Name: Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a utilizar la entrega mejorada por convección guiada por RMN para introducir vectores virales optogenéticos en la corteza de macacos. Este método permite la manipulación de la actividad neural a gran escala con expresión uniforme.

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Este trabajo fue apoyado por la beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AY), la Reorganización de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y la Plasticidad para Acelerar la Recuperación de Lesiones (REPARACION; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, y por el Centro de Imágenes de Neurociencia UCSF. Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shiver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio K12HD073945, el Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington (WaNPCR, P51 OD010425), y el Centro de Neurotecnología (CNT, un Centro de Investigación de Ingeniería de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Díaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani y Blakely Andrews por su ayuda con los experimentos y Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz y Toni Haun por su ayuda técnica.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus sitios) de la Universidad de California, San Francisco y cumplen con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El siguiente procedimiento se realizó utilizando dos macacos machos adultos de 8 y 7 años de edad, con un peso de 17,5 kg y 16,5 kg (mono G y mono J), respectivamente.
NOTA: Utilice técnicas asépticas estándar para todos los procedimientos quirúrgicos.
1. Imágenes de línea de base
<ol><li>Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general bajo isoflurano (concentración cambiada entre 0 a 5% según sea necesario, dependiendo de los signos vitales como la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca). Controle la temperatura del animal, la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno, las respuestas electrocardiográficas y la presión parcial final del CO2 durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Coloque el animal en un marco estereotaxico compatible con MR (consulte la Tabla de Materiales)en el que permanecerá durante todo el procedimiento. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y llévelo al escáner de RMN (3 T).</li>
	<li>Adquirir T1 estándar (ángulo de volteo a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 668,6, tamaño de matriz: 192 x 192 x 80, espesor de la rebanada 1 mm) y T2 (ángulo de volteo a 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 52,5, tamaño de matriz a 256 x 256 x 45, espesor de la rebanada a 1 mm) imágenes anatómicas MR como imágenes anatómicas MR referencia y para la planificación quirúrgica.</li>
	<li>Recuperar al animal de la anestesia y transportarlo a la zona de alojamiento de los animales.</li>
	<li>Utilice las imágenes T1 y T2 adquiridas para determinar la colocación de la craneotomía. La ubicación de la craneotomía se puede determinar con precisión haciendo coincidir el área cortical de interés de RM con el atlas cerebral macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). Además, estas imágenes de referencia pueden proporcionar una estimación de las ubicaciones de la perfusión viral. Las regiones corticales de interés que se muestran aquí son M1 y S1.</li>
</ol>2. Implantación de cámara compatible con RM
<ol><li>Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general con monitoreo anestésico estándar como en 1.1.</li>
	<li>Coloque el animal en el marco estereotaxico compatible con RM en el que permanecerá durante la implantación de la cámara y la administración de vectores virales. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con MR portátil.</li>
	<li>Crear una incisión sagital aproximadamente 2 cm de la línea media con una longitud de unos 5 cm con un bisturí.</li>
	<li>Retire el tejido blando subyacente del cráneo con ascensores (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Crear una craneotomía circular (2,5 cm de diámetro) para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando un trephine (ver Tabla de Materiales).<ol>
<li>Baje el punto de centrado del trephine más allá del borde de la trephine. Crear una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profundo en el cráneo para anclar la trephine usando el punto de centrado ajustable de la trephine. Tenga cuidado para evitar penetrar completamente a través de la profundidad del cráneo, ya que esto podría causar daño al tejido neural subyacente.</li>
		<li>Enjuague periódicamente el área con salina según sea necesario para mantener la humedad tisular a lo largo de la craneotomía.</li>
		<li>Una vez que se haya hecho el centro, baje el trephine sobre el cráneo y gire el trephine en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión descendente hasta que la tapa ósea se pueda extraer con fórceps. Tenga cuidado para evitar dañar el tejido subyacente con la trefina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enhebrar una sutura fina (tamaño 6-0) a través de la dura en el centro de la craneotomía y levantar la dura tirando suavemente de la sutura de la superficie del cerebro creando una tienda de campaña en el centro de la craneotomía.</li>
	<li>A continuación, perforar la dura cerca del centro de la tienda usando tijeras oftálmicas finas para evitar dañar el cerebro. A continuación, corte la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continúe a lo largo del borde con tijeras opthalmic finas.</li>
	<li>Monte la cámara cilíndrica compatible con CED a medida cED MR (Figura1; ver sección 4 para obtener instrucciones de producción) en el cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de CED de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo.</li>
	<li>Fije los implantes al cráneo con tornillos de plástico y acrílico dental o algunos tornillos de titanio.</li>
</ol>3. Entrega de vectores virales
<ol><li>Poco después de implantar la cámara compatible con MR e insertar la rejilla de inyección de cánula (Figura1A-B, Figura suplementaria 1) en la cámara, llenar la rejilla con salina (0,9% NaCl) para visualizar los lugares de inyección a través de imágenes anatómicas de RM y llenar las cavidades de la cámara con gelatina absorbible estéril húmeda para mantener la humedad del cerebro (Figura 1F).</li>
	<li>Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM. Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva.</li>
	<li>Mientras el animal permanece intubado, desconecte el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y transporte al animal al escáner de RMN.</li>
	<li>Adquiera las imágenes T1 (ángulo de giro a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco, 668,6, tamaño de matriz 192 x 192, espesor de la rebanada de 1 mm, 80 rodajas) para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección (Figura2A). Utilice la herramienta de regla del software de imágenes MR para medir la distancia entre la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical.</li>
	<li>Adquiera imágenes de T2 (ángulo de volteo de 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco 52,5, tamaño de matriz 256 x 256, espesor de la rebanada a 1 mm, 45 rodajas) para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del lugar de perfusión objetivo (Figura2B-C). Como se mencionó anteriormente, la cuadrícula de cánulas está llena de salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión.</li>
	<li>Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el gadoteridol del agente de contraste MR (Ratio de 250:1; 2mM Gd-DTPA, ver Tabla de Materiales)por pipeta o mezcla de vórtice. NOTA: La técnica presentada se probó para vectores AAV con un promotor CamKIIa expresión de conducción de C1V1 fusionado a EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 moléculas de virus/ml; ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Cargue el virus mezclado en un tubo IV de alta presión de 0,2 ml (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Establezca un campo estéril fuera del escáner de RMN para preparar la línea de perfusión viral.</li>
	<li>Utilizando tubos IV de alta presión, conecte una larga línea de extensión (aproximadamente 3-5 metros, dependiendo de la ubicación de la bomba de perfusión con respecto al orificio de RM) a una jeringa de 3 ml compatible con RM y ceba con solución salina.</li>
	<li>Conecte el extremo distal de la línea de extensión larga al extremo proximal del tubo IV de 0,2 ml cargado con el virus y conecte la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de 1 mm (Figura2D;ver sección 5 para las instrucciones de producción de cánulas) al extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera (ver Tabla de Materiales)(Figura2E).</li>
	<li>Por último, coloque la jeringa en una bomba compatible con MR (ver Tabla de materiales). Coloque el controlador de la bomba en la sala de control del escáner, ya que no es compatible con MR.</li>
	<li>Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas antes, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo. Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril.</li>
	<li>Iniciar la perfusión a una velocidad de 1 l/min y validar visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido desde la punta de la cánula.</li>
	<li>Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección a la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.</li>
	<li>Adquiera imágenes ponderadas rápidas (2 minutos) tensas T1 (ángulo de volteo a 30o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 3,05, tamaño de matriz 128 x 128, espesor de la rebanada de 1 mm y 64 rodajas) para el monitoreo en línea de la perfusión vectorial viral.</li>
	<li>Después de infundir 10 l del vector de tal manera que se infunde suficiente virus para detectar en el escáner de RM, obtener imágenes de RM para verificar la colocación correcta de la cánula como lo demuestra la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción como en 3.12.</li>
	<li>Supervise la perfusión a través de la orientación de imágenes de RM en línea (flash T1 ponderado) y aumente la velocidad de perfusión a 5 l/min en 1 l/min cada pocos minutos (figura3A).</li>
	<li>Después de infundir aproximadamente 40 l del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en pasos de 1 L/min y detenga la perfusión después de que se inyecte 50 l y deje la cánula en su lugar durante 10 minutos.</li>
	<li>Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Repita los pasos 3.9 a 3.19 para cada ubicación.</li>
	<li>Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones, antes del transporte animal. A continuación, transportar el animal de vuelta al quirófano.</li>
	<li>Explantar la cámara compatible con RM y cerrar la incisión quirúrgica reemplazando el colgajo óseo y el músculo que cubre y suturando la piel utilizando técnicas asépticas estándar o reemplazar la cámara con un cilindro de titanio y dura artificial (ver 20169) para el registro y la estimulación neuronal.</li>
</ol>4. Producción de cámara compatible con MR
<ol><li>Fabricar la rejilla de inyección de cánula de nylon (Figura1A-B) mecanizando de acuerdo con las dimensiones especificadas (FiguraSuplementaria 1).</li>
	<li>Imprima en 3D el cilindro compatible con MR de acrilonitrilo butadieno estireno (plástico ABS0 (Figura 1C-E) (véase Archivo suplementario 1–3; véase Tabla de materiales para impresoras y materiales 3D). NOTA: Un diseño mantiene una rejilla de inyección de cánula fija dentro del cilindro compatible con MR (Figura1C),mientras que otro permite la rotación de la rejilla, extendiendo la región de inyección (Figura1D-E).</li>
	<li>Enrosque la rejilla de inyección de cánula y toque la cavidad correspondiente de la cámara compatible con MR de forma que ambas piezas exhiban el mismo roscado. NOTA: Se puede utilizar cualquier tipo de subprocesamiento siempre que ambos componentes tengan el mismo subproceso.</li>
	<li>Inserte la rejilla de inyección de cánula de nylon atornillando el orificio roscado del cilindro compatible con MR.</li>
</ol>5. Producción de cánulas resistente al reflujo13
<ol><li>Corte un tubo de sílice de 30 cm de largo con 0,32 mm ID y 0,43 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice interior (ver Tabla de Materiales)utilizando una cuchilla de afeitar.</li>
	<li>Corte un tubo de sílice de 7,5 cm de largo y un tubo de sílice de 5 cm de largo con 0,45 mm ID y 0,76 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice exterior (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Adherir el tubo exterior de 7,5 cm al tubo interior de 30 cm con cianoacrilato de tal manera que el tubo interior se extienda 1 mm más allá del tubo exterior, haciendo que el paso resistente al reflujo (Figura2D). Para asegurarse de que el cianoacrilato no entre en el interior del tubo interior, coloque el cianoacrilato en el exterior del tubo interior lejos de la punta de la cánula.</li>
	<li>Pegue el tubo de sílice de 5 cm de largo en el otro extremo del tubo interior para su fijación al conector del catéter estilo abrazadera (ver paso 3.10).</li>
</ol>

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</ol>

PNS tiene interés financiero en Neuralink Corp., una empresa que está desarrollando terapias clínicas utilizando estimulación cerebral.

Aquí, delineamos una técnica factible y eficiente para lograr la expresión optogenética a gran escala en la corteza primaria somatosensorial y motora de NHP por CED guiada por RMN. El uso de CED guiado por RMN presenta ventajas significativas sobre los métodos tradicionales de infusión viral en el cerebro NHP. Una de estas ventajas es la capacidad de lograr la expresión en grandes áreas con menos infusiones necesarias. Por ejemplo, con métodos convencionales, múltiples inyecciones de 1-2 l de la expresión de rendimiento ...

La optogenética es una potente herramienta que permite la manipulación de la actividad neuronal y el estudio de las conexiones de red en el cerebro. La implementación de esta técnica en primates no humanos (NCP) tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la computación neuronal a gran escala, la cognición y el comportamiento en el cerebro de los primates. Aunque la optogenética se ha implementado con éxito en los NCP en los últimos años1,2,3,4,5,6,7, un reto que los investigadores se enfrentan está alcanzando altos niveles de expresión en grandes áreas cerebrales en estos animales. Aquí, estamos proporcionando un enfoque eficiente y simplificado para lograr altos niveles de expresión optogenética en grandes áreas de la corteza en macacos. Esta técnica tiene un gran potencial para mejorar los estudios optogenéticos actuales en estos animales en combinación con la grabación de última generación8,9 y la estimulación óptica10 tecnologías.
La entrega mejorada por convección (CED) es un método establecido de entrega de agentes farmacológicos y otras moléculas grandes, incluidos los vectores virales, al sistema nervioso central11,12,13. Mientras que los métodos de administración convencionales implican múltiples infusiones de bajo volumen distribuidas en pequeñas regiones del cerebro, CED puede lograr una distribución más amplia y uniforme de los agentes con menos perfusiones. El flujo de fluido a granel (convección) impulsado por presión durante la perfusión permite una transducción distribuida más ampliamente y uniformemente del tejido objetivo al administrar vectores virales con CED. En estudios recientes, demostramos la transducción y posterior expresión optogenética de grandes áreas de masilla primaria (M1) y somatosensorial (S1) cortices9 y thalamus14 utilizando Resonancia magnética (MR) guiada por CED.
Aquí, delineamos el uso de CED para lograr la expresión optogenética en grandes áreas corticales con sólo unas pocas inyecciones corticales.

<table><tbody><tr><td>Tubo intravenoso de alta presión de 0,2 ml</td><td>Smiths Medical Inc., Dublín, OH, EE. UU</td><td>. 533640</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de sílice de 0,32 mm de diámetro interior, 0,43 mm de diámetro exterior</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm de diámetro interior, 0,76 mm de diámetro exterior Tubo de sílice</td><td>Polymicro Technologies 1068150625</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, Universidad de Pensilvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS plástico</td><td>Stratasys, MN, EE. UU.</td><td>Absplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Cortina de incisión antimicrobiana</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Cortina</td></tr><tr><td>Ioban Acrílico dental</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Agente de unión acrílica</td></tr><tr><td>Ascensores VWR</td><td>International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Elevador Langenbeck, punta ancha</td></tr><tr><td>Sutura fina</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Láser para estimulación lumínica</td><td>Omicron-Laserage, Alemania</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR compatible con jeringa de 3 cc</td><td>Aparato Harvard, Holliston, MA, EE. UU.</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>Software de imágenes por resonancia</td><td>magnética Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>Compatible con resonancia magnética Bomba</td><td>Aparato Harvard, Holliston, MA, EE. UU.</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico compatible con RM</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Style Catéter Connector</td><td>B-Braun, Bethlehem, PA, EE. UU</td>. N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Tornillos de plástico</td><td>Plásticos 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>Tornillos de nailon</td></tr><tr><td>Tornillos de titanio</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Tornillos óseos autorroscantes</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,SKU</td><td>:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE Impresora 3D</td><td>Stratasys, MN, EE. UU</td>. N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula de vitamina E</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina húmeda estéril absorbible</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Espuma de gel</td></tr></tbody></table>

convección mejorada entrega de vector viral asociado a adeno optogenético a la corteza de rhesus macaque bajo guía de imágenes de rmn en línea

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

En la optogenética de primates no humanos (NHP), infectar grandes áreas corticales con vectores virales es a menudo una tarea difícil y que requiere mucho tiempo. Aquí, demostramos el uso de resonancia magnética (RM) convección guiada entrega mejorada (CED) de vectores virales optogenéticos en corticas primarias somatosensoriales (S1) y motor (M1) de macacos para obtener una expresión cortical eficiente y generalizada de canales ióniones sensibles a la luz. Los vectores virales asociados a adenos (AAV) que codifican las opsin C1V1 de desplazamiento rojo fusionadas a proteínafluorescentes amarillas (EYFP) se inyectaron en la corteza de macacos de resus bajo CED guiado por RMN. Tres meses después de la infusión, imágenes epifluorescentes confirmaron grandes regiones de expresión optogenética (>130 mm2) en M1 y S1 en dos macacos. Además, pudimos registrar respuestas electrofisiológicas fiables de las áreas de expresión mediante matrices microelectrocortigráficas. El análisis histológico posterior y la inmunomancha contra el reportero revelaron una expresión optogenética generalizada y densa en M1 y S1 correspondiente a la distribución indicada por imágenes epifluorescentes. Esta técnica nos permite obtener expresión en grandes áreas de la corteza en un período de tiempo más corto con un daño mínimo en comparación con las técnicas tradicionales y puede ser un enfoque óptimo para el parto viral optogenético en animales grandes como los NCP. Este enfoque demuestra un gran potencial para la manipulación a nivel de red de circuitos neuronales con especificidad de tipo celular en modelos animales evolutivamente cerca de los seres humanos.

Entrega mejorada por convección (CED) bajo la Guía de RMN
La propagación del vector viral se monitorizó durante la perfusión de CED bajo la guía de imágenes de RM en línea (Figura3A). En este estudio, S1 y M1 de dos monos fueron atacados (Figura3B). Los volúmenes de distribución tridimensional se estimaron en un análisis post-hoc de las imágenes de RM (...

Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

La convección mejorada entrega, o CED, de vectores virales optogenéticos en primates no humanos permitirá a los investigadores manipular la actividad neuronal a gran escala para entender los cálculos y comportamientos neuronales complejos. Con CED podemos lograr una alta expresión optogenética a través de grandes regiones del cerebro de primate con sólo unas pocas inyecciones en un corto período de tiempo en comparación con los métodos tradicionales. La resonancia magnética o la implantación de cámara compatible con RMN se realiza utilizando la práctica estándar en cirugías de primates no humanos, el procedimiento se describe en detalle en el protocolo de texto y se describe brevemente en este video.Después de la sedación animal, posicionamiento e incisión inicial como se describe en el protocolo de texto, crear una craneotomía circular para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando una tretelina. Crea una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profunda en el cráneo para anclar la tretina usando el punto de centrado ajustable de la tretina. Una vez que se ha hecho el centro, baje la trephine sobre el cráneo y gire la tretela en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión hacia abajo hasta que la tapa ósea se pueda quitar con fórceps.Después de levantar la dura como se detalla en el protocolo de texto, cortar la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continuar a lo largo del borde con finas tijeras oftálmicas. Monte la cámara compatible con RM de entrega mejorada de convección hecha a medida cilíndrica al cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo. Fije los implantes al cráneo usando tornillos de plástico y acrílico dental o unos pocos tornillos de titanio.Poco después de implantar la cámara compatible con RM e insertar la rejilla de inyección de cánula en la cámara, llene la rejilla con 0,9% de solución salina para visualizar las ubicaciones de inyección a través de imágenes anatómicas de RMN. También llene las cavidades de la cámara con espuma de gel estéril húmeda absorbible para mantener la humedad del cerebro. Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM.Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva. Mientras el animal permanece intubado, desprende el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RMN portátil. Transporte al animal al escáner de resonancia magnética.Adquiera imágenes T1 para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en las imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección. Adquiera imágenes T2 para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del sitio específico de la perfusión.La cuadrícula de cánulas está llena de solución salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión. Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el agente de contraste MR gadoteridol por pipeta o mezcla de vórtice.Cargue el virus mezclado en tubo IV de alta presión de 0,2 mililitros. Con tubo IV de alta presión, conecte una línea de extensión larga a una jeringa de tres mililitros compatible con RMN y cebada con solución salina. Conecte el otro extremo del tubo de extensión larga al tubo de 0,2 mililitros IV cargado con el virus.A continuación, coloque la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de un mililitro en el extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera. Por último, ajuste la jeringa en una bomba compatible con MR. Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo.Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril. Comience la perfusión a una velocidad de un microlitro por minuto y valide visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido de la punta de la cánula. Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección hasta la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.Ahora adquiera imágenes ponderadas T1 flash rápido para la monitorización en línea de la infusión vectorial viral. Después de infundir aproximadamente 10 microlitros del vector de tal manera que se infunda suficiente virus para detectar en el escáner de RMN, obtenga imágenes de RMN para verificar la correcta colocación de la cánula como es evidente por la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción.Supervise la perfusión mediante la guía de imágenes de RM en línea. Aumente la velocidad de perfusión a cinco microlitros por minuto en un microlitro por minuto cada pocos minutos. Es importante aumentar lentamente la velocidad de perfusión y no exceder cinco microlitros por minuto, ya que las altas tasas de perfusión podrían causar daño tisular.Después de infundir aproximadamente 40 microlitros del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en un microlitro por minuto pasos. Detenga la perfusión después de inyectar aproximadamente 50 microlitros. Deje la cánula en su lugar durante diez minutos.Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones antes del transporte animal, luego transporte al animal de vuelta al quirófano. Los análisis histológicos en secciones coronales en serie revelan una expresión optogenética a gran escala alrededor de los sitios de perfusión.Aquí se muestra la imagen de RM coronal basal y la propagación del agente de contraste después de la perfusión para la misma rebanada coronal de RM. Una sección del tejido coronal se muestra aproximadamente de la misma. La tinción de peroxidasa refleja la expresión de la proteína fluorescente amarilla o del reportero de EYFP.Se observa una buena alineación entre el área de expresión EYFP, medida con epifluorescensa superficial y con tinción histológica. Estos incluyen la región de propagación vectorial estimada a partir de imágenes de RM. Los puntos blancos indican los sitios de inyección y toda la región negra representa el área expuesta por la craneotomía.Aquí se muestra una imagen de bajo aumento de las secciones coronales manchadas con anticuerpos anti GFP que muestran el aspecto lateral medial de la expresión de YFP en la corteza somatosensorial. La punta de flecha negra indica la ubicación de la pista de cánula. El tejido adyacente se muestra con un mayor aumento para mostrar la distribución laminar de las células positivas de YFP.Las regiones densamente pobladas de células positivas de YFP se encuentran predominantemente en las capas de dos a tres y cinco a seis. El agrandamiento adicional revela celdas piramidales típicas en las capas dos a tres, la capa cinco y la capa seis. Es importante dejar la cánula en su lugar durante 10 minutos después de que el flujo se haya detenido.Esto asegurará que el virus se haya percolado en el tejido neural objetivo circundante. CED es un enfoque eficiente para lograr niveles de expresión uniformemente altos en grandes regiones cerebrales en mamíferos. Tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de los circuitos neuronales y la conectividad.Después de la transducción viral por CED, los experimentos de estimulación optogenética posteriores se pueden emparejar con la grabación eléctrica y ensayos conductuales para revelar la dinámica de circuito complejo dentro del cerebro. Esta técnica ha sido empleada previamente por Yazdan-Shahmorad y sus colegas en 2018 en la que se utilizó la modulación neuronal optogenética para inducir cambios de conectividad en toda la red en la corteza motora sensorial.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Este protocolo describe los pasos y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI es una técnica novedosa que combina la lectura de fMRI de alto campo con la estimulación optogenética, lo que permite el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo.

RM funcional Optogenética

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Tal como se implementa actualmente, la optogenética en primates no humanos requiere la inyección de vectores virales en el cerebro. Un método de inyección óptimo debe ser confiable y, para muchas aplicaciones, capaz de dirigirse a sitios individuales de profundidad arbitraria que se identifican de manera fácil e inequívoca en la histología postmortem. Se presenta un método de inyección con estas propiedades.

Inyecciones de vectores AAV para optogenética en cerebro de primates no humanos anestesiados y despiertos

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Se describe una nueva técnica para la administración generalizada de virus adenoasociados que utiliza la infusión de virus subaracnoideos. Este método no solo asegura la transducción generalizada de las neuronas neocorticales de ratón en las capas superficiales, sino que también da lugar a la expresión selectiva del transgén en las neuronas piramidales de la capa cinco, incluso cuando se utiliza un promotor no selectivo.

Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Aprenda a utilizar la entrega mejorada por convección guiada por RMN para introducir vectores virales optogenéticos en la corteza de macacos. Este método permite la manipulación de la actividad neural a gran escala con expresión uniforme.

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea (Video) | JoVE Journal

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

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