Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la entrega de siRNA intranasal al sistema nervioso central
15 de agosto de 2019
Aquí, presentamos un protocolo utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón que permite la colocación adecuada de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro que permite un silenciamiento eficaz del gen en el sistema nervioso central.
Este protocolo detalla el uso de un dispositivo de posicionamiento para la entrega intranasal de biomoléculas al CNS del ratón. El uso de este dispositivo reduce significativamente el manejo de ratones y el tiempo de tratamiento, lo que resulta en una mayor eficiencia y reproducibilidad de la técnica. Para comenzar este procedimiento, evalúe el nivel de anestesia de los ratones por reflejo de pedal con el fin de mantener el plano quirúrgico.
A continuación, coloque el dispositivo de posicionamiento a una distancia y altura adecuadas para permitir un acceso conveniente a todos los reactivos necesarios. Luego, aplica un pomada en los ojos del animal. Correa de un ratón con cinturones de silla, asegurándose de que las extremidades delanteras del ratón proporcionan apoyo natural mientras está en una posición relajada sin ninguna molestia.
Repita los procedimientos para los ratones restantes. Coloque suavemente cada ratón en la silla designada colocando su parte posterior paralela al soporte de la silla y a 90 grados hasta el asiento de la silla. Deje que el animal se acueste naturalmente en la cabeza hacia abajo y hacia adelante sin empujar o presionar.
Una vez que todos los ratones están atados, comience inmediatamente la inoculación intranasal. Para realizar la entrega intranasal, cargue la micropipeta con dos microlitros de solución compleja de SIRNA RVG9R. Sostenga la pipeta en la mano dominante y sosténjes con la otra mano para evitar movimientos incontrolados mientras se administra el ARSNr.
Coloque alrededor de una gota de dos microlitros muy cerca de una fosa nasal para que el ratón pueda inhalarla directamente. Si no se forma fácilmente una pequeña gota, sustituya la punta de la pipeta por una nueva y repita la operación. Empuje suavemente la cabeza del ratón hacia abajo con el dedo índice durante cinco segundos mientras está inhalando y manteniendo la posición.
Para evitar el drenaje de la droga en los pulmones es importante empujar con sed la cabeza del ratón hacia abajo con el dedo índice durante cinco segundos mientras el ratón está inhalando. Comience un cronómetro para cronometr de tres a cuatro minutos después de esto para cronocular la inoculación en la segunda nare del primer ratón. Este intervalo de tiempo es necesario para que el ratón complete la inhalación de la primera dosis y restaure la respiración normal.
En el intervalo de tres a cuatro minutos entre la inoculación de narinas alternativas en el primer ratón, inoculación intranasal completa de una nare en cada uno de los tres ratones restantes colocados en el dispositivo. Cuando suene el cronómetro, inocular la segunda fosa nasal en el primer ratón y repetir el procedimiento para los otros ratones como arriba. Repita el procedimiento hasta que se administren los 20 a 30 microlitros para los cuatro ratones.
Tardará entre 30 y 45 minutos en completar todo el procedimiento de inoculación. Devolver a los animales a sus jaulas designadas. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal.
Para evaluar el silenciamiento de genes, extraiga el ARN de varias regiones cerebrales con un kit de purificación de ARN, revierta la transcripción en ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc y realice qPCR con pares de imprimación. La mayor parte de la entrega cerebral del péptido RVG9R etiquetado con Alexa Fluor 488 se probó por primera vez mediante el uso del dispositivo de posicionamiento del ratón descrito aquí. A las 48 horas después de la inoculación, varios órganos fueron extirpados para medir la fluorescencia A488.
No se detectó nada en ninguno de los órganos de los controles negativos. Por otro lado, una fuerte señal fluorescente A488 fue detectada exclusivamente en los cerebros del grupo inoculado RVG9R. Además, la posición de colocación del ratón se comparó con el método de posición supina y el método despierto para la eficacia.
Los resultados indicaron que la colocación de los ratones cabeza hacia abajo y hacia adelante mejoró la penetración y la deposición de RVG9R A488 en todo el tejido cerebral. Para confirmar aún más la administración de siRNA al cerebro, se realizó una exploración cerebral completa después de una sola administración intranasal de RVG9R complejada a SiRNA etiquetada cy5. A diferencia de PBS o RVM9R, complejo con RVG9R resultó en una fuerte acumulación de ar ARNs en las principales regiones cerebrales, incluyendo la bombilla olfativa, la corteza, el hipocampo, el tálamo, el hipotálamo, el cerebro medio y el cerebelo.
El dispositivo de posicionamiento se puede utilizar para la entrega de fármacos o moléculas al SNC del ratón. Las aplicaciones se extienden a las pruebas de terapia, así como al examen de los mecanismos celulares en el SNC. Este dispositivo de posicionamiento ha sido utilizado por los investigadores para demostrar la potencia de los siRNAs en el tratamiento de la enfermedad por el virus del Nilo Occidental, así como para explorar terapias para otras enfermedades del SNC.
Descripción general
Este protocolo describe el uso de un dispositivo de posicionamiento de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro, facilitando el silenciamiento génico eficaz en el sistema nervioso central. El método mejora la eficiencia y la reproducibilidad, al tiempo que minimiza el manejo del ratón.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Terapia génica
- Entrega biomolecular
Antecedentes
- La administración intranasal es una vía prometedora para terapias dirigidas al sistema nervioso central.
- Las técnicas eficientes de administración son cruciales para obtener resultados reproducibles.
- La posición del ratón puede afectar la eficacia de la administración del fármaco.
- La silenciación génica mediante siRNA es una herramienta valiosa en la investigación en neurociencia.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo para la administración intranasal eficaz de ARNip al SNC del ratón.
- Evaluar el impacto de la posición del ratón en la eficiencia de la administración del fármaco.
- Mostrar la utilidad del dispositivo de posicionamiento en aplicaciones de terapia génica.
Métodos Utilizados
- Evaluación de los niveles de anestesia en ratones antes de la colocación.
- Uso de un dispositivo de posicionamiento para sujetar a los ratones en una posición relajada.
- Inoculación intranasal de la solución del complejo de ARNip.
- Extracción de ARN y qPCR para evaluar la eficacia del silenciamiento génico.
Resultados principales
- Se observó silenciamiento génico significativo en regiones cerebrales tras la inoculación.
- Entrega mejorada de ARNip mediante el dispositivo de posicionamiento en comparación con otros métodos.
- Se detectó una fuerte fluorescencia en los cerebros de los ratones tratados, lo que indica una entrega exitosa.
- El posicionamiento con la cabeza hacia abajo mejoró la penetrancia y la deposición de la formulación de ARNip.
Conclusiones
- El dispositivo de posicionamiento del ratón es eficaz para la administración de fármacos en el sistema nervioso central.
- Este método puede aplicarse en diversos contextos terapéuticos e investigativos.
- Estudios futuros pueden explorar su uso en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva en la Industria
La administración intranasal eficiente de terapéuticas dirigidas al SNC sigue siendo un cuello de botella crítico en el desarrollo preclínico de la neurociencia y la terapia génica. Este dispositivo de posicionamiento permite la administración estandarizada y de alto rendimiento de biomoléculas, como ARNip, péptidos o nanopartículas, al cerebro del ratón, mejorando la reproducibilidad y reduciendo la variabilidad en estudios de interacción con el blanco. Al mantener una posición consistente de la cabeza hacia abajo y hacia adelante, aumenta la confianza predictiva en la captación por el SNC y disminuye los riesgos en el avance traslacional de candidatos terapéuticos intranasales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación precisa de hipótesis terapéuticas al garantizar la administración reproducible de compuestos activos en el SNC, como los complejos RVG9R-siRNA.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad dependiente del operador en la dosificación, favoreciendo evaluaciones confiables del acoplamiento al blanco y de la modulación de vías.
- Confianza predictiva: Mejora la consistencia en los resultados de biomarcadores, como el silenciamiento génico o la reducción de proteínas, entre los grupos de tratamiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos estandarizados para análisis posteriores al garantizar una administración uniforme de compuestos al sistema nervioso central.
- Valor operativo: Facilita la reproducibilidad de los ensayos mediante una posición controlada del animal y una reducción del estrés por manipulación.
- Reutilización de la plataforma: Permite la evaluación de diversas modalidades, incluyendo siRNA, nanopartículas y anticuerpos, para la administración al sistema nervioso central.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al permitir una administración consistente a regiones cerebrales clave implicadas en modelos de neurodegeneración o infección viral.
- Valor operativo: Permite la evaluación rápida de candidatos terapéuticos mediante el procesamiento paralelo de hasta ocho ratones por sesión.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar/descartar un fármaco al aumentar la confianza en los datos de exposición al sistema nervioso central y modulación del blanco.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El dispositivo se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la optimización del fármaco líder, apoyando evaluaciones confiables de la administración al SNC antes de los estudios habilitantes para el IND.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir la administración consistente de siRNA o terapéuticos peptídicos para validar la modulación del blanco in vivo.
- Selección: Mejora la disponibilidad y reproducibilidad del ensayo al estandarizar la posición del animal durante la administración intranasal de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de la captación en el SNC mediante lecturas de fluorescencia, qPCR o biomarcadores entre grupos de tratamiento.
- Investigación Translacional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica al mejorar la fiabilidad de las métricas de administración al SNC utilizadas en estudios de determinación de dosis y eficacia.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para evaluar múltiples modalidades dirigidas al SNC en diversos proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la entrega al SNC y la interacción con el blanco al reducir la variabilidad del procedimiento.
- Valor operativo: Mejora el rendimiento y la estandarización, reduciendo el tiempo de manipulación y la dependencia del técnico.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance/no avance al mejorar la calidad de los datos y reducir los falsos negativos en los ensayos de entrega al SNC.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos intranasales basada en datos reproducibles de absorción en el SNC.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en la evaluación de anestesia y sujeción adecuada del animal para garantizar comodidad y posicionamiento correcto.
- Depende del acceso a equipos para administración intranasal, como micropipetas y puntas estériles, para lograr una formación consistente de gotas.
- Necesita estandarización entre los equipos para asegurar un posicionamiento uniforme con la cabeza hacia abajo y hacia adelante, así como un tiempo constante entre las inoculaciones nasales.
- Debe adaptarse para diferentes cepas o tamaños de ratones utilizando ajustes en la altura y la inclinación de la silla.
- Se limita a procedimientos que requieren administración intranasal precisa; no es adecuado para vías de administración intravenosa ni oral.
