Cirugía de nervios faciales en el modelo de rata para estudiar la inhibición y regeneración axonal
5 de mayo de 2020
Este protocolo describe un enfoque reproducible para la cirugía del nervio facial en el modelo de rata, incluyendo descripciones de varios patrones inducibles de lesión.
Este protocolo puede ayudar a los científicos a estudiar los resultados después de una lesión del nervio facial y métodos para mejorar la regeneración a través de muchos parámetros diferentes. La principal ventaja de esta técnica es que la anatomía de la rata permite un fácil acceso al nervio facial, y su gran escala nos permite estudiar todos los patrones de lesión relevantes. Las aplicaciones de esta técnica se extienden hacia la rehabilitación de los pacientes después de una lesión del nervio facial.
Como potencial regenerativo, la rata proporciona un modelo experimental reproducible y conciso. Y este método puede proporcionar información sobre terapias quirúrgicas y médicas para paresia o parálisis de nervios faciales. Y es traducible a otros modelos de cabeza y cuello u otros nervios periféricos.
Operar bajo un microscopio con ambas manos puede ser un desafío. Recomiendo practicar usando la versión binocular bajo el microscopio antes de intentar una disección del nervio facial. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la cabeza, aplicar ung mento en los ojos de la rata y afeitar el área quirúrgica.
Establecer un método para la identificación de ratas y colocar un rollo de gasa debajo del cuello. Desinfectar la piel expuesta con tres exfoliantes de clorhexidina alterna y 70% de etanol y colocar la rata bajo un microscopio estéreo. Manipular el oído ipsilateral en una dirección anterior-posterior para determinar el plegado natural de la piel postauricular.
Utilice una hoja número 15 para hacer una incisión de dos a tres milímetros en el pliegue postauricular. La planificación y la colocación de la incisión son los pasos más críticos para garantizar una identificación fiable del nervio facial y minimizar el tamaño de la herida. Diseccionar con descontento a través de la fascia subcutánea inmediata y colocar un retractor micro-Weitlaner para mejorar la exposición al tejido.
Identifique el músculo gástrico anterior a medida que viaja en una dirección inferior a superior hacia su inserción a lo largo de la base del cráneo. Se extiende suavemente a través del vientre muscular a lo largo del punto de inserción muscular para revelar el tendón del vientre lístric anterior. El tendón aparecerá como un proceso blanco filmado que emana del músculo con una inserción sólida en la base del cráneo.
Después de la identificación del músculo ritocuestric anterior y su tendón, ajuste el retractor Weitlaner para retraer aún más el vientre muscular. La región expuesta es el espacio tridimensional en el que se encuentra el tronco principal del nervio facial. Diseccionar a lo largo del nervio en una dirección inferior distalmente desde la salida del foramen estilomasmoide.
Para inducir un patrón de lesión por aplastamiento, utilice los fórceps del joyero de superficie lisa para agarrar y comprimir firmemente el nervio aplicando presión constante y reproducible durante 30 segundos para asegurar una lesión de aplastamiento adecuada. Para una simple transección, agarre el epineurio inmediato sobrelying el nervio con fórceps de dientes finos, y utilice microscisores agudos para transecto limpiamente el nervio en el punto deseado con un solo corte. Para un modelo de separación nerviosa, utilice pinzas ajustables para establecer la longitud deseada de la brecha del nervio nervioso para asegurar patrones de lesiones similares entre los animales y transecte el nervio como se acaba de demostrar.
Después de la lesión experimental ha sido entregada, irrigar la herida con solución salina estéril y secar el tejido con gasa estéril. antes de cerrar la incisión cutánea de acuerdo con las pautas institucionales. Aquí, se muestran imágenes en vivo del tronco principal del nervio facial con una lesión por aplastamiento aproximadamente de dos a tres milímetros de distal hasta el punto de rama de la primera PES en una rata Thy1-GFP transgénica adulta.
La evaluación del retorno gradual de la fluorescencia a una, dos, tres y cuatro semanas después de la lesión se puede utilizar como marcador para monitorear la regeneración nerviosa en estos animales transgénicos. El análisis histomorfométrico se puede utilizar para obtener imágenes transversales de la división mandibular marginal que permiten cuantificar el diámetro axonal, la cantidad de desechos, la fibra nerviosa, el porcentaje de nervio y las mediciones de densidad. Es importante ajustar con frecuencia la colocación del retractor según sea necesario para asegurarse de que los nervios anatómicos relevantes son visibles al identificar el nervio facial.
Después de este procedimiento, los nervios y músculos relevantes se pueden cosechar para el análisis inmunohistoquímico para evaluar el grado de regeneración en relación con otros grupos experimentales. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para los investigadores en el estudio de los resultados funcionales después de la lesión del nervio facial. Específicamente, cómo hacer el fenómeno de la sinquinesis.
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Descripción general
Este protocolo describe un enfoque reproducible para la cirugía del nervio facial en un modelo de rata, centrándose específicamente en los patrones de lesión y los resultados regenerativos. Facilita la investigación de técnicas quirúrgicas y terapias médicas para la rehabilitación tras lesiones del nervio facial.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Medicina Regenerativa
- Modelos Animales
Antecedentes
- El modelo de rata proporciona un acceso sencillo al nervio facial.
- Esta técnica quirúrgica puede ayudar a evaluar métodos de lesión y regeneración nerviosa.
- Las características anatómicas de la rata permiten un estudio detallado de diferentes patrones de lesión.
Objetivo del estudio
- Evaluar enfoques terapéuticos para la parálisis o paresia del nervio facial.
- Mejorar la comprensión de la regeneración tras lesiones del nervio facial.
- Desarrollar una técnica quirúrgica detallada que sea replicable entre estudios.
Métodos Utilizados
- El estudio emplea un modelo de rata para la intervención quirúrgica sobre el nervio facial.
- Los procedimientos clave incluyen una lesión por aplastamiento y una sección, con pasos quirúrgicos específicos descritos para garantizar fiabilidad.
- Se utilizan imágenes en vivo y análisis histomorfológicos para monitorear los resultados de la regeneración.
- Se destaca la disección metódica bajo microscopio, que requiere habilidad y preparación.
Resultados Principales
- La visualización y manipulación exitosas del nervio facial permiten evaluar los procesos regenerativos.
- El análisis mediante imágenes de fluorescencia y análisis histomorfométrico proporcionan medidas cuantificables de la recuperación del nervio.
- La técnica revela información importante sobre los fenómenos de sincinesia tras una lesión nerviosa.
Conclusiones
- Este estudio establece un protocolo fundamental para analizar la lesión y la regeneración del nervio facial.
- Permite a los investigadores explorar los resultados funcionales y los enfoques terapéuticos en la rehabilitación neural.
- La metodología demuestra implicaciones significativas para aplicaciones más amplias en estudios de nervios periféricos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo de lesión del nervio facial en ratas proporciona una plataforma reproducible para evaluar la regeneración y la inhibición axonal, lo que apoya la validación de dianas en el desarrollo de terapias neuroregenerativas. Su escalabilidad y accesibilidad anatómica permiten una evaluación consistente de los patrones de lesión y las respuestas regenerativas, facilitando la reducción de riesgos preclínicos de candidatos neurotróficos o antiinhibitorios. Este modelo conecta la investigación básica y la investigación traslacional al ofrecer indicadores histomorfométricos y funcionales cuantificables relevantes para las estrategias de reparación del nervio facial humano.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de inhibición axonal y las vías regenerativas tras lesiones definidas por aplastamiento, sección o brecha del nervio.
- Valor operativo: Facilita la administración consistente de fármacos neuroactivos o células para evaluar la interacción con el blanco y la modulación de vías.
- Valor predictivo: La cuantificación histomorfométrica del diámetro axonal, la densidad de fibras y la eliminación de restos celulares proporciona métricas objetivas para evaluar la eficacia del blanco y reducir riesgos mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayos: Genera modelos estandarizados de lesión adecuados para la selección de alta reproducibilidad de compuestos proregenerativos o antagonistas inhibidores.
- Resultados cuantitativos: La imagenología en vivo de axones marcados con fluorescencia y el análisis histomorfológico permiten un seguimiento longitudinal y cuantificable de la regeneración.
- Escalabilidad: El modelo en rata permite la manipulación quirúrgica desde segmentos nerviosos intracraneales hasta extratemporales, facilitando la evaluación multiparamétrica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la evaluación de la recuperación funcional y la mitigación de la sincinesia, alineándose con los puntos finales clínicos en la rehabilitación del nervio facial.
- Modelado Preclínico: Permite evaluar manipulaciones centrales o de órganos diana, así como terapias celulares, en un sistema de nervios periféricos relevante para la enfermedad.
- Avance Ajustado al Riesgo: Tasas de supervivencia confiables y consistencia entre especies respaldan las decisiones de avance o interrupción antes de la traslación a especies de orden superior.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El modelo se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento al permitir la validación de dianas mediante lesión nerviosa controlada, avanzando hacia el desarrollo de ensayos para la selección de compuestos, y apoyando la evaluación preclínica de terapias regenerativas mediante medidas de resultados funcionales y estructurales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre inhibidores y promotores del crecimiento axonal mediante paradigmas estandarizados de lesión.
- Selección: Proporciona modelos reproductibles de lesión nerviosa para evaluar los efectos de compuestos sobre la cinética y fidelidad de la regeneración.
- Análisis: Las mediciones histomorfológicas y basadas en fluorescencia ofrecen datos cuantificables para el análisis de respuesta a la dosis y la interacción con el blanco.
- Investigación Traductiva: Relaciona las métricas de regeneración axonal con resultados funcionales como la sincinesia, reforzando su relevancia clínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma quirúrgica reutilizable para pruebas iterativas en múltiples modalidades terapéuticas y puntos temporales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de regeneración axonal mediante métricas cuantificables y reproducibles de lesión y regeneración.
- Valor operativo: Las técnicas quirúrgicas estandarizadas y los protocolos de evaluación posoperatoria mejoran la consistencia entre laboratorios y la fiabilidad de los datos.
- Valor estratégico: Informa decisiones tempranas de continuar/no continuar al aclarar la biología del blanco y reducir el riesgo de fracaso en programas neuroregenerativos de etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos neuroregenerativos basada en la modulación validada del blanco en un modelo clínicamente relevante de nervio periférico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía y conocimiento de la neuroanatomía de roedores bajo guía estereomicroscópica.
- Depende de instrumentos especializados, incluyendo retractores micro-Weitlaner, pinzas de joyero, tijeras microquirúrgicas y calibradores ajustables para la inducción estandarizada de lesiones.
- Necesita líneas transgénicas marcadoras (por ejemplo, Thy1-GFP) o procesamiento inmunohistoquímico para el seguimiento longitudinal de axones y análisis histomorfológico.
- Exige protocolos de cuidados posoperatorios para asegurar la supervivencia de las ratas y minimizar variables confusas en la evaluación de la regeneración.
- La escasa trazabilidad genética en comparación con los modelos murinos puede limitar el análisis mecanicista mediante enfoques de knockout o sobreexpresión génica.
