Método de preparación de muestras de microscopio electrónico de escaneo y transmisión para los apéndices del escarabajo carpintero

Escarabajo tallado en madera su superficie corporal son siempre duros en SEM. El Tween-20 se añade a la solución fijativa y de lavado. La superficie corporal del escarabajo tallador de madera En TEM, el Tween-20 puede mejorar la penetración fijativa en la pared del cuerpo y fijar mejor el tejido y el órgano en el cuerpo.

El microscopio de fluorescencia es útil para mejorar la precisión del corte. La técnica es útil para lavar la superficie del cuerpo y penetrar en la pared del cuerpo en el escarabajo tallado en madera. Por lo tanto, borraría la visión SEM y TEM.

El microscopio de fluorescencia es útil para mejorar la precisión del corte en TEM. Demostrar el procedimiento estará Zhang Yanru, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. En un área donde Chlorophorus caragana vive, coloque trampas de campo cebadas con atractores de plantas como la isoforona en una trampa de embudo.

Atrae a los adultos escarabajos tallados en madera a las trampas. Conservar los cuerpos limpios de Chlorophorus caragana adulto en 0,1 mole por litro PBS a pH 7,2, 2,5% de peso en volumen de glutaraldehído y 0,06% de volumen por volumen Tween-20. Fije la muestra a cuatro grados centígrados durante tres días.

Retire los cuerpos del líquido de conservación y enjuague en PBS. Bajo un microscopio estéreo, utilice fórceps para eliminar los apéndices y limpiarlos por ultrasonidos a 40 kilohercios en PBST. Después de limpiar durante 100 segundos, transfiera la muestra al microscopio para comprobar si está limpia.

No limpie durante más de 400 segundos para evitar daños. A continuación, sumerja las muestras en etanol a una serie de concentraciones durante 20 minutos cada una para realizar la deshidratación. Después de la deshidratación, bajo un microscopio estéreo, utilice cinta adhesiva de doble cara de carbono para fijar por separado tres superficies de observación, dorsal, ventral y lateral, en los talones.

Asegúrese de que todas las superficies de visualización estén limpias y libres de contaminación. Coloque la etapa de muestra en un plato de Petri que contenga un desecante de gel de sílice durante 48 horas. A continuación, en un instrumento de pulverización iónico, gire la válvula principal a la posición abierta, retire la cubierta de la cámara de muestra y coloque la muestra en la cámara.

Encienda el interruptor de encendido y asegúrese de que la luz esté encendida. Ajuste el tiempo de pulverización como 45 segundos y el espesor del recubrimiento como 70.875 angstrom. Una vez que el índice de dial de vacío de la bomba mecánica cae por debajo de siete, presione la descarga y comience a rociar platino.

Al final del procedimiento, apague la fuente de alimentación y saque la muestra de la cámara. Calcular el espesor de la película de pulverización D en angstrom igualando K por I por V por T.K es una constante determinada por el metal y el gas pulverizados. I es el flujo de plasma en miliamperios mientras que V es el voltaje aplicado en kilovoltios y T es el tiempo en segundos.

Inserte el código auxiliar que contiene la muestra en el escenario del SEM. Asegúrese de que la etapa de muestra con el talón de muestra tenga suficiente altura para permitir una buena imagen. Abra el software SEM y seleccione la tensión de funcionamiento deseada a partir de 20 kilovoltas.

Después de obtener los apéndices de Chlorophorus caragana adulto, lave las muestras en PBST en un baño ultrasónico durante tres horas y luego después de fijarlas en 1% peso en volumen de tetróxido de osmio en PBS durante una hora a 25 grados Celsius. Deshidratar las muestras utilizando tratamientos sucesivos de 20 minutos en 50%60%70%80%85%90%95%100% y 100% volumen por volumen etanol a temperatura ambiente. Con fórceps, aplique resina calentada en un molde de incrustación plana e incruste las muestras en la resina.

Asegúrese de que la muestra esté en la parte inferior de la placa y colocada lo más cerca posible del borde de la ranura empotrada. Etiquetar y luego incubar la placa que contiene la muestra a 60 grados centígrados durante 72 horas. Después de la incubación, retire la placa de la incubadora y verifique que la resina se ha polimerizado.

Una vez que la muestra se haya solidificado, coloque cada bloque de resina bajo un microscopio de fluorescencia, mueva la fuente de luz fluorescente del microscopio para irradiar la muestra con luz azul desde arriba y fotografiarla. Asegúrese de que la sensilla del bloque de resina sea claramente visible. Mida la distancia entre el borde del bloque de resina y el sensor de destino para apuntar a la sensilla.

Consulte la imagen SEM de los palp y corte aproximadamente el bloque de resina con una cuchilla de afeitar cerca del receptor objetivo. A continuación, bajo una microscopía de fluorescencia de luz azul, ajuste la fuente de luz desde arriba para que la sensilla se observe claramente. Agregue el micrómetro objetivo a la etapa del microscopio de fluorescencia.

Fotografiar el bloque de resina cortado aproximadamente y luego usando ImageJ medir la distancia entre el objetivo y el borde de la resina. Coloque la muestra de resina sobre un ultramicrotoma y corte secciones gruesas de 50 a 60 nanómetros hasta que se haya alcanzado la posición objetivo. Monte las secciones en rejillas de cobre de malla 100 recubiertas de formvar en platos Petri.

Manche las rejillas con una solución filtrada saturada de acetato de uranilo a temperatura ambiente. Cubra las secciones durante la tinción para bloquear los precipitados inducidos por la luz. Mancha durante 10 minutos.

En una campana de humo, enjuague dos veces en 50%metanol, luego dos veces en agua desgasificación filtrada. Coloque gotas de mancha de citrato de plomo preparada en los cuadrados de los platos de plástico Petri y déjelos reposar durante ocho minutos. Enjuagar en agua filtrada desgasificación y secar.

Monte las rejillas en una etapa de muestra dentro de la máquina TEM. Ajuste la tensión a 80 kilovoltas y examine las secciones. En este protocolo, utilizando la solución de limpieza y fijación con Tween-20, se observó una imagen SEM clara que la que no tenía Tween-20.

Con la solución de fijación Tween-20 que permite que la solución de fijación de glutaraldehído penetre en el tejido, las estructuras de microtúbulos se vieron claramente en la imagen TEM, mientras que la estructura interna de la muestra preparada sin Tween-20 era borrosa. Las vistas transversales continuas de la clavija del tipo una sensatez twig basiconica en los palps maxilares mostraron que la vaina dendrítica rodeaba los segmentos dendríticos exteriores y se extendía hasta el poro de la punta. Siete segmentos dendríticos externos no ramificados existían dentro de la cavidad linfática del receptor interno que estaba rodeada por una cavidad externa.

El cuerpo tubular estaba separado por una vaina dendrítica de otros segmentos dendríticos externos en cada base de zócalo sensilar. En la región ciliar, se identificaron ocho dendritas de diferentes diámetros que indican la presencia de ocho neuronas bipolares. La técnica se puede utilizar para estudiar más a fondo la función de los nervios como la grabación de una sola célula o la hibridación in situ.