Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

En la naturaleza, Cas9 es una proteína inmune contra los virus invasores que la evolución prefiere Cas9 con especificidad promiscua que puede cortar el ADN viral con mutaciones espontáneas. Construimos un sistema de evolución artificial dirigida que prefiere una variante Cas9 optimizada con alta especificidad. Tanto las selecciones negativas como las positivas funcionan simultáneamente en el sistema de detección de francotiradores.

Las variantes Cas9 con actividad reducida fuera del objetivo también mantienen la actividad en el objetivo se pueden examinar a la vez. Se introdujeron mutaciones en toda la secuencia Cas9 aleatoriamente para producir la biblioteca a examinar. Y esto hizo posible encontrar mutaciones en posiciones inesperadas.

Actualmente, muchos investigadores de la academia y la industria están utilizando Cas9 de tipo Y para desarrollos terapéuticos. Sin embargo, la especificidad del tipo Y Cas9 no está optimizada, lo que puede resultar en un embalado apretado. En los seres humanos, esto significa mutaciones inesperadas en genes aleatorios, que pueden conducir a efectos secundarios graves.

Hay muchas enzimas como Cas9 que se están desarrollando en terapias. Nuestra técnica se puede utilizar para mejorar la especificidad de otros ADN y nucleidos como Jipinger, Tailandia, y Cas9 también como CPF1. Hacer una biblioteca lo suficientemente grande es la clave para aumentar las posibilidades de obtener una variante con una función importante.

Asegúrese de obtener una alta eficiencia en el paso de enfriamiento, y utilizar células competentes altamente eficientes. Para comenzar este procedimiento, agregue un nanograma tanto del plásmido CCDB como del plásmido SGRNA con dobles desajustes en cincuenta microlitros de células GOI BW25141 descongeladas. Mezcle suavemente las células en pipeteando y transfieralas a una cubeta de electroporación pre-enfriada de 0,1 centímetros.

Transforma el E-coli con los dos plásmidos mediante electroporación. Inmediatamente después de que se complete la electroporación, agregue 250 microlitros de medio SOC. Pipetear suavemente la solución para mezclar las células y el medio, y transferir la mezcla a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Recupera las células transformadas e incubarlas a 32 grados Celsius, con suave agitación durante una hora. Continúe preparando las celdas de detección de Snyper como se describe en el protocolo de texto. Cuando esté listo para realizar el cribado de Snyper, transforme las células de cribado de Snyper con 100 nanogramos de los plásmidos variantes Cas9 preparados de cada biblioteca utilizando el proceso de elctroporación que se describió anteriormente.

Luego, transfiera 250 microlitros de las células a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros. Añadir 250 picogramos de ATC a una concentración final de 10 nanogramos por mililitro. Recuperar tanto las células que contienen ATC como las células libres de ATC incubando a 32 grados Celsius durante una hora con un suave temblor.

Placa 25 microlitros de las células libres de ATC recuperadas en una placa de agar LB, que contiene cloramphenicol y kanamicina. Añadir ATC a las células que contienen ATC recuperadas a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro en una placa de agar LB de 245 milímetros. Placa inmediatamente las células que contienen ATC en un agar LB que contiene placa que contiene cloramphenicol, kanamicina y arabinosa.

Incubar todas las placas durante la noche a 32 grados centígrados. Al día siguiente, fotografia los platos. Usando el software abierto CFU, cuente el número de colonias viables, asegurándose de que el número de colonias en la placa no selectiva es al menos diez veces mayor que la diversidad de la biblioteca, para cubrir todas las variantes.

Tire de las colonias que sobrevivieron en las placas selectivas de las tres bibliotecas. Transfiera estas colonias agrupadas a 250 mililitros de medio LB, complementados con cloramphenicol, e incubar durante la noche a 42 grados centígrados. En primer lugar, cargue el software de búsqueda Cas OF para seleccionar los sitios de destino.

Seleccione el tipo de PAM adecuado para el tipo específico de Cas9 y el genoma objetivo. Rellene la pestaña de secuencias de consulta. Elija el número de discordancia y haga clic en el botón Enviar.

Después de unos segundos, aparecerán los sitios dentro y fuera del destino. En general, elija los sitios fuera de destino con una o tres discrepancias. A continuación, ordene el CRRNA y los oligos de RRNA de pista con secuencias de plantilla y amplíe la plantilla como se describe en el protocolo de texto.

Analizar dos microlitros del ADN de la plantilla amplificada, en un gel de 2% agarosa y luego purificar la plantilla. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, agregue 0,5 microlitros de DNAse e incubar a 37 grados centígrados durante 15 a 30 minutos, y luego purifique el SGRNA.

A continuación, tratar 10 microgramos del ARN transcrito in vitro con 250 unidades de fosfatasa alcalina intestinal del ternero durante tres horas a 3 grados centígrados, en presencia de 100 unidades de inhibidor de la ANS, y luego purificar el SGRNA tratado. En primer lugar, mantener células T HEK293 en DMEM complementadas con 10%FBS y 1%antibióticos a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono. A continuación, mezclar dos microgramos de tipo salvaje o proteína Snyper Cas9 con dos microgramos de SGRNA, e incubar a temperatura ambiente durante diez minutos para hacer complejos RNP.

Pruebe y cuente las células, luego lávelas y prepárelas en el búfer de electroporación como se describe en el protocolo de texto. Electroporar los complejos RNP en las células usando un pulso de 1300 voltios durante 30 milisegundos. Inmediatamente después de la electroporación, placa las células en una placa de 48 pozos llena de 500 microlitros de DMEM, complementado con 10%FBS y 1%antibióticos.

Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Mantener las células T HEK293 en DMEM complementadas con 10%FBS y 1%antibióticos a 37 grados Celsius con 5%dióxido de carbono. El día antes de la transfección, tripsinizar y contar las células.

Si trabaja a una escala de 48 pozos, placa 10.000 células por pozo y 250 microlitros de medio de crecimiento completo. Con un reactivo de transfección a base de lípidos, prepare 250 nanogramos de plásmido P3S Cas9 y 250 nanogramos de SGRNA para la transfección. A continuación, mezcle los plásmidos en 25 microlitros de MEM sin suero.

Diluir un microlitro de reactivo de transfección con 25 microlitros de MEM sin suero. Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Combinar la mezcla de plásmido con la mezcla de reactivo de transfección e incubar en la habitación durante 20 minutos para formar complejos de lipofectamina plásmida.

Después de esto, añadir 50 microlitros de esta mezcla directamente a cada célula que contiene el pozo. Mece suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás para mezclar. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante 48 a 72 horas después de la transfección, antes de sersaya para la expresión transgéneo.

Después de aislar el ADN genómico previamente preparado, genere bibliotecas de secuenciación profunda mediante la amplificación de PCR del GDNA con imprimaciones dirigidas dentro y fuera del objetivo. A continuación, utilice imprimaciones de índice para etiquetar cada muestra. Utilice una máquina de secuenciación de próxima generación para someter las bibliotecas de grupo a la secuenciación final emparejada.

Después de realizar la pantalla Snyper, el porcentaje de colonias de supervivencia se puede calcular dividiendo el número de colonias en la placa selectiva LB por el número de colonias en la placa LB no selectiva. Aunque este porcentaje suele ser muy bajo cuando se realiza con bibliotecas de SP Cas9, los verdaderos éxitos positivos se pueden enriquecer repitiendo la pantalla con el grupo superviviente. Una pantalla representativa de Snyper muestra que se obtiene una tasa de supervivencia del 100% después de la tercera pantalla.

Las transfeccións que utilizan RNP o el Snyper Cas9 codificado con plásmido se pueden hacer para varios objetivos, y las actividades resultantes dentro y fuera del objetivo medidas por la secuenciación de amplicon objetivos. A lo sumo los objetivos, Snyper Cas9 muestra el mismo nivel de las actividades objetivo y mayores proporciones de especificidad en comparación con el tipo de comodín. Los SGRNAs truncados también se pueden utilizar para mejorar aún más la especificidad.

Una mayor eficiencia de transformación en el primer paso de limpieza es muy importante para no perder los clones con alta especificidad. Los pasos de cribado posteriores se repiten con menos eficiencia de transformación, ya que los clones ya están enriquecidos en el primer paso de selección, y hay menos posibilidades de perderlos. Habrá más de un clon que encontramos en la pantalla de Snyper.

Las actividades en el destino y fuera del destino de estos clones deben caracterizarse en tantos destinos diferentes como sea posible para seleccionar clones con el mejor rendimiento. Con este método, los científicos pueden mejorar la especificidad de las enzimas similares a Cas9 sin pérdida de actividad en el objetivo. Además, los científicos no necesitan ningún conocimiento previo sobre la estructura de la proteína para realizar mejoras.