara en la parte posterior de la lente. A continuación, coloque la cámara y la lente en el orificio perforado en la tapa en la parte superior del tubo que alberga el escenario y las luces, y conecte el USB al ordenador en el que se grabarán los animales. Para construir un sistema de sueño para peces adultos, primero corte las tiras infrarrojas a intervalos de aproximadamente 46 centímetros.Y coloque una lámina de acrílico de 46 por cinco por 0,32 centímetros 9%luz de paso de señal blanca directamente delante de cada tira de luz infrarroja para difundir la luz infrarroja. A continuación, coloque todos los tanques en un bastidor que admita iluminación infrarroja montada en la parte trasera, y utilice divisores de plástico opacos y tanques de vidrio de 10 litros para crear arenas individuales. Registrar la actividad locomotora del tetranes mexicanos colocar el día de cuatro a seis peces post-fertilización en pozos individuales de una placa de tejido de 24 pozos, y días 20 a 30 post-fertilización en pozos individuales de una placa de tejido de seis pozos.Registrar el sueño y la actividad del tetra adulto en una casa social de hasta cinco adultos por tanque de 10 litros con o sin los divisores. En este experimento representativo, los peces larvales de tres poblaciones independientes de peces de cueva mostraron una reducción significativa en el sueño en comparación con los peces de superficie. Esta producción de sueño es consistente en todas las edades probadas, ya que el sueño también se redujo significativamente en los peces adultos de la cueva de Pachon, Molino y Tinaja en comparación con los peces de superficie.En particular, la vivienda social redujo fuertemente el sueño en peces de superficie sin afectar el sueño en los peces de la cueva de Pacho probablemente debido a un efecto de sótano en las poblaciones de peces de la cueva. Al grabar el pescado se debe tener cuidado de asegurarse de que la iluminación de la cámara es óptima para mejorar la señal de los peces en relación con el fondo. Se requiere alguna codificación de línea de comandos básica para este protocolo que se describe completamente en el texto y debe ser amenable a cualquier configuración de laboratorio.Este protocolo ha llevado a numerosas preguntas sobre la evolución del sueño y actualmente se utiliza para las pantallas de drogas, realizar un seguimiento del comportamiento del sueño, y entender cómo el comportamiento social afecta el sueño.

automated-measurements-sleep-locomotor-activity-mexican

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Se describen los procedimientos para el registro diario de los ritmos de actividad...

Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este video muestra un protocolo para implantar un conjunto de electrodos de electroencefalograma (EEG) y electromiograma (EMG) en un ratón anestesiado. El proceso consiste en asegurar el ratón en un marco estereotáxico, hacer una incisión en la línea media del cráneo, perforar agujeros para los electrodos y fijar la unidad de electrodos para el registro de la señal. Después de la recuperación, el comportamiento de sueño-activación del mouse se analiza utilizando las señales registradas.

Análisis del comportamiento del sueño en ratones a través de registros de electroencefalograma y electromiograma

Aquí, presentamos procedimientos experimentales y analíticos para describir la dinámica temporal de las variables neuronales y cardíacas del sueño no REM en ratones, que modulan la respuesta del sueño a los estímulos acústicos.

Cuantificación de la dinámica infrarroja de la potencia espectral y la frecuencia cardíaca en ratones dormidos

Se describe un método de alto rendimiento de medición de sueño por medio de la actividad casa jaula monitoreo. Este método ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales basados en el EEG. Bien validado para la determinación de la duración total del sueño y puede ser una poderosa herramienta para controlar el sueño en modelos de roedores de la enfermedad humana.

Determinación no invasiva, de alto rendimiento de la duración del sueño en roedores

Este artículo presenta un sistema de control biológico no invasor para el registro continuo y análisis de las actividades cardíaca y locomotor cangrejos de río. Este sistema consta de un sensor óptico y de infrarrojo cercano, un módulo de seguimiento de video y software para la evaluación de latidos de cangrejos de río que refleja su condición fisiológica y caracteriza el comportamiento del cangrejo durante las fluctuaciones del ritmo cardíaco.

La medición no invasiva continua de cigalas cardiaca y comportamiento

En este protocolo, demostrar cómo criar a adultos Astyanax mexicanus , criar las larvas y realizar montaje conjunto immunohistochemistry en post-larvaria pescado a los fenotipos de superficie y morfotipos de la cueva.

Aumento de la Tetra mexicano Astyanax mexicanus para análisis de fenotipos Post-larval y Immunohistochemistry Whole-mount

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Aquí, presentamos métodos para estudio de alto rendimiento de una serie de cavefish mexicano comportamientos y la coloración vital de un sistema de mechanosensory. Estos métodos utilizan scripts software libre y a medida, ofreciendo un método práctico y rentable para los estudios de comportamientos.

Seguimiento conductual y Neuromast proyección de imagen de mexicana Cavefish

La actividad locomotora (LMA) es una medición simple y de fácil realización de comportamiento en ratones. Acoplamiento de software de seguimiento de vídeo (VTS) y LMA permite la mejora de la especificidad y la sensibilidad, especialmente cuando se compara con el manual, el método de cruce de línea de análisis LMA. Además VTS permite el seguimiento a largo plazo de ratón LMA.

Ratón de corto y largo plazo la actividad locomotriz analizados por el software de seguimiento de vídeo

Aprenda a medir el comportamiento locomotor y los patrones de sueño en peces ciegos mexicanos bajo condiciones de alojamiento social. Este protocolo automatizado permite estudiar neurociencia y etología en peces de cueva.

Mediciones automatizadas de sueño y actividad locomotriz en mexicano Cavefish

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