Name: Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a analizar la proliferación de células madre neuronales adultas mediante manipulación quimio-genética de circuitos específicos. Este método permite evaluar el impacto de la actividad local en la neurogénesis con precisión.

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L.J.Q. fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo suplemento de diversidad R01MH111773, así como una beca de capacitación T32TS07431-20. Este proyecto fue apoyado por subvenciones otorgadas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160 y NS104530).

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132 (4), 645-660 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hippocampal+neurogenesis+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans.</a> Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).</li>
<li>Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+is+Sufficient+to+Reduce+Anxiety+and+Depression-Like+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors.</a> Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, (2009).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).</li>
<li>Anacker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+confers+stress+resilience+by+inhibiting+the+ventral+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus.</a> Nature. , 1(2018).</li>
<li>Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Phenotypic+Characterization+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Multiple+Labeling+with+Antibodies+from+the+Same+Host+Species+to+Study+Adult+Hippocampal+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-Phase+Labeling+of+Dividing+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optogenetic+Stimulation+of+the+Rodent+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+Optogenetics+in+Neural+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer Optogenetics in Neural Systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+Cells+Control+Adult+Neural+Stem+Cell+Quiescence+and+Maintenance+through+a+Dynamic+Balance+between+Direct+and+Indirect+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways.</a> Neuron. , 1-18 (2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+5-ethynyl-2+%E2%80%B2+-deoxyuridine+staining+as+a+sensitive+and+reliable+method+for+studying+cell+proliferation+in+the+adult+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system.</a> Brain Research. 1319, 21-32 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).</li>
<li>Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Thompson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadd+Agonist+21+%28C21%29+Is+an+Effective+Agonist+for+Muscarnic-Based+Dreadds+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacology+%26+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo.</a> ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo de este protocolo es evaluar cómo la manipulación de circuitos neuronales específicos regula la neurogénesis hipocampal en adultos in vivo utilizando una serie de técnicas de inmunohistoquímica. Decir regulación dependiente de la actividad de la neurogénesis adulta mediada por circuitos neuronales específicos es una técnica valiosa con gran potencial para modificaciones para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, incluyendo la adm...

La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes1. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales específicas, incluyendo el aprendizaje y la memoria, regulación del estado de ánimo, y la respuesta al estrés3 ,4,5,6. Para influir en los comportamientos, los SCN adultos están altamente regulados por varios estímulos externos de una manera dependiente de la actividad respondiendo a una serie de señales químicas locales y distales. Estas señales químicas incluyen neurotransmisores y neuromoduladores y actúan de una manera específica de circuito de varias regiones cerebrales. Es importante destacar que la convergencia de circuito según estas señales químicas en los SCN permite una regulación única y precisa de las decisiones de activación, diferenciación y destino de células madre.
Una de las formas más efectivas de interrogar la regulación del circuito de los NSC adultos in vivo es emparejando el análisis de inmunofluorescencia con manipulaciones de circuitos anchos. El análisis de inmunofluorescencia de los SCN adultos es una técnica comúnmente utilizada, donde los anticuerpos contra marcadores moleculares específicos se utilizan para indicar la etapa de desarrollo de los SCN adultos. Estos marcadores incluyen: nestin como célula de glia radial y marcador de progenitor neural temprano, Tbr2 como marcadorde progenitor intermedio, y dcx como marcador de neurona neuroblast e inmaduro 7. Además, mediante la administración de análogos de timidina como BrdU, CidU, Idu, y Edu, las poblaciones celulares sometidas a la fase S se pueden etiquetar y visualizar individualmente8,9,10. Mediante la combinación de estos dos enfoques, se puede investigar una amplia gama de preguntas que van desde cómo se regula la proliferación en etapas específicas del desarrollo, hasta cómo diversas señales afectan a la diferenciación de nSC y la neurogénesis.
Existen varias opciones para manipular eficazmente los circuitos neuronales, incluyendo la estimulación eléctrica, la optogenética y la quimiogenética, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. La estimulación eléctrica implica una cirugía extensa donde los electrodos se implantan en una región cerebral específica que más tarde se utilizan para transmitir señales eléctricas para modular una región cerebral dirigida. Sin embargo, este enfoque carece de especificidad celular y de circuito. La optogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor activado por luz que es estimulado por un láser emitido a través de una fibra óptica implantada, pero requiere manipulaciones extensas, gran costo y cirugías complejas11. La quimiogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor de diseño activado exclusivamente por fármacos de diseño o DREADD, que posteriormente son activados por un ligando específico y biológicamente inerte conocido como óxido N de clozapina (CNO)12 . La ventaja de utilizar DREADD para manipular circuitos neuronales locales que regulan los SCN adultos radica en la facilidad y varias rutas de administración de CNO. Esto permite un enfoque menos lento con un manejo animal reducido, que es fácilmente adaptable para estudios a largo plazo para modular los circuitos neuronales.
El enfoque descrito en este protocolo es una colección completa de varios protocolos necesarios para interrogar con éxito la regulación del circuito de la neurogénesis del hipocampo adulto que combina tanto técnicas de inmunofluorescencia como manipulaciones de circuitos uso de la quimiogenética. El método descrito en el siguiente protocolo es adecuado para estimular o inhibir uno o varios circuitos simultáneamente in vivo para determinar su función reguladora en la neurogénesis adulta. Este enfoque se utiliza mejor si la pregunta no necesita un alto grado de resolución temporal. Las preguntas que requieren un control temporal preciso de la estimulación/inhibición a una frecuencia determinada, pueden abordarse mejor utilizando optogenética13,14. El enfoque descrito aquí se adapta fácilmente para estudios a largo plazo con un manejo mínimo de animales, especialmente cuando el estrés es una preocupación importante.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 pocillos</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-etinil-2'-desoxiuridina (Edu)</td><td>Carbosynth</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>alcohol 70% isopropílico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de alcohol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Chicken Nestin</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cabra DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>Gato# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón Tbr2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Betadine (povidona yodada)</td><td>Stock de ácido cítrico amazónico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>[.1M] Ácido cítrico (21 g / L de ácido cítrico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clozapina N- Óxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Software Confocal (Zen Black)</td><td>Microscopía Zeiss</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (negro)</td>Sulfato de cobre (II)<td></td></tr><tr><td> Pentahidrato</td><td>Thermo Fisher Scientific AC197722500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Denville Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>Toallita para tareas delicadas Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Broca 0,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Aguja Hamilton 2 pulgadas</td><td>Compañía Hmailton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 5 &mu; L Modelo 75 RN</td><td>Hmailton Referencia de la empresa</td><td>: 87931</td><td></td></tr><tr><td>Taladro de alta velocidad</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de infusión</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina inyectable</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>BD Jeringas de insulina ultrafinas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Estereotax para pequeños animales</td><td>KOPF Instruments Modelo</td><td>942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo Leica</td><td></td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopía</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (Producto de depilación)</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus Portaobjetos cargados</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Opomada</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos 20 unidad de portaobjetos</td><td>Electrónica Microscopía Ciencia</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos Soporte de portaobjetos</td><td>Ciencia de la Microscopía Electrónica</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para animales pequeños</td><td>K& H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pluma punta de 4 mm</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí quirúrgico</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris Solución tamponada (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de citrato trisódico [0,1 M] Citrato trisódico (29,4 g/L citrato trisódico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond Adhesivo para tejidos</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

La neurogénesis adulta es un proceso dinámico mediante el cual las células madre neurales recién activadas (NSC) en la zona subgranular (SGZ) del gyrus dentado (DG) generan nuevas neuronas, que se integran en un circuito neural existente y contribuyen a funciones específicas del hipocampo . Es importante destacar que la neurogénesis adulta es altamente susceptible a los estímulos ambientales, lo que permite la regulación dependiente de la actividad de varias funciones cognitivas. Una amplia gama de circuitos neuronales de varias regiones cerebrales orquesta estas complejas funciones cognitivas. Por lo tanto, es importante entender cómo los circuitos neuronales específicos regulan la neurogénesis adulta. Aquí, describimos un protocolo para manipular la actividad del circuito neural utilizando el receptor de diseño activado exclusivamente por la tecnología de drogas de diseño (DREADD) que regula los NSC y la progenie neonatal en roedores. Este protocolo integral incluye inyección estereotaxcócica de partículas virales, estimulación quimiogenética de circuitos neuronales específicos, administración analógica de timidina, procesamiento de tejidos, etiquetado de inmunofluorescencia, imágenes confocales e imágenes análisis de varias etapas de las células precursoras neuronales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre las técnicas de recuperación de antígenos utilizadas para visualizar los NSC y su progenie y describe una forma simple, pero eficaz de modular los circuitos cerebrales utilizando el óxido N de clozapina (CNO) o el agua potable que contiene CNO y Virus que expresan dREADDs. La fuerza de este protocolo radica en su adaptabilidad para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales que influyen en la neurogénesis adulta derivada de los NSC.

Siguiendo los procedimientos experimentales descritos anteriormente (Figura1A,B), pudimos determinar los efectos de estimular las proyecciones celulares musgosas contralaterales en el nicho neurogénico dentro del hipocampo. Mediante la utilización de un virus DREADD estimulante dependiente de Cre-dependiente gq emparejado con un etiquetado de células musgosas 5-HT2A Cre-line, pudimos activar selectivamente proyecciones excitatorias de células musgosas en la DG contralateral ...

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Este protocolo puede responder cómo varios circuitos en el cerebro regulan la neurogénesis adulta y específicamente cómo estimular o inhibir los circuitos neuronales afectan la proliferación de células madre neurales adultas. La ventaja de esta técnica es que es capaz de apuntar específicamente a los circuitos neuronales deseados, así como reducir la cantidad de estrés introducido a los animales. Este método puede proporcionar información sobre cómo diferentes circuitos cerebrales regulan la neurogénesis adulta, en particular, cómo los tipos de células específicas que liberan ciertos neurotransmisores regulan la proliferación de células madre neurales adultas.Para comenzar este procedimiento, coloque las secciones de tejido en PBS y monte de cinco a ocho secciones en una diapositiva cargada positivamente en orden de serie de anterior a posterior. Deje que las secciones del tejido se sequen a temperatura ambiente durante dos a cinco minutos y se adhieran completamente a los portaobjetos. A continuación, prepare el búfer de citrato en un contenedor.Caliente el tampón de citrato en un horno microondas durante cinco minutos hasta que la solución esté hirviendo. Mientras tanto, coloque

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

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Neurociencia

Las células madre neurales se prepararon desde el hipocampo de los adultos no hibernan las ardillas de tierra del Ártico año de edad (AGS). Estas células madre neurales se puede ampliar a través de numerosos pasajes, diferenciados y se mantiene como una neurona cerca de 50:50 a la cultura gliales.

Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

Este video muestra el procedimiento para teñir células madre neurales recién proliferadas en secciones de tejido cerebral utilizando la incorporación de EdU, seguido de inmunofluorescencia para visualizar proteínas específicas, mejorando la comprensión de la dinámica celular y la proliferación.

Tinción de inmunofluorescencia para la visualización de células madre neurales proliferadas en secciones de cerebro de ratón

Durante la neurogénesis del hipocampo adulto, un conjunto distinto de marcadores genéticos se expresan cuando un reposo neuronal secuencial de células madre progresa y se desarrolla en una neurona funcionalmente integrado en el circuito. El uso de la recuperación de antígeno inducida por calor, tipos de células progenitoras que son de otro modo difíciles de detectar se identifican con una eficacia mejorada.

Heat-inducida por antígenos de recuperación: un método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante la neurogénesis del hipocampo adulto

Aquí se describe un protocolo detallado para la generación simultánea de cultivos de células precursoras neurales, ya sea como monocapas o neuroesferas adherentes, de la zona subventricular y giro dentado de ratones adultos individuales.

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

Aquí presentamos un protocolo que proporciona una herramienta para examinar los mecanismos reguladores de genes específicos durante el desarrollo del hipocampo. El empleo de la electroporación ex útero y el cultivo de cortes organotípicos permite la regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de genes de interés en células individuales y seguir su destino durante el desarrollo.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Reportamos un método basado en la Clasificación de Células Activadas Fluorescentes (FACS) para aislar células madre neurales (NSCs) y su progenie de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratón adulto. Aplicado a ratones transgénicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite el estudio de la progresión del ciclo celular mediante imágenes en vivo.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

El cerebro canino es un modelo valioso en el que estudiar la neurogénesis adulta. Aquí se presentan son los protocolos para aislar y amplificar las células adultas caninos hipocampo precursoras neurales a partir de tejido cerebral primario.

El aislamiento y la expansión de los adultos canina hipocampo neuronales Precursores

La disección crioseccional permite la preparación fresca y congelada del nicho neurogénico más grande en el cerebro murino para un análisis profundo del proteoma cuantitativo. El método es preciso, eficiente y causa una perturbación tisular mínima. Por lo tanto, es ideal para estudiar el microambiente molecular de este nicho, así como otros órganos, regiones y especies.

Disección crioseccional de la zona subependimaria adulta para un análisis cuantitativo preciso y profundo del proteoma

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Aprende a analizar la proliferación de células madre neuronales adultas mediante manipulación quimio-genética de circuitos específicos. Este método permite evaluar el impacto de la actividad local en la neurogénesis con precisión.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

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