Name: Un modelo confiable y Reproducible tamaño crítico Femoral defecto segmentario en ratas estabilizado con un Fixator externo personalizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a crear defectos femorales segmentarios en ratas con fijador externo personalizado para estudiar mecanismos de regeneración ósea y terapias ortopédicas. Este protocolo reproducible facilita investigaciones longitudinalmente.

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Este trabajo fue apoyado por un equipo de NIH Grant 1S10OD023676-01 con apoyo adicional a través de la Universidad de Wisconsin departamentos de Ortopedia y rehabilitación y escuela de medicina y salud pública. Queremos reconocer la UW Carbone cáncer centro apoyo beca P30 CA014520 y uso de su pequeña facilidad la proyección de imagen del Animal, así como la beca de formación de NIH 5T35OD011078-08 apoyo de H. Martin. También agradecemos a Michael y Mary Sue Shannon por su apoyo de la Asociación de regeneración musculoesquelética.

Las ratas utilizadas en este estudio recibieron el cuidado diario de acuerdo con las pautas de AVMA para la eutanasia de animales: 2013 edición16. El cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Universidad de Wisconsin-Madison evaluaron y aprobaron este protocolo experimental antes de que comenzara el proyecto.
1. los animales
<ol><li>Utilice las exogámica ratas macho Sprague-Dawley con aproximadamente 350 g de peso.</li>
</ol>2. preparación de hueso Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2) empapado esponja andamios
Nota: Preparación del andamio debe ocurrir justo antes de la implantación en el fémur (véase paso 6.14).
<ol><li>Siga las instrucciones del fabricante para el uso de un kit de injerto de hueso de rhBMP-2 establecido que contiene una esponja de colágeno liofilizado rhBMP-2 y agua estéril para reconstitución17. Mantenimiento de la esterilidad, reconstituir la rhBMP-2 con el agua estéril a una concentración de 1.5 mg/mL.</li>
	<li>Utilizando unas tijeras estériles y una regla estéril, recortar la esponja de colágeno empapadas de rhBMP-2 para remodelar a un 5 x 3 mm x defecto mm 3.</li>
	<li>Utilizando una jeringa, distribuya la solución rhBMP-2 en la esponja de colágeno por lo que se absorbe.</li>
</ol>3. preparación del dispositivo de fijación externa personalizada
Nota: Ver figura 1A para la lista más completa de dimensiones.
<ol><li>Corte aluminio stock de hoja (tipo 6061, 0,088" grueso) a dos piezas (1,4" x 6") utilizando una sierra de calar u otra herramienta apropiada.</li>
	<li>Montar una pieza en la fresadora y, con un 1/8" 90°-punto carburo taladro Molino, corte cuatro surcos de 'V' (0.035" profundo) a lo largo. Dejar la pieza libre de cortes.</li>
	<li>Cortar las placas individuales de 0.3" ancho de las dos piezas (figura 1B). Mida y perfore agujeros para rosca 4-40. Toque la placa con ranuras de 'V' con el hilo de rosca 4-40. Perfore la placa sin ranuras para un taladro de cuerpo tornillo #4.</li>
	<li>Arena de ambas piezas para redondear esquinas y reducir el peso (figura 1).</li>
	<li>Atornillar piezas junto con 4-40, 18-8 acero inoxidable botón tornillos de cabeza hueca (0,25") para que los surcos queden al ras contra la placa normal (figura 1)</li>
</ol>4. procedimiento anestesia y analgesia
<ol><li>Inducir la anestesia mediante la colocación de la rata en cámara de inducción, entrega de 4 L O2/min con 4% de isoflurano. Atención: Personal de investigación debe evitar la inhalación de gas anestésico y mantener campana adecuada y ventilación en el laboratorio.</li>
	<li>Quite la rata de la cámara después de la rata pierde righting reflex, coloque un cono de la nariz y ponga en la dosis de mantenimiento de la anestesia a través de la nariz (O2 caudal a 2-3 L/min y 0.8% isoflurano).</li>
	<li>Colocar la rata en la almohada o bajo la luz de calentamiento para prevenir la hipotermia.</li>
	<li>Prueba el reflejo palpebral o pellizque el dedo para confirmar la adecuada profundidad de la anestesia.</li>
	<li>Aplicar lubricación a los ojos para evitar la desecación de la córnea.</li>
	<li>Entregar una inyección subcutánea de la buprenorfina de liberación prolongada (1 mg/kg) en el tronco/dorso de la rata, lejos el sitio quirúrgico, para proporcionar analgesia durante 3 días después de la cirugía.</li>
</ol>5. asepsia preparación y antibióticos preventivos
<ol><li>Afeitar el área alrededor de hindleg usandode la 13 costilla, el pie, la línea media dorsal y la línea media ventral como márgenes.</li>
	<li>Zona de matorral afeitado utilizando gasa estéril de 2 x 2 con 10% de povidona-yodo seguida por 70% EtOH (4 veces cada uno, alternando).</li>
	<li>Administrar una inyección intramuscular de cefazolina (20 mg/kg) en el cuadriceps operativa.</li>
	<li>Administrar enrofloxacina (0.25 mg/ml) en agua de bebida durante 7 días postoperatoriamente para protección continua de antibióticos.</li>
	<li>Coloque las ratas en alimentos medicados (p. ej., Uniprim) para la duración del estudio para prevenir las infecciones de las vías de pin.</li>
	<li>Aplique ungüento antibiótico doble a la interfaz de la piel-pin una vez diariamente por 3 días postoperatoriamente. Nota: Evite cualquier pin de fijación externa o apretar aflojar que puede contribuir al desarrollo de una infección.</li>
</ol>6. quirúrgico
Nota: Hacer un concertado esfuerzo para mantener un campo estéril y espacio de trabajo y seguir una técnica aséptica a lo largo de la totalidad del caso.
<ol><li>Extender la pierna depilada a través de paño fenestrado, claro pegajoso y Banco quirúrgica cubierta en toallas estériles para crear un campo estéril.</li>
	<li>Palpe el fémur y use una hoja #15 para crear una incisión anterolateral a través de la piel que va desde la rótula hasta el trocánter mayor en el fémur proximal.</li>
	<li>Con cuidado haga una incisión en la fascia de la pierna lateral a lo largo del septo intermuscular para separar el músculo vasto lateral del cuadriceps anterior de los tendones de la corva posteriorly hasta que quede expuesto el fémur lateral. Preservar la inserción del tendón glúteo abductor en el trocánter mayor.</li>
	<li>Realizar una disección cuidadosa, de circunferencial de tejido blando atraumático y exponer el fémur en su diáfisis media a partir de la superficie lateral. Para ello, utilice una hoja #15 para cortar suavemente el músculo del hueso subyacente, manteniendo la cuchilla paralelo contra el contorno de la superficie del hueso. Utilice un elevador perióstico para levantar el músculo del hueso expuesto se diseca y continuar alrededor del eje femoral hasta 7-10 mm de diáfisis central ha desaparecido de los tejidos blandos en los lados para prepararse para la ostectomía. Nota: Evitar lesiones para el paquete neurovascular femoral medial.</li>
	<li>Inserte cuatro alambres de Kirschner (k) de 1,0 mm: 2 proximal y distal en el fémur perpendicular del fémur lateral, 2 dirigido recto lateral a medial. Asegurarse de que todos los pernos encajen ambas cortezas (bicortical) para una estabilidad adecuada (figura 2A).</li>
	<li>Comience con el perno distal más primero, a nivel del epicóndilo lateral. Plantilla de lugar ras de fémur distal lateral e inserte una punta roscada 1,0 k-wire.</li>
	<li>Manteniendo la posición de la plantilla en el hueso, identificar donde el pin más próximo entrará en el hueso en los agujeros de la plantilla base. Una vez determinada la posición, cuidadosamente haga una incisión paralela a las fibras del tendón del glúteo según sea necesario para crear un pequeño espacio en el tejido para el próximo pin paso minimizando daño yatrogénico al tendón. Perfore un 1,0 mm sin rosca k-alambre en esta brecha, asegurando otra vez que el pin compromete ambas corticales (figura 2B).</li>
	<li>Mantener la posición de la plantilla en contacto con el hueso y perfore dos 1.0 mm roscada k-alambres, uno a cada lado del sitio de defecto futuro. Asegurar el pasador ambas cortezas (figura 2).</li>
	<li>Colocar el fijador externo nivel 1 cm por encima de piel y atornillar firmemente, bloqueo de la barra en su lugar. Clip de las longitudes de perno exceso (Figura 2D).</li>
	<li>Preparar para la ostectomía (creación de defecto) mediante la colocación de un retractor pequeño, curvado alrededor del fémur anterior y posterior para proteger el tejido suave circundante, el músculo y el paquete neurovascular. Utilizando un oscilante sagital ~ 5 mm hoja de sierra, con mucha precaución crear un defecto segmentario de 5 mm a través de la diáfisis media. Aplique una luz, incluso la presión con la sierra para evitar fractura innecesaria (Figura 2E).</li>
	<li>Aplicar pequeñas cantidades de riego (temperatura 0,9% solución salina estéril normal (NS)) según sea necesario durante la creación de defecto para evitar la necrosis térmica del hueso.</li>
	<li>Lave la herida con 10 mL de NS después de crear el defecto.</li>
	<li>Administrar 0,1 mL de un bupivacaína 0.25% con epinefrina (1: 200, 000) a la herida como un analgésico y vasoconstrictor.</li>
	<li>Inserte el andamio (5 x 3 x 3 mm) de la esponja de colágeno o rhBMP-2 había empapado esponja (del paso 2) en el defecto. Cada andamio debe dimensionarse adecuadamente para abarcar la longitud y el volumen del defecto, ayudando a que la esponja permanece en posición. Nota: en este punto, complejos de mRNA pueden ser preparados e inyectados como se indica en pasos 7.1-7.3 abajo en caso de proyección de imagen de bioluminiscencia.</li>
	<li>Cierre del plano muscular utilizando el patrón interrumpido simple con sutura absorbible 4-0. Cerrar la capa de la piel mediante un corriente patrón subcuticular con sutura absorbible 4-0 y cola para cerrar brechas en las clavijas que sobresalen de la piel.</li>
	<li>Quite la rata del cono de nariz, quedan en la almohada y monitorear continuamente hasta que la rata es capaz de mantener siempre una postura erguida. En este punto, colocar en una jaula limpia para recuperarse.</li>
</ol>7. preparación de mRNA complejado y proyección de imagen de bioluminiscencia
Nota: Transfección con complejos de mRNA debe realizarse durante la cirugía 1 día antes de la proyección de imagen de la luminescencia. Utilizar técnicas estériles al manipular el mRNA.
<ol><li>Mezclar 10 μl de la codificación del mRNA para Gaussia luciferasa (stock concentración de 1 μg/μl) con 30 μL del agente transfecting lipídico.</li>
	<li>Permiten los complejos de mRNA de lípidos para formar por incubación durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente. El agente transfecting lipídico condensará las moléculas de mRNA, les estabilización y mejora de la eficiencia de transfección. Nota: Si los complejos no se utilizan inmediatamente, guárdelos en hielo para un máximo de 1 h.</li>
	<li>Con una pipeta μl 20 equipado con puntas de filtradas, inyectar la mitad del volumen de complejos de mRNA a los extremos distales y proximal del defecto, respectivamente.</li>
	<li>Al día siguiente, 3 minutos antes de la proyección de imagen, anestesiar la rata utilizando isoflurano inhalado según se describió anteriormente en el paso 4.1.</li>
	<li>Colocar la rata en un en vivo imágenes cámara equipada con un cono de nariz entrega mantenimiento isoflurano (0.8% de isoflurano, tarifa de entrega de2 O de 2-3 L/min).</li>
	<li>Inyectar coelenterazine resuspendió en solución salina a dosis de 4 mg/kg de peso corporal en la proximidad del defecto.</li>
	<li>Adquirir imágenes de bioluminiscencia con el en vivo imágenes de sistema (IVIS) según las instrucciones18 el fabricante.</li>
</ol>8. proyección de imagen de protocolo
<ol><li>Después de calibrar la máquina radiográfica simple, un sistema de rayos x19, anestesiar utilizando isoflurano inhalado como se describió anteriormente (ver paso 4.1) de rata y la rata en un cono de nariz con isoflurano inhalado (isoflurano de 0,8%, O2 tasa de entrega de 2-3 L/min) de una radiografía de fémur anteroposterior (AP).<ol>
<li>Mientras que la rata es de recumbency esternal, avance de la cirugía trasera adelante, flexión en la cadera y sofocar la articulación. Flexión de la articulación de la Babilla a aproximadamente 90°. La cinta el lado plantar de la pata hacia abajo, cerca de la pared del cuerpo. Posición de la tibia hacia delante del fémur para eliminar la posibilidad de superposición de los huesos. Para proporcionar ligera abducción de la cadera, coloque una esponja translúcida (aproximadamente 15 mm de espesor) en la región de la ingle. Obtener una imagen (cráneo caudal) antero-posterior del fémur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita este vistas radiográficas de fémur AP inmediatamente después de la cirugía, 4 semanas y 12 semanas. Utilice cinta adhesiva y gasa para posicionar adecuadamente la extremidad del animal por la calidad y la proyección de imagen consistente.</li>
	<li>Retire el cono de nariz de la rata y monitorear continuamente hasta que la rata es capaz de mantener siempre una postura erguida. A continuación, vuelva a colocar la jaula.</li>
</ol>9. procedimiento histológica
<ol><li>Eutanasia ratas en una cámara con inhalado CO2 según la AVMA estándares éticos16.</li>
	<li>Después de eutanasia, afeitarse la trasera, quitar la piel de la parte dispositiva de la extremidad y desarticular el fémur en la cadera. Retire con cuidado todo el tejido suave del fémur operativo (incluyendo todos los músculos, tendones y ligamentos). Dejar solamente una capa delgada de músculo que rodea el sitio de defecto para proteger la región curación de daños involuntarios durante la disección.</li>
	<li>Colocar el fémur en 10% neutro tamponado con formalina a temperatura ambiente durante 3-4 días para permitir la fijación. Mantener un formol 15:1 cociente del volumen del tejido. Cambiar la solución una vez a medio camino a través del proceso de fijación.</li>
	<li>Descalcificar el fémur en una solución de pH 6,5 (EDTA) ácido de 15% etilendiaminotetracético durante 3-4 semanas. Recoger las radiografías de serie para determinar el punto final de descalcificación.</li>
	<li>Atraviesan el fémur longitudinalmente con un corte de anterior a posterior en el plano sagital. Presentar tejido para inclusión en parafina estándar y hematoxilina y eosina (H & E) tinción.</li>
	<li>Enviar diapositivas H & E a un patólogo para la evaluación histológica.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran competencia de intereses financieros o beneficios. No ha habido ningún beneficio recibido directa o indirectamente por los autores de este artículo.

Pequeños modelos animales de lesiones ortopédicas como fracturas de huesos completa permiten investigación que explora los mecanismos de osteogénesis y evaluar el potencial terapéutico de biomateriales20. Este estudio presenta una rata defecto segmentario modelo estabilizado por un fijador externo personalizado que un equipo de laboratorio e ingeniería biomédica puede reproducir fácilmente para otros estudios de carga osteosíntesis reparación de hueso.
Estudios previos ...

Cirugía ortopédica traumatológica se centra en el tratamiento de una amplia gama de fracturas complejas. Crítica ósea segmentaria diafisaria defectos han demostrado ser difíciles de tratar clínicamente debido a la disminución de la capacidad regenerativa del músculo circundante y periostio, así como la falta de locales angiogénesis1. Técnicas de tratamiento modernos incluyen fijación quirúrgica con injerto óseo, retardada de injerto óseo (Masquelet), transporte óseo, fusión o amputación2,3,4. En la mayoría de los pacientes que tienen función ambulatoria conservada después de su trauma, con extremidades distales funciona bien, salvar la extremidad es claramente un mejor tratamiento opción5. Estos tratamientos de salvamento a menudo requieren efectuadas intervenciones sobre un curso de tratamiento. Algunos autores han sugerido que la fijación externa es superior en comparación con la superficie de fijación interna para estas aplicaciones debido a los daños de la disminución del tejido durante la implantación, disminuida implantada y mayor ajustabilidad postoperatoria de el fijador6. Sin embargo, un ensayo controlado aleatorio prospectivo está actualmente en marcha ayudar a aclarar esta controversia de internos versus fijación externa en las fracturas abiertas graves de la tibia7. Lamentablemente, con cada tratamiento seleccionado, importantes tasas de complicación y falta persistan8,9. Con cualquier método de tratamiento, con respecto a la pérdida ósea segmentaria, el cirujano debe lidiar con segmentarios diafisarias defectos que presentan desafíos importantes. Correcciones de defectos segmentarios deben maximizar la estabilización ósea y mejorar simultáneamente el proceso osteogénico10,11.
Debido a la importancia clínica, sin embargo, el volumen más bajo, de defectos segmentarios diafisarias tamaño crítico, un modelo eficaz y reproducible del animal es necesario para permitir que equipos de investigación avanzar en técnicas de tratamiento y, en definitiva, mejorar los resultados clínicos. Los investigadores deben estudiar en vivo fisiológico mecanismos curativos en un modelo animal mamífero. Aunque tales modelos de fijación externa ya existen12,13,14,15, esperamos proporcionar un método más fiable para no-cooperativas de ahorro y en los animales no tratados, disminución de costos a través de la opción de materiales asequibles fixator y contorno un protocolo quirúrgico simple de fácil aplicación para futuros estudios. El objetivo principal de este protocolo es establecer un modelo confiable y reproducible de un defecto crítico diafisario en ratas. El procedimiento se evaluó mediante la evaluación de la estabilización y el hueso curativo en fémur de rata durante 12 semanas. Los objetivos secundarios incluidos: hacer un modelo asequible como un costo efectivo como sea posible, simplificar el abordaje quirúrgico y estabilización y garantizar la ética de cuidado de los animales. Los autores y el equipo de investigación realizaron experimentos preliminares con una gama de diferentes biomateriales y posibles terapias regenerativas para mejorar la cicatrización en este defecto segmentario.

<table><tbody><tr><td>Solución salina estéril al 0,9 %</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>Se utiliza para irrigar heridas y rehidratar</td></tr><tr><td>el 10 % de yodo/povidona</td><td>Carefusion</td><td>1215016</td><td>Se utiliza para preparar la piel</td></tr><tr><td>10 % de formalina tamponada neutra</td><td>VWR</td><td>89370094</td><td>Utilizado como fijador</td></tr><tr><td>Alambre de kirschner sin rosca de 1 mm</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1003.15</td><td>Esterilizado, utilizado para el pin</td></tr> <tr><td>más proximalAlambre Kirschner roscado de 1 mm</td><td>DePuy Synthes</td><td>VW1005.15</td><td>Esterilizado, utilizado para las 3 ranuras de clavija más distales</td></tr><tr><td>Gasa 2x2</td><td>Covidien</td><td></td><td>4006130 Esterilizado, utilizado para preparar la piel y absorber la sangre</td></tr><tr><td>Sutura Vicryl 4-0</td><td>Ethicon 4015304</td><td></td><td>Se utiliza para cerrar las capas musculares y de la piel</td></tr><tr><td>4-40 x 0.25 ", 18-8 tornillos de cabeza de botón de acero inoxidable</td><td>Genérico</td><td></td><td>Fijador externo montaje</td></tr><tr><td>4200 Driver inalámbrico</td><td>Stryker</td><td>OR-S-4200</td><td>Se utiliza para perforar cables kirschner</td></tr><tr><td>Gasa 4x4</td><td>Covidien</td><td>1219158</td><td>Esterilizado, utilizado para absorber sangre</td></tr><tr><td>70 % Etanol</td><td></td><td></td><td>Se utiliza para preparar la piel</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer Healthcare LLC, División de salud animal</td><td>312.10010.3</td><td>Añadido al agua como antibiótico</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Hikma Productos farmacéuticos</td><td>8917156</td><td>Antibiótico preoperatorio</td></tr><tr><td>CleanCap ARNm de la luciferasa de Gaussia (5moU)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>L-7205</td><td>ARNm modificado que codifica para la luciferasa de Gaussia, se mantiene en hielo durante el uso</td></tr><tr>Tecnología <td>NanoLight</td> nativa<td>de celenterazina</td><td>303</td><td>Sustrato para la luciferasa Guassia, utilizado para evaluar la actividad de la luciferasa in vivo</td></tr><tr><td>Pomada antibiótica doble</td><td>Johnson & Johnson consumer Inc</td><td>8975432</td><td>Se aplica a los sitios de los clavos después de la operación como cuidado</td></tr><tr><td>de heridas Microcuchilla de doble corte</td><td>Stryker</td><td>5400-003-410</td><td>Se utiliza para crear un defecto de 5 mm en el fémur</td></tr><tr><td>Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td>Se utiliza para descalcificar el hueso para prepararlo para la histología</td></tr><tr><td>Buprenorfina de liberación prolongada</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Se utiliza como alivio del dolor de 3 días</td></tr><tr><td>Fenestrado cortinas</td><td>3M</td><td>1204025</td><td>Se utiliza para establecer el campo estéril</td></tr><tr><td>Cable de la pieza de mano para TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-4N</td><td>Se utiliza para crear un defecto de 5 mm en el fémur</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>K& H Pet Products</td><td>121239</td><td>Mantenimiento de la temperatura corporal de la rata</td></tr><tr><td>Destornillador hexagonal</td><td>Wiha</td><td>263/1/16 " X 50</td><td>Apriete del fijador externo</td></tr><tr><td>Cámara de inducción</td><td>Anestesia genérica</td><td></td><td>para ratas</td></tr><tr><td>Infusión de esponja de colágeno con proteína morfogénica ósea humana recombinante-2</td><td>Medtronic</td><td>7510200</td><td>Tratamiento clínicamente relevante utilizado como control positivo</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td>Anestesia para ratas</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Modalidad de imágenes de bioluminiscencia</td></tr><tr><td></td><td>Plantilla personalizada</td><td></td><td>Se utiliza para colocar alfileres bicorticales</td></tr><tr><td>Lipofectamine MessengerMAX</td><td>Fisher Scientific</td><td>LMRNA003</td><td>agente complejante de ARNm que permite la administración de ARNm</td></tr><tr><td>Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0,25%) y Epinefrina (1:200.000))</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>NDC 63323-468-37</td><td>Aplicado al sitio quirúrgico para el alivio del dolor y la vasoconstricción</td></tr><tr><td>Agua estéril</td><td>Hospira</td><td>8904653</td><td>Utilizado como solvente para polvo de cefazolina</td></tr><tr><td>Placas fijadoras externas de titanio</td><td>Preparado a medida</td><td></td><td>en casa con chatarra de titanio y fresadora</td></tr> Sistema <tr><td>de rendimiento total (TPS) Consola</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-1</td><td>Se utiliza para crear un defecto de 5 mm en el fémur</td></tr><tr><td>TPS MicroSaggital Saw</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-34</td><td>Se utiliza para crear un defecto de 5 mm en el fémur</td></tr><tr><td>Faxitron Ultrafocus con DXA</td><td>Faxitron</td><td></td><td>Modalidad de imágenes radiográficas de alta resolución</td></tr><tr><td>Dieta para ratas Uniprim Envigo</td><td></td><td>TD.06596</td><td>Dieta para ratas medicadas</td></tr><tr><td>Interruptor de mano universal para TPS</td><td>Stryker</td><td>OR-S-5100-9</td><td>Se utiliza para crear 5 mm defecto en el fémur</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue Adhesive</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Cierre cutáneo</td></tr></tbody></table>

un modelo confiable y reproducible tamaño crítico femoral defecto segmentario en ratas estabilizado con un fixator externo personalizado

A Reliable and Reproducible Critical-Sized Segmental Femoral Defect Model in Rats Stabilized with a Custom External Fixator

Investigación Ortopédica depende en gran medida de modelos animales para estudiar mecanismos de hueso curativo en vivo , así como investigar las nuevas técnicas de tratamiento. Tamaño crítico defectos segmentarios están cuestionando a tratar clínicamente, y esfuerzos de investigación podrían beneficiarse de un modelo animal pequeño confiable, ambulatorio de un defecto femoral segmentario. En este estudio, presentamos un protocolo quirúrgico optimizado para la creación coherente y reproducible de un defecto crítico diafisaria de 5 mm en un fémur de rata estabilizada con un fixator externo. La ostectomía diafisaria se realizó mediante una plantilla personalizada para colocar 4 bicortically alambres de Kirschner, que fueron estabilizados con un dispositivo de fijador externo adaptado. Una sierra oscilante de hueso fue usado para crear el defecto. Una esponja de colágeno solamente o una esponja de colágeno empapado de rhBMP-2 fue implantada en el defecto, y la curación del hueso fue monitoreada durante 12 semanas con las radiografías. Después de 12 semanas, las ratas fueron sacrificadas, y el análisis histológico se realizó en el control suprimido y tratados fémur. Defectos óseos que contienen esponja de colágeno solamente dio lugar a no sindicalizados, mientras que rhBMP-2 tratamiento produjo la formación de una remodelación de hueso perióstico nuevo y cruel. Fijación recuperada bien después de la implantación y externa de animales tuvo éxito en la estabilización de los defectos femorales durante 12 semanas. Este modelo quirúrgico optimizado podría aplicarse fácilmente para estudiar hueso curativo y probar nuevos biomateriales ortopédicos y terapias regenerativas en vivo.

Las cirugías se realizaron en aproximadamente una hora por un cirujano con la ayuda de un asistente. Después de optimización quirúrgica, intra - y las complicaciones postoperatorias se redujeron considerablemente y usan del aparato de plantilla asegurado tamaño constante (5 x 3 x 3 mm) y la localización de los defectos femorales. Las ratas fueron ambulatoria recuperación inmediatamente después de la anestesia y no aparece que cualquier patrón de comportamiento alterado; su marcha no era a...

Modelos de mamíferos in vivo de defectos óseos de tamaño crítico son esenciales para los investigadores estudiando mecanismos de curación y tratamientos ortopédicos. Aquí, presentamos un protocolo para la creación de defectos reproducibles, segmentarias, femorales en ratas estabilizadas con fijación externa.

Un modelo confiable y Reproducible tamaño crítico Femoral defecto segmentario en ratas estabilizado con un Fixator externo personalizado

Orthopedic research relies heavily on animal models to study mechanisms of bone healing in vivo as well as investigate the new treatment techniques. ...

Este protocolo quirúrgico utiliza un modelo consistente y reproducible de defectos segmentarios fijos externamente para evaluar los mecanismos de curación del hueso y el uso de posibles terapias regenerativas. Hemos simplificado una cirugía desafiante para la creación y estabilización de un modelo de defecto óseo segmentario que es accesible y rentable sin dejar de ser apropiado para estudios de curación longitudinal. Esta técnica es particularmente traducible al tratamiento de defectos óseos diafisarios traumáticos de tamaño crítico que pueden beneficiarse de la estabilización con fijación externa, aunque el modelo requiere un estudio adicional.Para evitar una fractura durante la perforación de los pasadores, utilice altas rotaciones por minuto y una baja presión para perforar la corteza lateral, luego disminuya las rotaciones por minuto para avanzar. Después de preparar el andamio de un kit de injerto óseo de tubo de proteína morfogenética ósea, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilice tijeras estériles y una regla estéril para recortar la esponja de colágeno para adaptarse a un defecto de cinco por tres por tres milímetros. A continuación, utilice una jeringa para distribuir la solución de proteína morfogenética ósea-2 uniformemente sobre la superficie de la esponja, hasta que se absorba todo el volumen de solución.A continuación, afeite el área alrededor de la pata trasera de una rata anestesiada usando la costilla 13, la pata trasera y las líneas medias dorsales y ventrales como márgenes, seguido de cuatro exfoliantes alternos alternativos secuenciales de la piel expuesta con gasa estéril empapada en 10%povidona-yodo y 70%etanol. Para inducir el defecto femoral, extienda la pierna afeitada a través de una cortina pegajosa transparente fenestrada, y cubra el banco quirúrgico en toallas estériles para crear un campo estéril. Palpa el fémur y usa una hoja número 15 para crear una incisión anterolateral a través de la piel que se extiende desde la rótula hasta el trocánter mayor en el fémur proximal.Incise cuidadosamente la fascia lateral de la pierna a lo largo del tabique intermuscular para separar el músculo vastus lateralis del cuádriceps antes de los isquiotibiales posteriormente hasta que el fémur lateral esté expuesto. Manteniendo una hoja de bisturí número 15 paralela contra el contorno de la superficie ósea, cortar suavemente el músculo lejos del hueso subyacente para realizar una disección de tejido blando circunferencial cuidadoso y astraumático, y comenzar en la superficie lateral, exponer el fémur en su mid-diaphysis. Utilice un elevador periosteal para levantar el músculo lejos del hueso expuesto a medida que se disecciona, y proceda alrededor del eje femoral hasta que se hayan limpiado de siete a 10 mililitros de diáfisis central de tejido blando en todos los lados.A continuación, coloque un pasador justo al nivel del epicondil lateral, seguido de la colocación de una plantilla al ras del fémur distal lateral, e inserte un cable Kirschner de punta roscada de un milímetro. A continuación, manteniendo la posición de la plantilla en el hueso, identifique dónde entrará el pasador más proximal en el hueso en función de los orificios de la plantilla. Incise en paralelo a las fibras del tendón glúteo según sea necesario para crear una pequeña brecha en el tejido para que el pin proximal pase a través, minimizando el daño iatrogénico al tendón.Taladre un k-wire no roscado de un milímetro en el hueco y compare la altura del pasador perforado con el pasador suelto para confirmar que el pasador engancha ambos cortices. Mantenga la posición de la plantilla en contacto con el hueso y taladre dos cables k roscados de un milímetro, uno a cada lado del sitio del defecto futuro, asegurando que los pines enganche ambos cortices, y coloque el nivel de la barra fijadora externa un centímetro por encima de la piel. Atornilla firmemente, bloqueando la barra en su lugar, y recorta las longitudes de pasador sobrantes.Coloque un pequeño retractor curvo alrededor del fémur anterior y posterior para proteger el tejido blando, el músculo y el haz neurovascular circundante, y utilice una hoja de sierra oscilante sagital de aproximadamente cinco milímetros, y luz, incluso presión, para crear con mucho cuidado un defecto segmentatorio de cinco milímetros a través de la mid-diaphysis. Enjuague la herida con 10 mililitros de 0,9% de solución salina normal después de crear el defecto, y administre 0,1 mililitros de 0,25% de bupivacaína con epinefrina a la herida como analgésico y vasoconstrictor. Inserte el andamio de esponja empapado de proteína morfogenética ósea-2 en el defecto, y utilice una sutura absorbible 4-0 en el patrón interrumpido simple para cerrar el plano muscular.Luego cierre la capa de la piel usando una sutura absorbible 4-0 en un patrón subcuticular, luego pegue la piel para cerrar cualquier hueco alrededor de los pines salientes, y obtenga una imagen radiográfica anterior-posterior del fémur inmediatamente, y cuatro y 12 semanas después de la cirugía. Los defectos de control negativos que contienen sólo una esponja de colágeno no muestran evidencia de puentear la osteogénesis entre los bordes óseos proximal y distal. Una pequeña cantidad de nueva remodelación ósea se puede ver directamente adyacente al borde del fémur cortado, mientras que el defecto en sí muestra una falta de material óseo, la presencia de cartílago, y algún hematoma residual.Los defectos que contienen la esponja empapada de proteína morfogenética ósea-2 demuestran una cicatrización ósea significativa tan pronto como cuatro semanas después de la cirugía, como lo demuestra el puente insensible radiopaco a través del defecto. A las 12 semanas, se ha formado una nueva deposición mineral significativa a lo largo del defecto. Se puede observar un nuevo hueso periosteal significativo en la extensión insensible desde el borde del fémur cortado y las espículas del hueso tejido y lamelar se han desarrollado a lo largo del defecto.Además, no se ve la deposición del cartílago. La imagen a través de In Vivo Imaging System después de la eliminación del fijador externo permite visualizar las células trans infectadas bioluminiscentes dentro del defecto. Por ejemplo, las células de la luminisca de la cavidad medular después de la transfección con codificación de ARNm compleja para la Gaussia luciferasa, y podrían utilizarse para medir los cambios biológicos en la expresión de un gen o proteína de interés durante el proceso de curación.La colocación de los pines es importante para garantizar una fijación externa estable y duradera. Los pasadores deben ser directamente perpendiculares al fémur, y paralelos entre sí, para minimizar la rotura y la infección. Usando este modelo, los mecanismos biológicos, tales como expresiones de proteínas específicas, pueden ser monitoreados para entender mejor la curación, y diferentes biomateriales de andamios o terapias también pueden ser probados para la eficacia terapéutica.Esperamos que esta técnica permita a los futuros investigadores estudiar de manera más eficiente y eficaz la curación ortopédica con fijación externa para que sus hallazgos puedan traducirse en éxitos clínicos mejorados. Evite inhalar gases anestésicos, use el equipo de protección personal adecuado al manipular formalina y EDTA, y tenga cuidado al manipular instrumentos quirúrgicos, particularmente la perforación y la sierra ósea oscilante.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Una limitación de la investigación preclínica en el campo de la reparación ósea es la falta de control experimental sobre el entorno mecánico local dentro de una lesión ósea en curación. Presentamos el diseño y uso de un fijador externo para la reparación ósea con la capacidad de cambiar la rigidez del fijador in vivo.

Ajustable en dureza, fijador externo para los modelos de rata Fémur Osteotomía y segmentaria del defecto óseo

Los modelos animales se emplean con frecuencia para imitar lesiones óseas graves en la investigación biomédica. Debido a su pequeño tamaño, el establecimiento de lesiones óseas estabilizadas en ratones está más allá de las capacidades de la mayoría de los grupos de investigación. En este trabajo, describimos un método simple para establecer y analizar defectos femorales experimentales en ratones.

A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

Aunque los modelos de ratón son herramientas invaluables para la ingeniería de tejidos óseos, los modelos de defectos de huesos largos son escasos. Esta necesidad motivó el desarrollo del presente protocolo, que utiliza una placa de bloqueo con cuatro tornillos y una plantilla específica para realizar y estabilizar un defecto femoral, reproducible, de tamaño crítico y de baja morbilidad.

Establecimiento de un defecto segmentario Modelo femoral de tamaño crítico en ratones estabilizado por osteosíntesis Plate

Este estudio describe un protocolo reproducible y detallado usando un fijador externo desarrollado recientemente para la osteogénesis de la distracción () en una rata femoral modelo que permisos fisiológica portantes por el animal después del retiro del fijador externo.

Un protocolo eficiente y Reproducible para la osteogénesis de la distracción en un modelo de rata a un fémur regenerado funcional

Aquí, presentamos un protocolo para crear un defecto de cavidad de caja en el tejido de diáfisis femoral de rata. Este modelo puede evaluar el rendimiento de los biomateriales bajo estrés biomecánico y explorar los mecanismos de regeneración ósea relacionados con la osteogénesis intramembranosa.

Creación de un modelo de defecto de cavidad de caja en el hueso cortical del fémur de rata

Este estudio estableció un modelo de defecto semisegmentario femoral de rata para evaluar el rendimiento mecánico y osteogénico de materiales sustitutos óseos bajo condiciones portantes sin el uso de fijación interna o externa.

Modelo de defecto óseo diáfisario semisegmentario en ratas para evaluar el rendimiento de sustitutos óseos en regiones portantes

El estudio combina de forma innovadora suturas y agujas de titanio para una fijación interna estable en un modelo de fractura radial en rata. La cicatrización de fracturas se evaluó mediante tomografía microcomputarizada (micro-CT), y se aislaron y cultivaron neuronas ganglionares de la raíz dorsal primaria (DRG) para su investigación posterior.

Desarrollo de un novedoso modelo de fijación interna para fracturas radiales de rata: evaluación de la cicatrización de fracturas y aislamiento de ganglios de la raíz dorsal

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Dos fluidos adyacentes que pasan a través de un canal microfluídico ranurado pueden ser dirigidos para formar una vainta alrededor de un núcleo de prepolímero; determinando así tanto la forma como la sección transversal. La polimerización fotoiniciada, como la química de tiol click, es muy adecuada para solidificar rápidamente el fluido central en una microfibra con tamaño y forma predeterminados.

Fabricación Microfluídica De Fibras Poliméricas Y Biohíbridas Con Tamaño y Forma Prediseñados

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

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Aprende a crear defectos femorales segmentarios en ratas con fijador externo personalizado para estudiar mecanismos de regeneración ósea y terapias ortopédicas. Este protocolo reproducible facilita investigaciones longitudinalmente.

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