Name: Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende a cuantificar proteínas a nivel de molécula única mediante etiquetado fluorescente y electroforesis. Este método revela la heterogeneidad de marcado invisible en análisis masivos y abre vías para diagnósticos ultrasensibles de moléculas patógenas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen a Masae Ohno y Kazuya Nishimura para asesoramiento y asistencia experimental. Este trabajo fue apoyado por PRESTO (JPMJPR15F7), Japón Agencia de ciencia y tecnología, subvenciones para jóvenes científicos (A) (24687022), desafiando la investigación exploratoria (26650055) y la investigación científica en áreas innovadoras (23115005), sociedad japonesa para la promoción de la ciencia y por las subvenciones de la Fundación de ciencia de Takeda y el Mochida Memorial Foundation para la investigación farmacéutica y médica. S.L. reconoce apoyo del programa de RIKEN internacional programa asociado (IPA).

1. preparación de la célula
<ol><li>Cultivar células HeLa en un plato de 10 cm a 37 ° C debajo del 5% de CO2 en Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero bovino fetal.</li>
	<li>Recoger las células de crecimiento exponencial una vez que han llegado a la confluencia de 70%, siguiendo las instrucciones de ATCC17.<ol>
<li>Lavar las células con 5 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH 7.4). Retirar el PBS.</li>
		<li>Añadir 1 mL de 0.1% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA). Incubar 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Controlar la progresión de la disociación de células por microscopía.</li>
		<li>Una vez que las células se convierten en la redondeos y son independientes de la fuente, añadir 4 mL de medio de cultivo y romper la aglomeración de células mediante pipeteo.</li>
		<li>Contar el número de células usando un contador de células.</li>
		<li>Centrifugue a 150 x g durante 10 min en un tubo de centrífuga. Quitarlo del medio y resuspender el sedimento celular con 5 mL de 1 x PBS (pH 7.4).</li>
		<li>Repita el paso 1.2.6. Resuspender las células en PBS 1 x (pH 7,4) a una concentración final de 106 células/mL utilizando el número de cuenta en el paso 1.2.5. Nota: La suspensión de células puede ser alícuotas y almacenados a-80 ° C durante varios meses. Debe evitarse repetir un ciclo de congelamiento/descongelamiento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. la célula lysis y etiquetado fluorescente
<ol><li>Tomar 10 mL de buffer de lisis (borato de 0,1 M, 1% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1% Tween 20). Ajustar a pH 12 con 2 M NaOH. PRECAUCIÓN: NaOH concentrado es corrosivo. Usar gafas y guantes adecuados al preparar esta solución. Nota: Tampón de lisis puede almacenarse hasta por una semana a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mezclar 100 μL de lisis buffer con 1 μL de Ditiotreitol (DTT) de 1 M y 4 μL de 50% 3 [(3-cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonate (caps).</li>
	<li>Mezclar 1 μL de cultivo celular (células aproximadamente 1.000) con el tampón de lisis mezclado en el paso 2.2. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. Volver a homogeneizar la solución transfiriendo poco a poco.</li>
	<li>Añadir 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave. Nota: El pH alto de este buffer hace neutralización de los residuos de lisina en las proteínas, llevando a una mayor reactividad.</li>
	<li>Repetir la adición de 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave. Nota: Esto repetida adición de colorante de NHS-éster puede aumentar la eficacia de etiquetado porque el tinte Cy3 NHS-ester es hidrolizado y desactivado por el alto pH del buffer de reacción.</li>
	<li>Ajustar a pH 7,2 añadiendo 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES)-NaOH pH 7.2 para calmar la reacción. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas.</li>
	<li>Añadir 20 μL de 19 mg/mL (glicol de polietileno (clavija)) de biotina-2-amina y 5 μL de 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave. Nota: Este paso de Biotinilación es necesario fijar las moléculas de proteína en un cubreobjetos microscopio con una densidad fija y sin sesgo para especies de proteína.</li>
	<li>Eliminar reactivos Etiquetadoras no reaccionados y concentrar la muestra mediante una columna de ultrafiltración con atajo del kDa 10, siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a-80 ° C durante varias semanas.</li>
</ol>3. proteoma separación y recuperación
<ol><li>Añadir 4 x tampón de muestra de SDS (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, glicerol 4% y 0.4% azul de bromofenol). Nota: Para evitar el daño del tinte, la muestra de proteína no se debe calentar como hecho en estándar SDS-PAGE y debe conservarse a temperatura ambiente.</li>
	<li>Presentación estándar SDS-PAGE para la muestra de proteína y una escala molecular, utilizando 20% gel de acrilamida. Migrar la muestra del gel a una tensión constante (160 V) hasta la migración delantera solo sale el gel.</li>
	<li>Imagen del gel para identificar la ubicación de las bandas de proteínas (figura 3).</li>
	<li>Cortar las porciones de gel incluyendo fracciones de la proteína de interés usando una cuchilla afilada, basada en la ubicación de la banda. Fraccionamiento en picos de 16, 23, 55 y 120 kDa y en kDa 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97-136 y 136 – 226 regiones se muestran en la figura 3.</li>
	<li>Extraer las proteínas utilizando un dializador por electroelución con un tamaño de poro de 6 a 8 kDa, siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: La muestra extraída puede almacenarse a-80 ° C durante varias semanas.</li>
</ol>4. preparación de cubreobjetos microscopio
<ol><li>Preparar 200 μL de tampón de avidina (5 mM HEPES-NaOH pH 7.2, 10 avidina ng/mL y 2 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA)) para cada muestra.</li>
	<li>Preparar el cubreobjetos de 22 x 22 mm y 0.15 mm de espesor. Exponga el cubreobjetos para aire plasma usando un plasma cleaner durante 1 min para limpiar y activar sus superficies.</li>
	<li>Cubrir el cubreobjetos con avidina por spin-coating 200 μL de tampón de avidina mediante un recubridor de centrifugado durante 5 segundos a 500 rpm, seguido por 30 segundos a 1.000 rpm. Incubar el cubre-objetos durante 15 min a temperatura ambiente para que deje que se seque.</li>
	<li>Preparar el cubreobjetos de la muestra de proteína.<ol>
<li>Diluir la muestra de proteína (de 3,5) 100 veces en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.</li>
		<li>Coloque 100 μL de la muestra diluida en la superficie en el centro del cubreobjetos recubierto de avidina (desde el paso 4.3).</li>
		<li>Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el control positivo.<ol>
<li>Coloque 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 en el centro de la avidina revestido cubreobjetos (desde el paso 4.3).</li>
		<li>Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Nota: Este control positivo cubreobjetos proporciona la densidad de avidina puntos de enlace, que se utiliza para calcular la LO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el control negativo.<ol>
<li>Spin-capa el plasma había limpiado cubreobjetos con 200 μL de 5 mM HEPES-NaOH y 2 mg/mL BSA (sin avidina).</li>
		<li>Incubar durante 15 min a temperatura ambiente para que seque.</li>
		<li>Añada 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.</li>
		<li>Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Nota: Este control negativo cubreobjetos proporciona la cantidad de fijación no específica de cubreobjetos sin avidina biotina fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague cada cubreobjetos con 200 μL de agua destilada por pipeteo en los bordes del cubreobjetos para que no se toque el centro del cubreobjetos con la punta. Repita este lavado tres veces. Nota: Después de aspirar el agua sobre el cubreobjetos, agua debe inmediatamente colocarse en el cubreobjetos para evitar que se seque completamente.</li>
	<li>Exponga el aire plasma el mismo número de cubreobjetos como en el paso 4.2.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos limpio sobre el cubreobjetos muestra limite de paso 4,7 para evitar que se sequen.</li>
</ol>5. observación con microscopía de fluorescencia de una molécula
<ol><li>Puesta en marcha de un microscopio de fluorescencia de campo de campo amplio o evanescente. PRECAUCIÓN: Directa o radiación dispersa de láser puede causar ojo o daño de la piel. Utilice gafas protectoras adecuadas y el escudo de la trayectoria de la luz láser. Nota: Para la configuración del microscopio, por favor consulte nuestra anterior publicación16. Brevemente, un microscopio de fluorescencia de campo amplio o evanescente campo equipado con una alta potencia 488 nm láser la excitación, un alta abertura numérica del objetivo y una cámara de alta sensibilidad se puede utilizar para esta medida. Además, para una medición automatizada, una etapa controlada por ordenador XY muestra traslacional, persianas mecánicas para excitaciones láser y un sistema de enfoque automático se recomiendan para ser instalado.</li>
	<li>El cubreobjetos en el microscopio y encontrar el foco.</li>
	<li>Realizar un análisis del azulejo para obtener imágenes por lo menos 100. Nota: La iluminación de láser debe controlarse con obturadores mecánicos expuestos a la muestra sólo cuando la grabación de imágenes con la cámara, para minimizar el fotoblanqueo. Si hay muchas muestras, se recomienda medición automatizada mediante un programa informático para el control de los dispositivos de microscopio. Cada imagen incluye típicamente 100-500 puntos de molécula única cuando se utiliza una lente de objetivo de 60 x.</li>
</ol>6. Análisis y extracción de información de la imagen
<ol><li>Si la imagen tiene desnivel debido al patrón de iluminación láser, realizar procesamiento de imágenes para corregirla18.<ol>
<li>Adquirir una imagen de referencia midiendo con una muestra de cubreobjetos de tintes de propagación uniformemente usando una cámara de configuración de la misma como en el paso 5.3.</li>
		<li>Adquirir una imagen compensada midiendo con ninguna excitación láser, usando la misma configuración de cámara.</li>
		<li>Restar a cada valor de píxel en cada imagen de muestra y la imagen de referencia con el valor de la imagen compensada.</li>
		<li>Dividir cada valor de píxel en las imágenes de la muestra resta el valor de la imagen de referencia resta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger imágenes debidamente adquiridos y quitar el fondo de la imagen.<ol>
<li>Eliminar imágenes que contienen grandes fluorescentes agregados manualmente.</li>
		<li>Quitar el fondo de la imagen mediante la aplicación de la balanceo-bola algoritmo19 con un radio de bola de 50 píxeles con ImageJ20.</li>
		<li>Enfocar imágenes por sustracción de imágenes borrosas con ImageJ (enfocar la función de la imagen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encontrar y analizar puntos de molécula única en imágenes.<ol>
<li>Identificar puntos de molécula única con el Yen umbral algoritmo21 con ImageJ.</li>
		<li>Filtro de puntos con menos de dos píxeles para excluir oscuro ruido de la cámara y puntos de más de 20 píxeles para excluir los agregados de proteínas mediante ImageJ (Gerente de ROI).</li>
		<li>Contar el número de puntos en cada imagen. Usando la imágenes corregidas (paso 6.1.4), analizar la iluminación total de intensidades dentro de píxeles para cada punto con ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular la capacidad de etiquetado (LO) usando la siguiente fórmula: LO = (número de cuentas de la muestra / número de cuentas en el control positivo) x 100</li>
	<li>Calcular el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄tinte).<ol>
<li>Análisis de un histograma de las intensidades de cada lugar. Nota: El histograma generalmente tiene varios picos, y cada pico representa un número diferente de moléculas de colorante, unida a una proteína. El primero, segundo y tercer pico en el histograma corresponde a las moléculas 1, 2 y 3, respectivamente.</li>
		<li>Calcular la intensidad media de histograma. Calcular también la intensidad de pico del primer pico aplicando un ajuste gaussiano.</li>
		<li>Calcular n̄tinte dividiendo la intensidad media con la intensidad de pico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran la interest(s) financiera competencia siguientes: RIKEN ha presentado una solicitud de patente sobre estos resultados con S.L. y Y.T. nombrado como inventores Co.

Este papel describe un protocolo para cuantificar la homogeneidad Etiquetadora de cada especie de etiquetado de proteínas en las células después de la separación con SDS-PAGE (paso 3). El método de separación puede ser sustituido con otros métodos como la cromatografía líquida o electroforesis capilar, que permiten la separación y fraccionamiento de proteínas celulares con alta resolución, mientras que requieren equipo especial23. El método de etiquetado con NHS-ester en el protocolo actual puede ...

Análisis del proteoma, que tiene como objetivo cuantificar el conjunto de moléculas de la proteína expresada en la célula, es un enfoque valioso en estudios biológicos y medicamentos actuales. Este análisis se basa comúnmente en espectrometría de masa, que identifica especies de proteínas basadas en espectros generados a través de proteínas ionización1,2,3. Un método alternativo para el análisis del proteoma es la electroforesis, incluyendo electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE) y electroforesis capilar, electroforesis en dos dimensiones (2D). Este método se basa en etiquetado fluorescente no específicos de todas las moléculas de proteína en las células analizadas, seguidas por separación electroforética y la detección y cuantificación de cada especie de proteína. Para lograr el etiquetado requiere proteína no específica, una estrategia es utilizar tintes fluorescentes que pueden unirse a proteínas a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, tales como azul de Coomassie y Sypro Ruby4,5,6 . Una estrategia alternativa es usar etiquetado covalente con tintes que contengan éster N-hydroxysuccinimide (NHS) o maleimida, que puede unirse covalentemente a proteínas a través de residuos comunes tales como aminas primarias y tioles, respectivamente7, 8.
Mientras tanto, la sensibilidad de detección de fluorescencia es ideal para el análisis de proteínas de baja abundancia y al pequeño número de células. Imágenes de fluorescencia de una molécula es uno de los métodos más sensibles que permite la detección de tintes fluorescentes individuales y etiquetadas proteínas en vitro y en vivo9,10,11,12, 13,14,15. Se espera que la aplicación de este método de imagen para el análisis del proteoma basado en electroforesis permiten análisis altamente sensibles y cuantitativos por contar proteínas individuales marcada con fluorescencia. Sin embargo, no queda claro si etiquetado con tintes fluorescentes es bastante homogéneo en todas las moléculas de proteína, y cómo esta homogeneidad es afectada por especies diferentes de proteínas (figura 1). Simples medidas de solución a granel pueden utilizarse para obtener un cociente molar de tintes fluorescentes para proteínas llamadas 'eficiencia de acoplamiento'8 o 'etiquetado eficiencia', pero esta propiedad no proporciona información sobre la homogeneidad de las etiquetas entre moléculas de la proteína.
Aquí, describimos el protocolo de un ensayo investigar la homogeneidad Etiquetadora para todas las especies de proteínas en la célula (figura 2)16. Los dos pasos claves de este ensayo son la proyección de imagen y purificación de proteínas. En el primer paso, todas las proteínas en las células llevan la etiqueta fluorescente y biotinilado, luego extraída por separado mediante electroforesis en gel seguido por electroelución. En el segundo paso, propiedades de fluorescencia de las moléculas individuales de proteínas en las muestras extraídas son evaluadas en base a proyección de imagen de molécula única. De estos datos, parámetros importantes para el análisis de la cuenta, tales como el porcentaje de proteínas etiquetados con uno menos tinte, que llamamos etiquetado ocupación (LO)16, y el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄ tinte), se puede caracterizar. En el protocolo, un procedimiento optimizado para el etiquetado el proteoma de células HeLa con tinte de Cianina 3 (Cy3) basado en éster NHS se presenta como un ejemplo y puede modificarse con otros procedimientos de etiquetado según objetivos de investigación deseada.

<table><tbody><tr><td>cubreobjetos de 22x22x0,15 mm</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>Láser de argón de 488 nm</td> Espejo dicroico <td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 nm</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisiones de 488 nm</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>Filtro dicroico de 560 nm</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>de emisiones de 560 nmSemrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>Láser de fibra de 560 nm</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>Lente de inmersión en aceite de 60x</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-amina</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Biotinilada Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borato</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-Tinte de éster</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dializador&nbsp; - Tubo en D, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td> Cámara EMCCD <td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Visor de gel</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de penicilina, estreptomicina y anfoterecina</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako NC0792960</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna de purificación de tamaño 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteomas celulares se caracterizan a menudo usando análisis de electroforesis, donde todas las especies de proteínas en las células no específicamente están marcadas con un colorante fluorescente y son vistas por un fotodetector tras su separación. Imágenes de fluorescencia de una molécula pueden proporcionar detección ultrasensible de la proteína con su capacidad para la visualización de las moléculas fluorescentes individuales. Sin embargo, la aplicación de este método de proyección de imagen de gran alcance para ensayos de electroforesis es obstaculizada por la falta de formas de caracterizar la homogeneidad de las etiquetas fluorescentes de cada especie de proteína en el proteoma. Aquí, se desarrolló un método para evaluar la homogeneidad de etiquetado en el proteoma basado en un análisis de imágenes de fluorescencia de sola molécula. En nuestra medición en una muestra de células HeLa, la proporción de proteínas con al menos un tinte, que denomina 'etiquetado ocupación' (LO), se determinó al rango del 50% al 90%, apoyando el potencial de la aplicación de la proyección de imagen de una molécula a Análisis del proteoma sensible y precisa.

Figura 4 representa los datos de imagen raw para las fracciones de diferente peso molecular de proteínas de célula HeLa lisada, así como el control positivo y negativo. Mientras que la muestra de proteína y positivo controlan de exhibición de 100 – 500 puntos por imagen, el control negativo muestra ninguno o pocos puntos, demostrando que el protocolo lo suficientemente inhibe la fijación no específica de los tintes a la superficie del cubreobjetos. Intensidad...

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Este método demuestra la calibración de la cantidad de proteína cuantificadora en muestra líquida con proceso de una sola molécula para el recuento. Específicamente, puede ilustrar cómo las poblaciones de proteínas se pueden etiquetar fluorescentemente en cada nivel de molécula. Los métodos anteriores realizaron mediciones a granel para analizar las proporciones molares de moléculas fluorescentes y de proteínas, pero no pueden revelar cómo las poblaciones de proteínas heterogéneamente están realmente etiquetadas.Nuestros métodos pueden hacerlo directamente a nivel de una sola molécula. Nuestro método puede extenderse hacia ensayos de concentración molecular ultrasensibles y avanzados, lo que conducirá a futuros métodos de diagnóstico, permitiendo hallazgos eficientes de moléculas patógenas en muestras. Nuestro método se puede aplicar al análisis de especies de una sola proteína utilizando anticuerpos fluorescentes, así como a múltiples análisis de especies utilizando etiquetas no específicas para todas las proteínas separadas por electroforesis o cromatografía.El punto más crítico de la técnica es obtener reproducibilidad de datos. Recomiendo mantener la misma condición experimental tanto como sea posible al medir varias muestras. La demostración visual de esta técnica proporcionará cómo hacer que cada paso experimental sea estable y reproducible.También mostrará algunos pasos poco comunes en los protocolos de bioquímica, como el recubrimiento de espín y el lavado de cubreobjetos de microscopio. Para comenzar este procedimiento, prepare el búfer de lising y el 1%Tween-20 como se describe en el protocolo de texto. Utilice hidróxido de sodio para ajustar el pH a 12.Mezclar 100 microlitros de tampón de celo con un microlitro de un DDT molar y cuatro microlitros de 50%CHAPS. Agregue un microlitros del cultivo celular preparado y homogeneice la solución pipeteando lentamente para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante cinco minutos con agitación suave.A continuación, vuelva a homogeneizar la solución pipeteándola lentamente hacia arriba y hacia abajo. Agregue un microgramo de tinte éster Cy3 NHS y homogeneice la solución ralentizando el pipeteo para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave.Repita este proceso, añadiendo la misma cantidad de tinte e incubando la muestra una vez. Añadir 100 microlitros de 0,8 molares de hidróxido de sodio HEPES para ajustar el pH de la solución a 7.2 y apagar la reacción. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución.A continuación, agregue 20 microlitros de Biotina-2-amina y cinco microlitros de EDC. Homogeneizar la solución pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave.Después de esto, utilice una columna de ultrafiltración con un límite de 10 kiloDalton para eliminar cualquier reactivo de etiquetado no reaccionado y concentrar la muestra. Después de realizar SDS-PAGE estándar para la muestra de proteína y una escalera molecular, imagine el gel para identificar la ubicación de las bandas de proteínas. Usa una cuchilla afilada para cortar las porciones de gel que incluyen fracciones proteicas de interés basadas en la ubicación de las bandas.En primer lugar, establecer los cubreobjetos que son 22 milímetros por 22 milímetros y son 0.15 milímetros de espesor. Utilice un limpiador de plasma para exponer los cubreobjetos al plasma de aire durante un minuto para limpiar y activar sus superficies. A continuación, utilice una recubridora de centrifugado para hilar la capa de los cubreobjetos con 200 microlitros de tampón de avadina durante cinco segundos a 500 RPM, seguido de 30 segundos a 1000 RPM.Incubar los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos para dejar que se sequen al aire. Para preparar los cubreobjetos para la muestra de proteína, utilice una muestra de proteína que se haya diluido. Coloque 100 microlitros de la muestra diluida en el centro de los cubreobjetos recubiertos de avadina.Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Para preparar el control positivo, coloque 100 microlitros de biotina fluorescente purificada en cinco micromolares HIDróxido de sodio HEPES a pH 7.2 en el centro de un cubreobjeto recubierto de avadina. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.Para preparar el control negativo, espínesa cubre los cubreobjetos de plasma con 200 microlitros de cinco hidróxido de sodio HEPES con dos miligramos por mililitro de BSA sin avadina. Añadir 100 microlitros a la biotina fluorescente purificada en cinco micromolares HEPES-hidróxido de sodio a pH 7.2. Incubar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente.Después de esto, enjuague cada cubreobjetos con 200 microlitros de agua destilada pipeteando en los bordes, asegurándose de no tocar el centro del cubreobjetos con la punta de la pipeta. Repita este lavado tres veces. Luego, exponga un número igual de cubreobjetos nuevos al plasma de aire durante un minuto.Coloque un cubreobjetos limpio encima de cada cubreobjetos ligado a la muestra para evitar el secado. Poner en marcha un microscopio de fluorescencia de campo ancho o evanescente. Ponga un cubreobjetos en el microscopio y encuentre el foco.A continuación, realice un análisis de mosaico para obtener al menos 100 imágenes. En este estudio, la homogeneidad de etiquetado de cada especie de proteína etiquetada en las células se cuantifica después de la separación con SDS-PAGE. Los datos de imagen bruta para diferentes fracciones de peso molecular de proteínas del lysate celular de HeLa, así como los controles positivos y negativos, se ven aquí.Mientras que tanto la muestra de proteína como el control positivo exhiben entre 100 y 500 puntos por imagen, el control negativo exhibe muy pocos o ninguno. Esto demuestra que el proceso inhibe suficientemente la unión no específica de los tintes a la superficie del cubreobjetos. Los histogramas de intensidad puntual de las muestras de proteínas y el control positivo presentan múltiples picos, que representan la unión estocástica de los tintes a las aminas primarias en proteínas y estructuras de tetraméricos de avadina respectivamente.Todas las manchas mostraron parpadeo y fotoblancada escalonada con excitación láser continua, resaltando la observación a nivel de molécula única. La ocupación del etiquetado, o LO, se calcula a continuación a partir de la relación entre el número de puntos de cada muestra de proteína y el del control positivo. La LO medida a partir de la muestra de izado celular de HeLa oscila entre el 50% para la fracción de peso molecular más pequeño, hasta el 90% para la fracción de peso molecular más alto.La LO para toda la muestra de proteome sin separación se considera 72%Es fundamental utilizar reactivos recién hechos y evitar cualquier polvo, especialmente durante la preparación de los cubreobjetos. Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de recuento de moléculas individuales en un determinado volumen para cuantificar las concentraciones de cada proteína. Por ejemplo, se puede realizar un análisis de cualquier producto crudo, o productos de electroforesis de gel y capilar.Esta técnica allana el camino para utilizar imágenes de fluorescencia de molécula única a medicina molecular, química orgánica y análisis omics. Al salvar el concepto entre la concentración y los números. El hidróxido de sodio concentrado es corrosivo, y se debe usar una protección adecuada al manipularlo.Además, la radiación láser de alta potencia puede causar daño ocular, por lo que se pueden usar gafas protectoras.

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.

Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Presentamos un protocolo de etiquetado optimizado de etiquetas de masa en tándem (TMT) que incluye información detallada para cada uno de los siguientes pasos: extracción de proteínas, cuantificación, precipitación, digestión, etiquetado, envío a una instalación proteómica y análisis de datos.

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Aquí, describimos un flujo de trabajo de proteómica para la caracterización del proteoma de la superficie celular de varios tipos de células. Este flujo de trabajo incluye el enriquecimiento de proteínas en la superficie celular, la posterior preparación de muestras, el análisis mediante una plataforma LC-MS/MS y el procesamiento de datos con software especializado.

Flujo de trabajo "Cell Surface Capture" para la cuantificación sin etiquetas del proteoma de la superficie celular

Aprende a cuantificar proteínas a nivel de molécula única mediante etiquetado fluorescente y electroforesis. Este método revela la heterogeneidad de marcado invisible en análisis masivos y abre vías para diagnósticos ultrasensibles de moléculas patógenas.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Explorar más videos