Name: Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a identificar interactores de ARN de PKR mediante formaldehído y inmunoprecipitación en células HeLa. Este método permite estudiar la regulación postranscripcional y su relación con enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea Ministerio de ciencia y TIC (NRF-2016R1C1B2009886).

1. solución y célula preparación
<ol><li>Preparación de la solución<ol>
<li>Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Nota: Pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo celular, pero no utilizamos antibióticos.</li>
		<li>Para el 0,1% paraformaldehido, disolver paraformaldehído al 4% (p/v) de 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con calefacción en un plato caliente y diluido para hacer 30 mL de paraformaldehído al 0,1% (v/v) mediante la adición de 1 x PBS. PRECAUCIÓN: Realizar todos los pasos en una campana de humos y tenga cuidado de no hervir la solución de paraformaldehído. Proteger la solución al 0.1% de la luz y almacenar a 4 ° C. Usar la solución dentro de un mes. Nota: El pH de la solución de paraformaldehído al final de 0,1% (v/v) debe ser alrededor de 7.</li>
		<li>Preparación de buffer de lisis de fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% Tritón X-100, (v/v) 0,1% (v/v) sodio dodecil sulfato (SDS) y desoxicolato de sodio 0,1% (p/v). Añadir agua destilada triple (TDW) a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar el tampón de lavado fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% Tritón X-100 (v/v) 0,1% (v/v) SDS y 0.1% (p/v) desoxicolato de sodio. Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA y SDS 4% (v/v). Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar el tampón de elución de fCLIP: 20 mL de 4 x PK tampón, 21 g de urea y 8,5 mL de capacidad. Preparar fresco.</li>
		<li>Preparar el tampón de elución de RNA: 0,3 M NaOAc y SDS 2% (w/v). Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar 2 x tinte de carga RNA: azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol, EDTA 5 mM, 0.05% (p/v) de SDS y formamida de 95% (v/v). Almacenar a-20 ° C.</li>
		<li>Preparación de buffer de x TBE 1: 0.089 M Tris borato y 0.002 M EDTA. Preparar 500 mL de tampón TBE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de células detenidas en fase S o M<ol>
<li>Semilla 750.000 ~ o ~ 1.000.000 HeLa células para muestras detenido en fase S o M, respectivamente. Crecen las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h.</li>
		<li>Tratar las células con timidina de 2 mM e incubar durante 18 h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavan las células dos veces con PBS. Añadir medio fresco e incubar de 9 h a 37 ° C.</li>
		<li>Para las células detenidas en fase S, tratar las células con timidina 2 mM. Para las células detenidas en fase M, tratar las células con 100 ng/mL nocodazole. Incubar por 15 h a 37 ° C y la cosecha de las células. Nota: La homogeneidad de las muestras del ciclo celular puede ser comprobada utilizando FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. formaldehído Cross-linking e inmunoprecipitación
<ol><li>Cosecha de células<ol>
<li>Para una muestra de fase S, recoger las células con un raspador celular y transferencia en un tubo cónico de 15 mL. Para una muestra de fase M, toque en el lado de la placa de cultivo celular para separar células detenidas en fase M y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL. Nota: Para aumentar la homogeneidad de las células detenidas en fase M, use un raspador celular.</li>
		<li>Centrifugar las células a 380 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante y resuspender con 1 mL de PBS frío y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reticulación de formaldehído<ol>
<li>Añadir 750 μL de paraformaldehído al 0.1% durante 10 min a temperatura ambiente para fijar las células.</li>
		<li>Añadir 250 μL de glicina de 1 M e incubar un adicional 10 min a temperatura ambiente para calmar la reacción. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.</li>
		<li>Vuelva a suspender con 1 mL de PBS. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C para 30 s y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender con 400 μL de tampón de lisis fCLIP suplementado con 0.2% (v/v) inhibidor de la proteasa y el 2% (v/v) inhibidor de la Rnasa. Incubar en hielo por 10 min y someter a ultrasonidos usando un ultrasonicador.</li>
		<li>Añadir 11 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Vortex brevemente y centrifugue a 21.130 x g a 4 ° C durante 15 minutos transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enfriada. Nota: Conservar 40 μL del sobrenadante en un tubo de centrífuga nueva como la muestra de entrada. Tienda la entrada muestra a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmunoprecipitación<ol>
<li>Añadir 20 μL de perlas de proteína A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Lavar los granos con 400 μL de tampón de lisis fCLIP. Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lisis fCLIP cuidadosamente. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.</li>
		<li>Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.</li>
		<li>Vuelva a suspender las cuentas en 300 μL de tampón de lisis de fCLIP. Añadir 8,3 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Añadir 10 μL del anticuerpo PKR e incubar durante 3 h en un rotador a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.</li>
		<li>Repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante. Nota: Nunca use un mezclador de tipo vórtex. Invertir el tubo suavemente con las manos.</li>
		<li>Añadir 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C en un agitador. Nota: Tiempo de incubación más largo puede resultar en el enlace de mayor fondo.</li>
		<li>Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.</li>
		<li>Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 300 μL de tampón de elución de fCLIP. Incubar en un Termomezcladores de 3 h a 25 ° C a fin de eluir PKR de los granos. Nota: Preparar el fresco de buffer de elución de fCLIP.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un tubo siliconado limpio. Nota: Un tubo de microcentrífuga es también aceptable, pero es preferible tubo siliconado para evitar la evaporación durante el reticulación de paso (2.3.12).</li>
		<li>Añadir 300 μL de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar durante la noche a 65 ° C. Nota: Utilice un Termomezcladores con cubierta climatizada para evitar la evaporación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracción de RNA<ol>
<li>Añadir 580 μL de ácido fenol cloroformo y agitar por 30 s. incubar a 37 ° C durante 1 hora.</li>
		<li>Vortex por 30 s y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant (e.g., Glycoblue) y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.</li>
		<li>Precipitar el pellets por centrifugación a velocidad máxima a 4 ° C durante 1 hora. Nota: Si no se observaron gránulos de ARN/ADN, agregar un adicional 0,5 μL de coprecipitant y centrifugar durante un adicional 1 h. continuar este paso hasta que se observan gránulos de ARN/ADN.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de alcohol etílico al 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min repetir el lavado una vez más. Quite completamente el sobrenadante y secar el precipitado a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 42 μL de TDW, 5 μL de DNasa buffer, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de DNasa I. incubar a 37 ° C durante 1 hora.</li>
		<li>Añadir 150 μL de TDW y 200 μL de ácido fenol cloroformo. Vortex por 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.</li>
		<li>Pellets de precipitar y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Vuelva a suspender en la cantidad apropiada de TDW.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. secuencia biblioteca elaboración
<ol><li>retiro de rRNA<ol>
<li>Vuelva a suspender los pellets de RNA de paso 2.4.10 con 28 μL del PST. Nota: La máxima cantidad de ARN total debe ser menos de 5 μg.</li>
		<li>Seguir los procedimientos previstos por la guía de referencia del kit de extracción de rRNA para quitar rRNA.</li>
		<li>Limpiar rRNA había agotado ARN mediante la adición de 160 μL de bolas magnéticas.<ol>
<li>Mezclar mediante pipeteo ~ 15 veces e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
			<li>Conecte el tubo de una barra magnética y eliminar el sobrenadante.</li>
			<li>Añadir 300 μL de alcohol etílico 80% mientras que los granos estén fijados en la barra magnética e incuban durante 30 s.</li>
			<li>Reemplazar el alcohol etílico con una solución fresca de 300 μL. Secar los granos en la barra magnética durante 12 minutos a temperatura ambiente.</li>
			<li>Vuelva a suspender las cuentas en 12 μL de TDW y mezclar mediante pipeteo 15 veces.</li>
			<li>Coloque los granos en la barra magnética y trasladar el sobrenadante a un tubo limpio de PCR.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agotan las fragmentada RNAs ribosomal (rRNAs) siguiendo los procedimientos previstos por rRNA Kit de agotamiento.</li>
		<li>Limpiar el ARN añadiendo 110 μL de granos magnéticos y repitiendo pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligadura de etiquetado y adaptador de RNA<ol>
<li>En RNAs rRNA-agotado, añadir 2 μL de tampón de x CIAP 10, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de la fosfatasa alcalina Antártica. Incubar a 37 ° C por 1 h y luego a 65 ° C por 5 min inactivar la fosfatasa.</li>
		<li>Agregar 3 μL de tampón de x PNK 10, 1,5 μL de inhibidor de la Rnasa, 1,5 μL de enzima T4 PNK, 0,8 μL de r-ATP y 1,7 μL del PST. Incubar a 37 ° C por 50 minutos.</li>
		<li>Añadir 1,5 μL de 10 mM ATP e incubar a 37 ° C durante 40 minutos adicionales.</li>
		<li>Detener la reacción agregando 170 μL del buffer de elución de RNA.</li>
		<li>Añada 200 μL de ácido fenol cloroformo y agitar durante 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.</li>
		<li>Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Vuelva a suspender en 4.5 μL del PST y añadir 9 μL de 2 x tinte carga de RNA.</li>
		<li>Calentar la muestra a 95 ° C por 5 min y carga en un gel de Urea-PAGE 10%.</li>
		<li>Correr el gel a 370 V durante 40 minutos. Nota: Ejecutar previamente el gel a 370 V durante 90 minutos antes de cargar la muestra.</li>
		<li>Corte el gel en la región de nucleótido de ~ 100 – 500 y romper el gel.</li>
		<li>Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante una noche a 4 ° C en un agitador.</li>
		<li>Transferir la solución a una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3' ligadura de adaptador<ol>
<li>Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Resuspender el pellet de RNA en 6,5 μL del PST y añadir 1 μL de 10 μM 3' adaptador.</li>
		<li>Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.</li>
		<li>Añadir 1 μL de tampón de ligadura de 10 x, 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de ligasa de T4 RNA 2. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.</li>
		<li>Añadir 12 μL de 2 x RNA carga tinte y calor a 95 ° C durante 5 minutos.</li>
		<li>Purificar de gel 3' adaptador ligarse RNAs como se describe en 3.2.9 a 3.2.13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5' ligadura de adaptador<ol>
<li>Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.</li>
		<li>Resuspender el pellet de RNA en μL 4,2 del PST y añadir 1 μL de 5 μM 5' adaptador.</li>
		<li>Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.</li>
		<li>Agregar 0,8 μL de tampón de ligasa de x 10, 0.4 μL de inhibidor de la Rnasa, 0,8 μL de 10 mM ATP, 0,8 μL de ligasa de T4 RNA 1. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transcripción reversa y amplificación por PCR<ol>
<li>5' adaptador RNAs ligados, añadir 1 μL de cebador de transcripción inversa de 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min y enfriar inmediatamente a 4 ° C.</li>
		<li>Añadir 4 μL de tampón de FS de x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M TDT 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa. Incubar a 50 ° C por 1 h y a 70 ° C por 15 minutos.</li>
		<li>Preparar la amplificación por PCR<ol>
<li>Mezclar 1 μL del producto de RT, 1 μL de cebador RPI de 25 μM, 1 μL de cebador de RP1 de 25 μM, 10 μL de 5 x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL del PST y 0,5 μL de polimerasa de alta fidelidad.</li>
			<li>Ejecutar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos. Nota: El programa de la polimerización en cadena es: 98 ° C por 30 s para un arranque en caliente, 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s para la amplificación y 72 ° C durante 5 minutos. La etapa de amplificacion se repite por ciclos de 11-13.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Limpiar los productos PCR usando 40 μL de los granos magnéticos y siguientes pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6 pero con 10 μL de capacidad a fin de eluir el ADN.</li>
		<li>Añadir 2 μL de colorante de carga de ADN de x 10. Cargar la muestra en un gel de acrilamida de 6% y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.</li>
		<li>Tinción con Sybr oro (0.01% (v/v) en solución tampón de x TBE 1) durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>La mancha en 1 x TBE solución tampón durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Corte el gel en la región de ~ 200 – 700 nucleótidos y romper el gel.</li>
		<li>Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante la noche a temperatura ambiente a fin de eluir el ADN.</li>
		<li>Cargar todo en una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.</li>
		<li>Precipitar el DNA pellets y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Resuspender en 20 μL del PST.</li>
		<li>Analizar la muestra utilizando un secuenciador.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de RNAs PKR interactuando mediante qRT-PCR
<ol><li>Método 1: Random hexamer transcripción reversa<ol>
<li>Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.</li>
		<li>Añadir 0,5 μL de 100 μM random hexamers y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.</li>
		<li>Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.</li>
		<li>Hacer la reacción de la mezcla: 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la mezcla de reacción a la solución de RNA.</li>
		<li>Incubar la mezcla a 23 ° C durante 10 min, 50 º C durante 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Analizar el cDNA utilizando un sistema PCR en tiempo real. Nota: El programa de la PCR en tiempo real es: 95 ° C por 3 min para arranque en caliente, 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 10 s para la amplificación y 95 ° C por 30 s, 65 ° C durante 30 s y 95 ° C para 30 s para derretir. La etapa de amplificacion se repite para 40 ciclos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Método 2: Filamento específico transcripción reversa<ol>
<li>Preparar una mezcla maestra de cartillas inversas: mezclar cantidades iguales de cartillas de reversa de la transcripción específico gen que contenga CMV promotor secuencia seguidas de ~ 20 nucleótidos de secuencias específicas de genes. Nota: La concentración combinada de todos los iniciadores RT de genes específicos es 4 μM.</li>
		<li>Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.</li>
		<li>Agregar 0.5 μL de mezcla maestro de 4 μM de iniciadores de reversa de la transcripción y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.</li>
		<li>Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.</li>
		<li>Preparar la solución de reacción mezclando 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la solución de reacción a la mezcla de RNA cebador.</li>
		<li>Incubar la solución a 50 ° C por 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Analizar el cDNA usando el sistema PCR en tiempo real. Nota: El programa de la PCR en tiempo real es igual que el descrito en el método 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El proceso de preparación de muestras detenidas en fase S o M se ilustra en la figura 1. Para detener las células en la fase S, se utilizó un método de doble bloque de timidina donde tratamos las células con timidina dos veces con un lanzamiento de 9 h en el medio para asegurar eficacia de detención alto (figura 1A). De detención de la fase de M, tratamos a las células una vez con timidina seguido de un lanzamiento de 9 h y después se aplicaron nocodazole bloque...

La proteína quinasa RNA-activado (PKR), también conocido como eucariótico de iniciación factor 2-alfa 2 (EIF2AK2), es una quinasa bien caracterizado que transmite informaciones de RNAs. Pertenece a la alfa de la subunidad de iniciación 2 traducción en eucariotas (eIF2α) familia cinasa y fosforila eIF2α en serina 51 en respuesta a la infección para suprimir traductor global1. En este contexto, el PKR es activado por RNAs virales de doble hebra (dsARN), que proporcionan una plataforma para PKR dimerización y autophosphorylation2. Además de eIF2α, PKR puede también fosforilan p53, sustrato del receptor de insulina 1, inhibidor κB y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) para regular la actividad de numerosas señales de transducción vías3,4,5, 6.
PKR fue identificado originalmente como una quinasa que fosforila eIF2α durante la infección por poliovirus por reconocimiento dsRNAs7,8 de poliovirus. PKR se encuentra cada vez más para jugar múltiples roles más allá de la respuesta inmune, y su activación aberrante o mal funcionamiento está implicado en numerosas enfermedades humanas. Activado/Phosphorylated PKR (pPKR) se observa con frecuencia durante la apoptosis y es una característica común de pacientes con enfermedades crónico-degenerativas, particularmente las enfermedades neurodegenerativas como la de Huntington, Parkinson y la enfermedad de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Además, PKR se activa bajo diferentes condiciones de estrés como la tensión metabólica y calor choque14,15,16,17. Por otra parte, inhibición de PKR resultado creciente de la célula proliferación y transformación maligna hasta18,19. Función PKR también es importante en la función normal del cerebro y durante el ciclo celular como el nivel de pPKR es elevada durante la fase M20,21,22. En este contexto, pPKR suprime traductor global y proporciona señales para sistemas de señalización mitóticos clave que se requieren para la correcta división celular20. Por otra parte, la activación prolongada de PKR resultó en fase G2/M23de las células de la detención del ciclo celular de ovario de hámster chino. En consecuencia, la fosforilación PKR está regulada por el bucle de retroalimentación negativa para asegurar la rápida desactivación durante de transición M/G121.
A pesar de la función de la amplia gama de PKR, nuestro entendimiento de la activación de PKR es limitado debido a la falta de un enfoque experimental estandarizado de alto rendimiento para capturar e identificar los dsRNAs que puede activar PKR. Estudios anteriores han demostrado que PKR puede interactuar con dsRNAs formado por dos invertido Alu repeticiones (IRAlus)20,24, pero la posibilidad de la existencia de dsRNAs celular adicional que puede activar PKR durante el ciclo celular o bajo condiciones de estrés en células humanas era inexplorado. El enfoque convencional en la identificación de RNA-interactianos de una proteína de unión a RNA (RBP) utiliza luz ultravioleta para reticulación RNA-RBP complejos25,26,27. Un estudio reciente había aplicado este método de reticulación UV en un sistema de ratón e identificó que RNAs nucleolares pequeño pueden regular la activación de PKR durante el estrés metabólico16. Utilizando eficiencia alta reticulación de formaldehído, presentamos un método alternativo para identificar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular en células de HeLa28. Un enfoque similar se ha aplicado para estudiar otras dsRBPs como Staufen y Drosha29,30,31. Encontramos que PKR puede interactuar con varios tipos de RNAs noncoding como corto elemento nuclear entremezclado (seno), largo había entremezclado elemento nuclear (línea), el elemento de retrovirus endógeno (ERV) y RNAs incluso alfa satélite. Además, nos demostró que PKR puede interactuar con el ARN mitocondrial (mtRNAs), que forma de dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y la luz del filamento RNAs28. Una publicación reciente apoyado nuestros datos que algunos mtRNAs en forma de dos caras y puede activar sensores de dsARN como melanoma diferenciación asociada a proteina 5 inducir interferones32. Más importante aún, la expresión y localización subcelular de mtRNAs son moduladas durante el ciclo celular y por diversos factores de estrés, que puede ser importante en su capacidad para regular la activación de PKR28.
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para una reticulación de formaldehído desarrollado recientemente y la inmunoprecipitación (fCLIP) método para capturar y analizar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular. Se demuestra el método para preparar muestras de detención del ciclo celular mediante timidina y nocodazole. A continuación presentamos el proceso de fCLIP para aislar RNAs PKR-limite y un método para preparar la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento para identificar estos RNAs. Además, delinean los procedimientos detallados para analizar RNAs PKR-limita uso de qRT-PCR. En concreto, presentamos un procedimiento de transcripción reversa filamento específico para analizar el strandedness de mtRNAs. El protocolo descrito está optimizado para las células HeLa y PKR, pero pasos como la preparación de la muestra del ciclo celular, fCLIP y análisis específicos de filamento qRT-PCR pueden modificarse fácilmente para estudiar celular dsRNAs o identificar interactianos de RNA de otros dsRBPs.

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 m Tris, pH 7,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 m Tris, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón de carga de ADN</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo cónico</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador</td><td></td><td></td> de 3' <td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M Acetato de sodio pH 5.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' adaptador</td><td></td><td></td><td>5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 m NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 50 mL</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo ácido-fenol, pH 4,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Las perlas magnéticas limpian el ADN/ARN</td></tr><tr><td>de la fosfatasa alcalina antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DGCR8</td><td></td><td></td><td>Hecho en casa</td></tr><tr><td>Anti-PKR (D7F7)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKR (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica azul de bromofenol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa</td> <td>alcalina intestinal de terneraTaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células 25 cm 2 posiciones</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr>Secuencia <td></td><td></td><td>promotora CMV</td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco's</td></tr> <tr><td>medio de águila modificado</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mezcla (2.5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Absoluto, Grado ACS</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Bio-básica</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>Coprecipitante GlycoBlue (15 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td><td>Kit de depleción de ARNr</td><td>E6318</td> de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr>Tecnología <td>de señalización de células</td><td>IgG de conejo normal</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR cebador directo (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>Índice de PCR cebador inverso (RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'Tubos</td></tr> <tr><td>de PCR con tapa plana, 0,2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Tableta de solución salina con bufer de fosfato (PBS)</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Polimerasa</td></tr> <tr><td>de alta fidelidadMicrocentrífuga PlateFuge con rotor basculante</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K, recombinante, grado PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>secuencia de cebadores qPCR: CO1 Pesado</td><td></td><td></td><td>adelante/atrás: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CO2 Pesado</td><td></td><td></td><td>Adelante/Atrás: 5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CO3 Heavy</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-CCTTTTACCACCACCCCCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CO3 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: GAPDH</td><td></td><td></td><td>Adelante/Atrás: 5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND1 Pesado</td><td></td><td></td><td>hacia adelante/atrás: 5&prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND1 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND4 Pesado</td><td></td><td></td><td>hacia adelante/atrás: 5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND4</td><td></td><td></td><td>Light Forward/Reback: 5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND5 Pesado</td><td></td><td></td><td>hacia adelante/atrás: 5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND6 Pesado</td><td></td><td></td><td>hacia adelante/atrás: 5&prime;-TCATACTCTCTCTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores qPCR: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reback: 5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Hexámero aleatorio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Dnasa I recombinante (sin ARNasa) (5 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor recombinante de la rnasa (40 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero rRNA Kit de eliminación</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>rRNA Kit</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT secuencia de cebadores: CO1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGGCGGTGTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CO1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebador RT: CO2 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CO2 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CO3 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CO3 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND4 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebador RT: ND4 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND5 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTGTGTGTGATGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND5 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND6 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Secuencia de cebadores RT: ND6 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Tubo G de polipropileno siliconado de 1,5 mL</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>Dedecil sulfato de sodio</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERasa Inhibidor de la rnasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III transcriptasa inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>Transcriptasa inversa para la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa SuperScript IV Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>18090010 Transcriptasa inversa para qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR tinción gl de ácido nucleico de oro</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific S11494</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 2, truncado KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C con ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris-borato-EDTA (TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Perlas de sefarosa de proteína A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>Perlas de proteína A</td></tr><tr><td>Ultrasonicador</td><td>Bioruptor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio-basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP (10 &mu; Ci/&mu; L, 3,3 y mu; M)</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de interactianos de arn de la proteína quinasa activada por arn durante el ciclo de la célula mamífera

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Kinase de proteína RNA-activado (PKR) es un miembro de las proteínas de la respuesta inmune innata y reconoce la estructura secundaria de doble cadena de ARN viral. Cuando se enlaza a los RNAs virales de doble hebra (dsARN), PKR experimenta la dimerización y autophosphorylation posterior. PKR fosforilada (pPKR) se activa e induce la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α) para suprimir el traductor global. Creciente evidencia sugiere que PKR puede activarse en condiciones fisiológicas durante el ciclo celular o bajo diferentes condiciones de estrés sin infección. Sin embargo, nuestra comprensión de los activadores de RNA de PKR es limitado debido a la falta de un método experimental estandarizado para capturar y analizar la interacción PKR dsRNAs. Aquí, presentamos un experimental protocolo específicamente enriquecer y analizar PKR obligado RNAs durante el ciclo celular con células HeLa. Utilizamos la actividad eficiente de la reticulación de formaldehído para fijar complejos ARN-PKR y aislarlos mediante inmunoprecipitación. PKR co-immunoprecipitated RNAs pueden entonces ser procesados para generar una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Una clase importante de dsRNAs celular interactuando PKR es RNAs mitocondriales (mtRNAs), que pueden existir como dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y las RNAs de filamento de la luz. Para estudiar el strandedness de estos mtRNAs duplex, también presentamos un protocolo específico de filamento qRT-PCR. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de PKR-limite RNAs, pero puede ser fácilmente modificado para estudiar celular dsRNAs o RNA-interactianos de otras proteínas de Unión dsRNA.

Un esquema para el proceso de detención de las células HeLa en la fase S o M del ciclo celular se muestra en la figura 1. Para una muestra de fase detenido M, claramente podemos visualizar células redondas formadas bajo el microscopio (figura 2A). Para examinar la eficacia de la detención del ciclo celular, el contenido nuclear de la célula puede ser analizado utilizando FACS (figura 2B). La figura 3 muestra datos represe...

Presentamos aproximaciones experimentales para estudiar interactianos de RNA de doble cadena RNA Unión proteína quinasa RNA-activado (PKR) durante el ciclo celular mamífero con células HeLa. Este método utiliza formaldehído complejos RNA-PKR la reticulación y la inmunoprecipitación para enriquecer PKR-limite RNAs. Estos RNAs pueden analizarse más a través de la secuenciación de alto rendimiento o qRT-PCR.

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Este protocolo proporciona un método para identificar los interactores de ARN de una proteína de unión al ARN PKR de una manera de todo el genoma. Nos ayuda a entender mejor la regulación post-transcripción de la expresión génica por la proteína de unión al ARN. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza un reticulación eficiente del formaldehído para fijar RNase unido a proteínas de unión al ARN y enriquecerlas a través de la inmunoprecipitación.La PKR activada se observa en pacientes con enfermedad neurodegenerativa, como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Identificar la RNase de doble cadena que interactúa con PKR nos ayudará a comprender mejor la patogénesis de estas enfermedades degenerativas. Este método se puede utilizar para estudiar los interactores de ARN de cualquier proteína de unión al ARN.En particular, creemos que este método es útil para estudiar proteínas que reconocen la RNase estructurada, como la RNase de doble cadena. Compruebe la homogeneidad de la muestra de ciclo arrestado antes de cosechar las células. Además, es fundamental optimizar la eficiencia de la inmunoprecipitación utilizando el mejor anticuerpo disponible.Para empezar, sembra 750,000 o un millón de células HeLa para muestras arrestadas en S o M-fase, respectivamente. Crecer células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 24 horas. Tratar las células con timidina de dos milímetros e incubar a 37 grados centígrados durante 18 horas.Lave las células dos veces con PBS. Luego, agregue medios nuevos e incubar a 37 grados centígrados durante nueve horas. Para las células arrestadas en fase S, trate las células con timidina de dos mililitros.Para las células arrestadas en fase M, trate las células con 100 nanogramos por mililitro de nocodazol. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 horas. Para una muestra de fase S, recoja las células con un rascador de células y transfiera a un tubo cónico de 15 mililitros.Para obtener una muestra de fase M, toque el lado de la placa de cultivo celular para separar las células arrestadas en fase M y transfieralas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 380 g a temperatura ambiente durante tres minutos. Retire el sobrenadante y resusppend las células con un mililitro de PBS frío.Transfiera las células al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados centígrados durante 30 segundos, y retire los sobrenadantes por completo. Para realizar la reticulación de formaldehído, primero agregue 750 microlitros de 0.1%paraformaldehído a las células, e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos para fijar las células.Luego, agregue 250 microlitros de glicina un molar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales para apagar la reacción. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados Celsius durante 30 segundos. Retire los sobrenadantes por completo.A continuación, resuspend con un mililitro de PBS. Centrifugar las células a 10.000 g a cuatro grados centígrados durante 30 segundos, y retire el sobrenadante. Resuspender con 400 microlitros de tampón de lysis fCLIP complementado con 0.2 volume percent proteasa inhibitor y dos volume percent inhibidor de la RNase.Incubar sobre hielo durante 10 minutos, y sonicar usando un ultrasonicador. A continuación, agregue 11 microlitros de cloruro sódico de cinco molares para ajustar la concentración de cloruro de sodio a 150 mililitros y vórtice brevemente. Luego, centrifugar a 21, 130 g a cuatro grados Celsius durante 15 minutos.Transfiera los sobrenadantes a un tubo de microcentrífuga pre-refrigerado de 1,5 mililitros. Para realizar la inmunoprecipitación, primero agregue 20 microlitros de cuentas de proteína A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, lave las perlas con 400 microlitros de tampón de lylisis fCLIP.Centrifugar las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. A continuación, retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lysis fCLIP con cuidado, y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces. Repita el paso de lavado tres veces.Después del lavado final, retire los sobrenadantes por completo. Resuspender las perlas en 300 microlitros de tónifico de lysis fCLIP. Añadir 8,3 microlitros de cloruro sódico de cinco molares para ajustar la concentración de cloruro de sodio a 150 mililitros.Añadir 10 microlitros de anticuerpos activados por ARN de proteína quinasa e incubar un rotador a cuatro grados centígrados durante tres horas. A continuación, centrifugar las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lavado fCLIP y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces.Repita el paso de lavado dos veces. Después del lavado final, retire los sobrenadantes por completo. A continuación, agregue 300 microlitros de litato e incubar a cuatro grados centígrados en un rotador durante tres horas.Luego, centrifuga las cuentas a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante, agregue 400 microlitros de tampón de lavado fCLIP y resuspender suavemente las perlas invirtiendo de tres a cuatro veces. Repita el paso de lavado tres veces.Después del lavado final, retire el sobrenadante por completo. A continuación, agregue 300 microlitros de búfer de elución fCLIP. Incubar en un ThermoMixer a 25 grados Celsius durante tres horas para eluir proteína quinasa RNA-activado de las cuentas.Centrifugar a 1.000 g a temperatura ambiente, y transfiera los sobrenadantes a un tubo limpio siliconizado. Por último, añadir 300 microlitros de Proteinase K e incubar durante la noche a 65 grados centígrados. La eficiencia de la detención del ciclo celular de las células de HeLa en la fase S o M se examinó utilizando FACS.El anticuerpo D7F7 mostró una capacidad superior para inmuno precipitar el ARN de la proteína quinasa activado. El análisis de la mancha occidental de inmuno pkR precipitado o el lysato total de HeLa mostró sólo una banda fuerte correspondiente al tamaño de PKR, lo que indica que el anticuerpo D7F7 es muy específico en el reconocimiento de PKR. El uso de diferentes anticuerpos PKR con diferente eficiencia de inmunocir precipitación, dio lugar a una distribución de clase diferente de lecturas de secuenciación de mapas.Se observó una disminución de la señal de radioisótopo para la RNase inmunopropitada PKR tras la eliminación exitosa del ARNR. La muestra de ARN inmunoeprecipitado PKR mostró un fuerte enriquecimiento de la Rnase mitocondrial en comparación con los controles negativos. Se utilizó la transcripción inversa específica de Strand para distinguir la RNase mitocondrial de hebra pesada y ligera que fueron inmunomunprecipitadas con PKR para células arrestadas por fase S o M.El paso más crítico en la preparación de la muestra de detención del ciclo celular es donde debe lavar las células dos veces con PBS y donde debe recoger sólo las células pastel para la homogeneidad o sería la muestra deteriorada. Para el proceso ético, los pasos más críticos son el reticulación y la cantidad de formaldehído. Después de este procedimiento, los ARN eluidos se pueden analizar usando la hinchazón del norte, el PCR qRT o la secuenciación de alto rendimiento.Estos experimentos pueden identificar el tipo y la cantidad relativa de RNase enlazado a PKR. Esta técnica se puede aplicar para estudiar e identificar los interactores de ARN de las proteínas de unión al ARN que mejorarán nuestra comprensión de la regulación post transcripcional de la expresión génica, mediada por proteínas de unión al ARN. El formaldehído es peligroso, por lo que la fijación, la solución y el tampón de lavado inicial deben manipularse con precaución.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

Este manuscrito describe un enfoque para aislar RNPs afines seleccionados formados en células eucariotas a través de un enriquecimiento específico dirigido a oligonucleótidos. Demostramos la aplicabilidad de este enfoque mediante el aislamiento de un RNP afín unido a la región no traducida retroviral 5' que está compuesta por DHX9/ARN helicasa A.

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

Presentamos dos protocolos de sincronización celular que proporcionan un contexto para el estudio de eventos relacionados con fases específicas del ciclo celular. Mostramos que este enfoque es útil para analizar la regulación de genes específicos en un ciclo celular no perturbado o en la exposición a agentes que afectan el ciclo celular.

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Presentamos un protocolo para sincronización de timidina doble de células HeLa, seguido por el análisis mediante microscopía confocal de alta resolución. Este método es clave para la obtención de gran número de células que proceden síncrono de fase S de la mitosis, lo que permite estudios sobre roles mitotic de proteínas multifuncionales que también poseen las funciones de interfase.

Combina la sincronización celular mitótica y microscopia Confocal de alta resolución para estudiar el papel de las proteínas multifuncional ciclo celular durante la Mitosis

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

La reticulación cinética y el análisis del ADNc es un método que permite la investigación de la dinámica de las interacciones proteína-ARN en células vivas a alta resolución temporal. Aquí se describe el protocolo en detalle, incluido el crecimiento de células de levadura, la reticulación UV, la recolección, la purificación de proteínas y los pasos de preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación.

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.

Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños

Aprende a identificar interactores de ARN de PKR mediante formaldehído y inmunoprecipitación en células HeLa. Este método permite estudiar la regulación postranscripcional y su relación con enfermedades neurodegenerativas.

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

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