Name: Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende el ensayo SWIP para evaluar la señalización dopaminérgica en Caenorhabditis elegans. Este método permite identificar genes relacionados con la sinapsis dopaminérgica y estudiar los efectos del exceso de dopamina extracelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer el Dr. Osama Refai del laboratorio del Dr. Randy Blakely de orientación con el análisis automatizado de SWIP. Este trabajo fue apoyado por fondos del NIH R01 DA042156 LC.

1. preparación de soluciones y medios de comunicación
<ol><li>Preparación de buffer M9 por disolución de KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) y NaCl 5.0 g (85,5 mM) en 1 L de agua desionizada en autoclave. Añadir 1,0 mL de 1 M MgSO4 (12 g en un volumen final de 100 mL de agua desionizada en autoclave) después de la esterilización en autoclave. Mezcla 100 mL de la resultante x 10 M9 con 900 mL de autoclave desionizada para hacer una solución de 1 x.</li>
	<li>Para hacer el tampón de huevo, disolver 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g de MgCl2-6 H2O (2 mM) y 5,958 g (25 mM) de HEPES en 1 L de agua desionizada en autoclave. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH.</li>
	<li>Preparar solución fresca hipoclorito de sodio/NaOH añadiendo 1 mL de 5-6% hipoclorito sódico (lejía) y 180 μl de NaOH N 10 a 3,8 mL de agua desionizada.</li>
	<li>Peso sacarosa 60 g y disolver en agua desionizada en autoclave hasta un volumen final de 100 mL solución de sacarosa 60%.</li>
	<li>Disolver 0,684 g de sacarosa en 10 mL de agua desionizada en autoclave para hacer sacarosa 200 mM. Comprobar y ajustar a la misma una osmolaridad con osmómetro. Alícuotas de 1 mL en 1.5 mL tubos de microcentrífuga y congelar a-20 ° C.</li>
	<li>Pesar, 0,184 g de AMPH (peso molecular 184.75 g/mol) y disolver en 10 mL de agua desionizada para hacer una solución stock de 100 mM. Mezcle 2 μl de la solución madre en 400 μL de agua para hacer la solución de trabajo de 0.5 milímetros.</li>
	<li>
Preparar nutrientes crecimiento las placas de los medios de comunicación (NGM)
	<ol>
<li>Mezclar 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptona, 25 g de bacto-agar y 975 mL de agua desionizada en un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Incluyen una barra de agitación magnética y autoclave (121 ° C, 15 PSI) durante 1 hora con ciclo de líquidos.</li>
		<li>Enfriar y mantener la temperatura a unos 50 º C colocando el matraz en una estufa mientras revuelve. Agregar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol) 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2 y 25 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 7.4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g de K2HPO4 agua a 1 L).</li>
		<li>Pipetear 25 mL en placas de Petri 100 x 15 mm y permitir que los medios de comunicación que se solidifique. Almacenar las placas boca abajo a 4 ° C en una caja hasta por 4 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de caldo de lisogenia (LB)
	<ol>
<li>Disolver 5 g de mezcla de polvo LB en 200 mL de agua desionizada en un matraz Erlenmeyer. Ciclo de autoclave durante 30 minutos utilizando la esterilización de líquidos. Deje que el caldo se enfríe. Almacenar a temperatura ambiente durante 1-2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de placas bacterianas NA22
	<ol>
<li>Utilizar una pipeta estéril o un bucle bacteriano estéril a raya una placa LB con un pequeño volumen de NA22 e. coli bacteria de la acción de glicerol e Incube la placa boca abajo en una incubadora de 37 ° C durante la noche para hacer crecer colonias aisladas. Recoger e introducir una sola Colonia de 200 mL de LB caldo preparado en el paso 1.8 y dejar crecer durante la noche a 37 ° C sobre una plataforma de agitación.</li>
		<li>Para las placas de la semilla, dispensar 200 μL de cultivo bacteriano en las placas NGM preparado anteriormente en el paso 1.7 y extender con un palo de hockey de vidrio estéril. Deje las placas secar durante la noche o ya bajo una campana y guardar boca abajo en una caja hermética a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para hacer que la herramienta de pestañas/platino para recoger gusanos, pegar una pestaña gruesa o un filamento de platino en un vaso de Pasteur pipeta usando pegamento. Corta la punta de la pestaña en un ángulo con una cuchilla de afeitar. Alternativamente, puede utilizarse un quemador Bunsen para derretir la punta de la pipeta de vidrio alrededor del filamento de platino.</li>
</ol>2. cría de C. elegans
Nota: Cultura de tipo salvaje N2C. elegans cepa de Escherichia coli NA22 placas. A continuación se describen los métodos de toda cultura
<ol><li>
Preparación de cultivo de gusano
	<ol>
<li>Para hacer una cultura de arrancador de gusanos, cortar un pequeño trozo de agar de una placa que contiene animales bien alimentados y transferirlo sobre una placa de bacterias NA22 e. coli preparada en el paso 1.9 con una espátula estéril. Incubar las placas a 20 ° C durante 3-4 días. Microscopio estéreo, confirmar visualmente la presencia de adultos grávidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de población sincronizada de gusanos
	<ol>
<li>Recoger a adultos grávidos de al menos 2 placas por agua desionizada esterilizado alrededor de la placa con una botella de squirt. Agitar suavemente la placa para desalojar a los gusanos y recoger los gusanos en un tubo cónico de 15 mL poliestireno, utilizando una pipeta de plástico desechable.</li>
		<li>Girar hacia abajo el tubo de la centrífuga a 140 x g durante 2 min para los gusanos de la pelotilla, y luego aspirar apagado sobrenadante usando una bomba de vacío o con construido en vacío de laboratorio.</li>
		<li>Resuspender y lavado los gusanos llenando el tubo con agua desionizada esterilizado y mezcle y centrifugue a 140 x g durante 2 minutos, aspiración el sobrenadante y repetición este último paso dos veces más o hasta que los gusanos son claros de bacterias (agua aparece claro cuando se mezclan con los gusanos).</li>
		<li>Añadir 5 mL de solución de hipoclorito sódico recién hechas/NaOH (paso 1.3) a la pelotilla de gusano y rápidamente mezclar con un vórtex. Incubar el tubo en un eje de balancín para unos 4-8 minutos. El tiempo de incubación con solución de hipoclorito de sodio/NaOH oscila entre 4-8 minutos basadas en la calidad de la solución stock de hipoclorito sódico (lejía).</li>
		<li>Poner una gota (2-50 μL) de solución que contiene gusanos en un portaobjeto de microscopio y comprobar cada 2 min bajo el microscopio para lisis de gusano. Cuando alrededor del 70% de los gusanos son lisis y se liberan huevos, llenar el tubo con tampón de huevo preparado en el paso 1.2 y centrifugar inmediatamente durante 1 min a x 140 g a los embriones de la pelotilla y gusano de cadáveres.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces más llenando cada vez que el tubo con tampón de huevo. Desactivación a 140 x g durante 1 minuto y retire el sobrenadante de cada vez. El pellet se pone blanco al final del lavado.</li>
		<li>Después del último lavado, separar los embriones de las reses muertas en solución de sacarosa al 30%. Añadir 5 mL de agua desionizada en autoclave a la pelotilla, resuspender y añadir 5 mL de sacarosa al 60% preparado en el paso 1.4. Mezcle bien y centrifugue a x 160 g durante 6 minutos.</li>
		<li>Utilizar un pipeta Pasteur de vidrio para transferir los embriones flotando en el menisco superior en un tubo cónico de 15 mL fresco. No tome más de 3-4 mL. Para eliminar cualquier resto de sacarosa, lavar los embriones 3 veces con agua esterilizada por centrifugación a 140 x g durante 3 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender el pellet (y el tubo de aspiración) cada vez.</li>
		<li>Repetir los lavados con tampón de x M9 1. Después del último lavado, Resuspender el precipitado en 10 mL de M9. Dejar los tubos en un agitador durante la noche (no más de 14 h) para que los huevos que eclosionan en larvas L1. Gusanos se mantendrá en fase larvaria L1 debido a la falta de alimentos.</li>
		<li>Las larvas de la colada de la L1 3 veces con agua esterilizada para quitar cualquier pheromones lanzados por las larvas por centrifugación a 140 x g durante 2 minutos resuspender las larvas en 1 mL de agua. Hacer un 1:10 dilución de los gusanos en el agua, pipeta una gota de 10 μL en un portaobjeto, ponerse un cubreobjetos y contar el número de gusanos bajo un estereoscopio. Repetir esto dos veces y media los resultados.</li>
		<li>Pipeta el volumen de lombrices que corresponde a unos 1.000 gusanos sobre una placa de NA22 (que fue previamente llevado a temperatura ambiente) mediante la colocación de pequeñas gotas en la placa. Deje la placa entreabierta hasta que la gota se seca. Luego cubrir la placa e incubar invertida en 20 ° C la incubadora por unos 44-48 h o hasta que los gusanos alcanzan L4 tardía, según lo confirmado visualmente bajo un estereomicroscopio. Ahora los gusanos están listos para ser probado para SWIP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SWIP
Nota: Describimos el método manual de evaluación de SWIP en gusanos del tipo salvaje tratados con AMPH. Discutimos también brevemente el seguimiento de los gusanos y posterior análisis de la cinética del gusano utilizando un rastreador de gusano automatizados y un software de seguimiento que fueron descritos anteriormente por Hardaway et al10.
<ol><li>
Método manual para probar SWIP
	<ol>
<li>Alícuota de 40 μl de solución de sacarosa de 200 mOsm/L con o sin AMPH de 0,5 mM en una placa de cristal de punto. Bajo el estereoscopio, 8-10 finales L4 etapa gusanos con una pestaña o platino pick y sumerge el pico en la placa que contiene la solución hasta gusanos mover de lo pick y nadan en la solución. Tenga en cuenta el número de gusanos recogidos en el pozo, iniciar el temporizador, observar y registrar el número de gusanos exponiendo SWIP en cada minuto marca.</li>
		<li>Copiar los datos en bruto en una hoja de cálculo y calcular el porcentaje de gusanos paralizados dividiendo el número de gusanos paralizados a cada minuto por número total de gusanos probados en el ensayo y multiplicar por 100. Copiar los valores de porcentaje en cualquier representación gráfica y formato de los datos con valores de porcentaje en el eje Y y tiempo en el eje mediante el gráfico XY X parcela y software estadístico.</li>
		<li>Realizar el ANOVA dos vías, seguido de análisis post-hoc (por ejemplo, post-test de Bonferroni) para probar para la significación estadística entre control, AMPH grupos y tiempo de tratamiento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis automatizado de SWIP
	<ol>
<li>Realizar análisis automatizado en un solo gusano en un momento. El protocolo establecido por la cámara, el gusano tracker software y script para ejecutar el software de seguimiento análisis se describen en detalle en Hardaway et al16.</li>
		<li>Brevemente, coloque a solo finales L4 etapa hermafrodita en una placa de vidrio punto utilizando una selección de la pestaña, como se describe en el método manual en la sección 3.1.2. Grabar videos de natación de un gusano en el tiempo y utilizar el software de tracker de gusano para calcular la frecuencia de curvas del cuerpo.</li>
		<li>Siga la secuencia de comandos proporcionada con el software de seguimiento para obtener gusano golpear frecuencia y para generar mapas de calor de los datos de la paliza de gusano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li>
<li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Transporter%2FSyntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).</li>
<li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li>
<li>Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRefai%2C+O+%22Neurochemistry+International%22">Neurochemistry International</a>. , (2018).</li>
<li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13%2FERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li>
<li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li>
<li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).</li>
<li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li>
<li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li>
<li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li>
<li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+%2F+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li>
<li>Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li>
<li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+%28TSP-17%29+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).</li>
<li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo paso a paso para realizar un ensayo conductual, SWIP, en C. elegans. Este protocolo es sencillo con no vallas técnicas principales hacer este usuario de ensayo muy amigable. Sin embargo, existen algunos aspectos críticos que deben considerarse para efectivamente llevar a cabo el ensayo.
Debe tenerse cuidado para asegurar que los gusanos que se utiliza para el análisis son bien alimentados, ya que afecta la restricción dietética SWIP17</...

Los animales realizan una variedad de comportamientos innatos y complejas que están mediadas por diferentes neurotransmisores coordinados por intrincados procesos de señalización. El neurotransmisor dopamina (DA) media comportamientos altamente conservados entre especies, incluyendo el aprendizaje, la función motora y procesamiento de la recompensa.
C. elegans, los nematodos del suelo con un sistema nervioso relativamente simple y bien asignado, que consta de sólo 302 neuronas, muestra comportamientos notablemente complejos, incluyendo muchos que son reguladas por DA como acoplamiento, aprendizaje, alimentación, locomoción y puesta de huevos 1. entre otras características, ciclo de vida corto, facilidad de manejo y la conservación de moléculas señalizadoras, destacar las ventajas del uso de C. elegans como modelo para estudiar la base neural de conductas conservadas.
El hermafrodita C. elegans contiene ocho neuronas dopaminérgicas; Además de éstos, el hombre contiene seis pares extras para fines de apareamiento. Como en mamíferos, estas neuronas sintetizan DA y expresan el DA transportador (DAT-1), una proteína de membrana que se encuentra exclusivamente en las neuronas dopaminérgicas, que transporta DA liberada en la hendidura sináptica en las neuronas dopaminérgicas. Además, la mayoría de las proteínas implicadas en cada paso de la síntesis, empaque y liberación de DA está muy conservada entre los gusanos y los seres humanos y, como en los mamíferos DA modula la alimentación comportamientos y locomoción en C. elegans2.
C. elegans se arrastra en las superficies sólidas y nada con un comportamiento característico de golpear en el agua. Curiosamente, mutantes que carecen de expresión del DAT-1 (dat-1) gatear normalmente sobre una superficie sólida pero incapaces de sostener la natación cuando sumergido en el agua. Este comportamiento se denomina natación inducida por parálisis o SWIP. Experimentos anteriores demostraron que SWIP, en parte, es causada por un exceso de DA en la hendidura sináptica que en última instancia estimula los receptores postsinápticos D2-like (DOP-3). Aunque originalmente identificado en el dat-1 nocaut animales3, SWIP también se observa en animales de tipo silvestre tratados con fármacos que bloquean la actividad de DAT (p. ej., imipramina4) o inducir la liberación de DA (p. ej., anfetamina,5). Por otro lado, manipulaciones farmacológicas o genéticas evitando la síntesis y liberación de DA y el bloqueo de función de receptor DOP-3 previenen SWIP6. Tomados en conjunto, estos datos ya publicados han establecido SWIP como herramienta fiable para estudiar los efectos conductuales causados por las proteínas mutadas en dopaminérgicos sinapsis3,4,7 y ser empleado para adelante pantallas genéticas para la identificación de nuevos vías reguladoras implicadas en DA señalización7,8,9,10,11,12. Además, al proporcionar una lectura fácilmente cuantificable del comportamiento droga-inducida en animales vivos, SWIP permite la elucidación de mecanismos de acción de drogas como la anfetamina (AMPH) y azaperone en el dopaminérgico sinapsis5, 6 , 13 , 14 , 15.
Se han descrito protocolos para realizar los ensayos SWIP antes16. Aquí, describimos en detalle la metodología y la instalación para realizar el ensayo con el objetivo de proporcionar a una guía visual para la comunidad de C. elegans para efectivamente realizar SWIP.

<table><tbody><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Reynolds wrap</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>Amphetamine</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora bacteriana de autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick scientific</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>Grado bacteriológico, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Peptona</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (dihidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Camera&nbsp;</td><td>Centrífuga Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q Placa puntual de</td></tr><tr><td>vidrio para depresión</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>Pestañas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Software gráfico y estadístico</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito</td><td>Hawkins</td><td>Hipoclorito de sodio 4-6%, USP" Caldo LB de 1 galón</td><td></td></tr><tr><td>, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (hexahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (heptahidratado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 bacterias</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Modelo 3320</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetas</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplacas</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de polistrina</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio - DIBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio - MONOBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>10ml=89130-898</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agitador Reliable Scientific</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrógeno de sodio Fosfato</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de cálculo</td><td>MS office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Modelo tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta estériles</td><td>Varios</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>1647358 .14 onzas</td><td></td></tr><tr><td>SwimR sofware</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>Software de grabación de vídeo</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

El ensayo de natación se describe en este protocolo es una herramienta válida para identificar proteínas regulan el dopaminérgico sinapsis. Similar a los mamíferos, dopamina (DA) controla varias funciones en C. elegans como actividad de aprendizaje y motor. Condiciones que estimulan la liberación de DA (p. ej., tratamientos de anfetamina (AMPH)) o que evitar separación de DA (por ejemplo, animales que carecen del transportador de DA (dat-1) que son incapaces de reaccumulating DA en las neuronas) generan un exceso de DA extracelular en última instancia dando por resultado locomoción inhibido. Este comportamiento es particularmente evidente cuando los animales nadan en el agua. De hecho, mientras animales de tipo silvestre a nadar durante un largo período, mutantes nulos dat-1 y tipo salvaje trataron con AMPH o inhibidores del transportador de DA se hunden hasta el fondo del pozo y no se mueven. Este comportamiento se denomina "Parálisis inducida de natación" (SWIP). Aunque está bien establecido el ensayo SWIP, carece de una descripción detallada del método. Aquí, describimos una guía paso a paso para realizar SWIP. Para realizar el ensayo, último larvales etapa 4 animales se colocan en una placa de punto de cristal que contiene control de solución de sacarosa con o sin AMPH. Animales son marcados por su comportamiento de natación ya sea manualmente por visualización bajo un estereoscopio o automáticamente por la grabación con una cámara montada en el estereoscopio. Videos entonces se analizan utilizando un software de seguimiento, que produce una representación visual de frecuencia de golpear y de parálisis en forma de mapas de calor. Los sistemas manuales y automatizados garantizan una lectura fácilmente cuantificable de la capacidad de natación de los animales y facilitan así la detección de animales con mutaciones en el sistema dopaminérgico o para genes auxiliares. Además, SWIP puede utilizarse para aclarar el mecanismo de acción de drogas de abuso como AMPH.

Presentamos un ejemplo de ensayo SWIP inducida por tratamiento AMPH. La figura 1 muestra una representación esquemática de la configuración del ensayo como se describe anteriormente. Para el análisis manual, sobre 8-10 edad sincronizado finales L4 etapa gusanos recogidos con una pestaña o platino escoger y colocar en una placa de punto de vidrio lleno con 40 μl de 200 mOsm/L sacarosa (solución de control) o sacarosa con 0.5 mM AMPH y probados para SWIP.
<...

Natación por parálisis (SWIP) es un ensayo de comportamiento bien establecido utilizado para estudiar los mecanismos subyacentes de la dopamina en Caenorhabditis elegans (C. elegans). Sin embargo, carece de un método detallado para llevar a cabo el ensayo. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para SWIP.

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar parálisis inducida por la natación o SWIP, un ensayo conductual para evaluar la señalización de dopamina en C.elegans. SWIP permite la identificación rápida de genes dentro o relacionados con la sinapsis dopaminérgica. Este método permite la investigación de los efectos producidos por un exceso de dopamina extracelular que es causada por ejemplo por fármacos o por mutaciones en el transportador de dopamina.Para garantizar que todos los gusanos analizados durante el ensayo naden durante la misma cantidad de tiempo, los animales deben ser transferidos rápidamente a la solución. Demostrando el procedimiento serán Sirisha Kudumala y Serene Sossi. Ambos trabajan en mi laboratorio.Para configurar cultivos de arranque de gusanos, utilice una espátula estéril para cortar pequeños trozos de agar de un plato que contenga C.elegans bien alimentados y transfiera las piezas de agar a placas individuales de NA22 E.coli. Después de incubar las placas a 20 grados celsius durante tres a cuatro días, confirme visualmente la presencia de adultos gravid bajo un microscopio estéreo. Para obtener una población sincronizada de gusanos, chorro de agua

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Este video muestra cómo utilizar C. elegans para evaluar la neurodegeneración nerviosas dopaminérgicas como un modelo para la enfermedad de Parkinson. Además, las pantallas de genética se utilizan para definir los factores que mejoran la degeneración o neuroprotectoras.

Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Este video muestra cómo utilizar dos estimulantes neural, aldicarb y pentilentetrazol (PTZ), de manera complementaria para estudiar la función sináptica en el nematodo C. elegans. Con este enfoque complementario también puede ser utilizado para arrojar luz sobre los mecanismos conservado evolutivamente de sincronía neuronal modular y tiene implicaciones para la epilepsia y las convulsiones.

Paradigmas para la caracterización farmacológica de C. elegans mutantes transmisión sináptica

En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aquí, presentamos un ensayo para medir el SWIP, un fenotipo de comportamiento de C. elegans que ocurre durante un movimiento vigoroso como la natación. El protocolo de ejemplo analiza los enfoques de análisis manuales y automatizados.

Ensayo de parálisis inducida por la natación (SWIP): un método para cuantificar la locomoción mediada por dopamina en C. elegans

Este video demuestra el uso de un ensayo de locomoción radial para evaluar la disfunción motora en C. elegans que expresan la proteína TDP-43 humana de tipo salvaje o mutante en ELA. Los gusanos con niveles variables de expresión de TDP-43 de tipo salvaje o mutante pueden arrastrarse, y su movimiento se mide por la distancia radial recorrida desde el punto central de la placa de ensayo. El ensayo distingue entre deficiencias motoras leves, moderadas y graves en función de la distancia recorrida...

Evaluación de la discapacidad motora en modelos de C. elegans mediante el ensayo de locomoción radial

Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda...

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Se describe una metodología eficiente y simple para el análisis computarizado de comportamiento natatorio nematodos en líquido. El método requiere poca o ninguna inversión para C. elegans laboratorios. El hardware utilizado es estándar, y los programas de ordenador para el análisis del comportamiento (Celeste) es un código abierto uno.

El análisis automatizado de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamiento de la nadada El uso de software Célest

Este protocolo describe dos ensayos sensibles para discriminar entre deterioro motor leve, moderado y grave en modelos de esclerosis lateral amiotrófica de C. elegans , con utilidad general para cepas de C. elegans , con motilidad alterada.

Evaluación del deterioro motor en modelos de C. elegans de esclerosis lateral amiotrófica

En este artículo, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar consistentemente los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Este sistema está destinado a análisis de ensayos de neurodegeneración dopaminérgica utilizando modelos genéticos, químicos y basados en la edad de trastornos neurodegenerativos.

Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans

El presente protocolo describe un ensayo para determinar la respuesta al levamisol, un agonista farmacológico de una clase de receptores de acetilcolina de Caenorhabditis elegans . En este ensayo de natación de levamisol líquido, los investigadores observan visualmente y cuantifican la parálisis dependiente del tiempo de los animales cultivados en placas de 24 pocillos.

Medición de la sensibilidad de Caenorhabditis elegans al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol

Este protocolo detalla un ensayo cuantitativo de defecación en el joven mutante RAC1/ CED-10 Caenorhabditis elegans, proporcionando un modelo sencillo para estudiar los estadios de la enfermedad prodrómica de Parkinson. Supera las limitaciones de otros modelos animales y facilita la prueba de estrategias terapéuticas dirigidas a la patología parkinsoniana temprana.

Evaluación de la motilidad gastrointestinal en mutantes de Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 como herramienta para estudiar la enfermedad de Parkinson en los primeros años

Aprende el ensayo SWIP para evaluar la señalización dopaminérgica en Caenorhabditis elegans. Este método permite identificar genes relacionados con la sinapsis dopaminérgica y estudiar los efectos del exceso de dopamina extracelular.

Natación parálisis inducida a evaluar dopamina señalización en Caenorhabditis elegans

Explorar más videos