Determinar la tasa de fertilización de huevos de Bemisia tabaci mediante una técnica citogenética

El protocolo que Liz desarrolló nos permite determinar la tasa de fertilización de la mosca blanca. La aplicación de esta técnica mejorará nuestra comprensión del comportamiento y la ecología de las moscas blancas. Las moscas blancas son haplodiploide, por lo que la tasa de fertilización es igual a la relación de sexo en oviposición.

Este protocolo es el primero descrito para las moscas blancas, a nuestro conocimiento, y se puede completar dentro de tres horas. Para comenzar, haga un agujero cubierto en la cubierta de la placa de Petri para insertar y quitar las moscas blancas adultas. Configure una cámara de humedad y forje una sonda insertando un pasador delgado en un ángulo de trabajo cómodo en una punta de pipeta fundida para hacer una sonda delgada.

Opcionalmente, las puntas de pipeta de vidrio alargado con calor para facilitar el manejo de los huevos de mosca blanca. Luego, deje que las moscas blancas hembras se oviposit en una hoja limpia, cortadas para caber en el agar en un plato de Petri. Durante la oviposición de la mosca blanca, limpie un portaobjetos con agua y jabón.

Sécalo bien y estire un trozo de película de parafina sobre un extremo para permitir que los líquidos formen gotas y los huevos se vean más fácilmente. Para descorionar los huevos, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para añadir gotas de solución de lejía de hipoclorito de sodio al 83% de solución de lejía de hipoclorito sódico a la película de parafina justo antes de la extracción de adultos y la recolección de óvulos. La lejía y el ácido acético glacial son corrosivos.

Deben manipularse con guantes en una capucha o en un área bien ventilada. DAPI también es un irritante y debe ser manejado con guantes. Luego, retire las moscas blancas adultas de la hoja y coloque la hoja debajo de un microscopio.

Levante cuidadosamente cada huevo de su base hasta que el pedicel se retire de la hoja. Practique en muchos huevos antes de realizar este protocolo. Levante los huevos lentamente de la base y levántelo completamente de la hoja una vez que pueda ver que el pedicel de huevo se retira de la hoja.

Transfiera de dos a tres huevos a cada gota de lejía y déjelos durante 10 minutos. Para fijar los huevos, utilice una pipeta de vidrio para desechar la lejía. Luego, añade gotas de ácido acético glacial y espera tres minutos.

A continuación, retire el ácido acético glacial y agregue gotas de la solución de Clarke. Luego, espere 10 minutos hasta que la mayor parte de la solución se haya evaporado. Añadir gotas de 70%etanol y esperar de nuevo durante 10 minutos.

Para manchar los huevos, primero retire cualquier etanol residual. Luego, agregue gotas de 1xPBS a los huevos para obtener el pH cerca de siete. Coloque el portaobjetos del microscopio en una cámara de humedad para evitar la desicación.

Después de 30 minutos, retire el 1xPBS y agregue gotas de 1 microgramos por mililitro DAPI. Coloque el portaobjetos del microscopio en una cámara de humedad oscura y espere al menos 15 minutos. Para lavar los huevos, primero retire la solución DAPI.

A continuación, agregue gotas de 1xTBST a los huevos. Después de cinco minutos, retire el 1xTBST. Repita este lavado dos veces más para un total de tres lavados.

Después del lavado final, pipetee cuidadosamente todos los huevos de la parafilma en una parte limpia del portaobjetos del microscopio. Retire el exceso de TBST y añada 20 microlitros de medios de montaje. Por último, coloque una corredera de cubierta limpia en la parte superior de los huevos, selle la corredera de la cubierta con esmalte de uñas transparente para su almacenamiento a largo plazo y proceda a la toma de imágenes con un microscopio fluorescente.

La descorionación del huevo seguida de la tinción nuclear DAPI permitió la asignación de fertilización y sexo embrionario cuando se observa con un microscopio fluorescente. El pronucleus femenino está cerca del centro del óvulo hembra fertilizado y del óvulo macho no fecundible, y el espermatozoide es visible como una veta brillante cerca del ápice del óvulo hembra solamente. Una aplicación de esta técnica es determinar si las endosimbionts bacterianas afectan las proporciones sexuales primarias de las moscas blancas.

Por ejemplo, las proporciones de sexo primario de los huevos puestos por las moscas blancas B.tabici infectadas por Rickettsia y no infectadas no mostraron ninguna diferencia significativa entre la relación de sexo en los dos tratamientos. En cuanto a los huevos criados hasta la edad adulta, se observaron resultados similares para los adultos infectados por Rickettsia y no infectados, proporcionando ninguna evidencia, al menos en este estudio, para mayores tasas de fertilización por las hembras infectadas por Rickettsia. Mediante el uso de este protocolo, se puede determinar si los espermatozoides interespecíficos pueden fertilizar los óvulos.

Si no se observa fertilización, uno podría respaldar y mirar para ver si los espermatozoides se transfieren durante el apareamiento mirando en la espermatozoides de la hembra. Si se produce la fertilización, se podría comparar la proporción de sexo de los adultos con la tasa de fertilización para determinar la viabilidad del desarrollo híbrido de la descendencia.